Procedura per Decellularization di Rat Livers in un dispositivo di perfusione oscillante pressione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare il ruolo della radice di perfusione nell'ottimizzare l'omogeneità della decellularizzazione della perfusione epatica di ratto. Ciò si ottiene incannulando prima le vene portatrici e le arterie epatiche di fegati di ratto appena isolati. In una seconda fase, i fegati vengono collegati a un dispositivo di perfusione per la perfusione selettiva delle vene porta o delle arterie epatiche.

Successivamente, le variazioni di pressione oscillanti vengono applicate alla camera di perfusione per imitare le variazioni di pressione intraaddominale che si verificano durante la respirazione. Ottimizzando la microperfusione epatica, in ultima analisi, i fegati perfusi attraverso l'arteria epatica in condizioni di pressione oscillante mostrano una decellularizzazione più omogenea e più rapida come valutato dall'osservazione macroscopica e dall'analisi istologica e biochimica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la decellularizzazione della perfusione venosa portale è che la perfusione arteriosa utilizzando condizioni di pressione oscillante porta a un risultato di decellularizzazione più omogeneo.

In un tempo più breve, tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulle tecniche di decelerazione. Può essere applicato anche ad altri sistemi come esperimenti di solarizzazione, configurazioni di perfusione extraorale e modelli di organi. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché il prelievo e l'incannulamento arterioso del fegato rosso possono essere complicati.

Prima di prelevare il fegato, eseguire un taglio obliquo all'estremità di un pezzo di 1,5 centimetri di un catetere venoso periferico G 20. Collegare il catetere a un rubinetto di arresto a tre vie e utilizzare una siringa da 10 millilitri riempita con soluzione di suoneria per arieggiare il sistema. Quindi, taglia l'ago di una cannula a farfalla a una lunghezza di cinque millimetri e usa la super colla per fissare un tubo di cinque centimetri all'ago.

Inserisci un tubo lungo due centimetri nel tubo più grande e fissa anche questo tubo con la super colla. Infilare un altro tubo su questa costruzione e incollarlo in posizione per creare un moncone. Quindi utilizzare una siringa da cinque millilitri riempita con soluzione di suoneria per decare la cannula arteriosa di nuova costruzione per riparare il fegato per il raccolto.

Inizia usando una benda per cause umide per tenere i lobi epatici mediali e sinistri di un ratto adulto anestetizzato sotto la cupola del diaframma. Esporre anche il legamento epato-duodenale e il lobo epatico superiore in questo momento. Quindi, usa due micro pinze e forbici a molla per sezionare con cura il legamento attaccato al lobo omentale superiore fino a quando il lobo non è mobile.

Quindi tenendo in posizione i lobi mediale e sinistro. Usa tamponi di cotone bagnati per spostare il lobo sotto l'impacco del GRE e lo stomaco a sinistra dell'animale. Fissa lo stomaco con una pinza e seziona il piccolo slancio.

Quindi sezionare il lobo epatico inferiore o mentale fino a quando non è mobile e spostare il lobo di nuovo nella sua cavità usando un morsetto posteriore per trattenere il duodeno, spostare il duodeno a sinistra per esporre il legamento duodenale dell'herpa. Circoscrivere il dotto biliare comune. Quindi sezionare il dotto biliare dal tessuto adiposo e pancreatico, tagliando il dotto a 1,5 centimetri dalla biforcazione del dotto biliare.

Sezionare la vena sale dal tessuto adiposo circostante, esponendo la vena gastroduodenale. Quindi legare due volte la vena gastroduodenale con sei punti di sutura zero e dividere la vena tra i due nodi. Sezionare il tronco celiaco e l'arteria epatica comune dal tessuto circostante fino a rivelare tutta la ramia arteriosa.

Dopo che tutte le arterie sono state sezionate, circoscrivere la vena cavale inferiore tra il rene destro e il lobo epatico laterale destro e sezionare la vena dallo spazio retroperitoneale. Seguire il tronco celiaco per esporre l'aorta. Quindi sezionare il tessuto adiposo retroperitoneale e circoscrivere l'aorta sopra il tronco celiaco.

Ora iniettare 1000 unità di eparina in un millilitro di soluzione salina nello speleologo della vena inferiore. Copri l'incisione con un batuffolo di cotone e attendi uno o due minuti affinché l'eparina faccia effetto. Quindi circoscrivere l'aorta con una pinza e sezionare l'aorta e lo speleologo della vena inferiore distalmente dal rene.

Per posizionare la cannula venosa porta, praticare un'incisione a bocca di pesce nella vena porta distale e aprire l'incisione con una pinza. Quindi incannulare la vena porta e lavare il fegato con 20 millilitri di soluzione di ringer fino a quando il fegato non si disumanizza Usando legature di seta a sei zero per fissare la cannula in posizione. Per posizionare la cannula arteriosa, sezionare l'aorta sopra il tronco celiaco fino a quando il segmento dell'aorta non può essere liberato dallo spazio retroperitoneale.

Tagliare longitudinalmente il segmento aortico per generare un cerotto aortico e inserire la cannula autocostruita in un supporto statico. Quindi utilizzare due pinze per far scivolare il cerotto aortico sulla cannula e legare l'arteria epatica con una sutura di seta a sei zero sopra la cannula. Fissaggio del cerotto al moncone per eseguire la decellularizzazione Collegare il rubinetto a tre vie sulla cannula della vena porta al relativo accesso al reattore e collegare la cannula arteriosa all'accesso arterioso facendo attenzione che l'aria non entri negli impianti.

Quindi, collegare il respiratore alla camera di distribuzione della pressione e collegare la camera al reattore. Avviare l'applicazione della pressione. Quindi per iniziare la decellularizzazione.

Fondere il fegato con l'1% di tritton X 100 a una velocità di cinque millilitri al minuto. Consentire l'effluenza dei rifiuti attraverso il deflusso del dispositivo di perfusione per mantenere costante il livello del fluido all'interno della camera di perfusione e al di sopra del fegato perfuso. Dopo 90 minuti, cambiare il detergente con l'1% di SDS I fegati perfusi attraverso la vena di forza mostrano una delucidazione omogenea che indica la decellularizzazione con cellule rimanenti macroscopicamente visibili durante e dopo il processo, mentre i fegati perfusi attraverso l'arteria epatica dimostrano un corso di decellularizzazione più omogeneo con cellule rimanenti meno visibili.

Se i fegati venivano perfusi con l'applicazione di condizioni di pressione oscillante, non erano visibili cellule rimanenti. Indipendentemente dalla perfusione. La valutazione istologica radicolare delle matrici epatiche decellularizzate supporta i risultati macroscopici nei fegati perfusi attraverso l'arteria epatica.

Non si osservano cellule rimanenti, indipendentemente dal fatto che siano state perfuse in condizioni di pressione oscillante o meno, i fegati perfusi attraverso la vena porta, tuttavia, mostrano zone di cellule rimanenti, anche se sono perfuse in condizioni di pressione oscillante, sebbene queste condizioni riducano la massa cellulare rimanente in questi fegati, si noti la conservazione delle matrici extracellulari dei fegati indipendentemente dalle condizioni di decellularizzazione. Anche il contenuto di DNA per peso secco della matrice epatica è diminuito in tutti i gruppi sperimentali rispetto ai fegati nativi. Sebbene le differenze fossero statisticamente significative solo nel perfuso del gruppo in condizioni di pressione oscillante.

Inoltre, la colata di corrosione delle matrici epatiche decellularizzate ha confermato la conservazione della microanatomia del fegato durante il processo di perfusione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere, incannulare e perfondere i fegati rossi per una decelerazione omogenea riproducibile. Non dimenticare che lavorare con Triton X 100 e SDS può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere precauzioni come indossare i guanti durante l'esecuzione di questa procedura.