Un Screenable In Vivo Saggio per mitocondriale modulatori Uso Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare la tossicità mitocondriale o gli effetti benefici dei farmaci utilizzando l'organismo modello. C eleganza. Ciò si ottiene mediante la quantificazione in vivo dei livelli di TP in ceppi transgenici di elgan marino che esprimono l'enzima crocifera lucciola fuso alla proteina fluorescente verde.

Il gene di fusione conferisce due proprietà distinte ai nematodi. La prima è che quando viene dato il substrato Lucifero, i nematodi emettono luce nell'intervallo visibile in proporzione alle loro riserve cellulari di A TP. E il secondo è che se illuminati con la lunghezza d'onda appropriata, mostreranno una forte fluorescenza verde.

La fluorescenza è indipendente dai livelli di nematodi e TP ed è proporzionale alla loro massa o numero. Pertanto, può essere utilizzato per normalizzare le misure di bioluminescenza. Durante un test tipico, una popolazione di vermi sincronizzati con lo sviluppo viene coltivata fino allo stadio larvale L quattro.

I nematodi vengono quindi trattati con i composti farmacologici in esame per un periodo di tempo prima della misurazione sia della fluorescenza che della bioluminescenza. I risultati mostrano una potenziale tossicità dei farmaci. Quando la bioluminescenza è ridotta, un segnale potenziato indica un risultato per ulteriori test per gli effetti benefici sulla funzione mitocondriale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come lo screening farmacologico su cellule in coltura, è che lo screening viene effettuato nel contesto fisiologico di un intero organismo multicellulare vivo con quasi il 50% di oftalmologia genetica per l'uomo. E come gli esseri umani, l'eleganza richiede in realtà una fosforilazione ossidativa mitocondriale per svilupparsi nell'età adulta e i suoi mitocondri condividono anche con i mitocondri dei mammiferi molte caratteristiche in termini di struttura, funzione, bioenergetica. I parametri critici all'interno del protocollo includono lo stadio di sviluppo in cui le esposizioni hanno iniziato la durata dell'esposizione al del nematode, al farmaco di interesse e la semina di un numero simile di nematodi in ciascuno dei pozzi e, naturalmente, evitare la contaminazione Il primo giorno. In condizioni sterili, trasferire i nematodi da una piastra di terreno di crescita di sei centimetri in due millilitri di terreno completo di S in un pallone con 30 grammi per litro di e coli.

OP 50 in terreno S completo, quindi incubare il pallone con agitazione il quarto giorno, sbiancare la coltura di nematodi GR per raccogliere le uova e sincronizzare la popolazione di vermi. Quindi incubare le uova per una notte in un pallone di vetro contenente 15 millilitri di terreno completo di S con agitazione il giorno successivo, quinto giorno, i nematodi saranno allo stesso stadio di crescita. Per determinare il numero di vermi nati utilizzando ogni volta una punta pulita, trasferire tre aliquote da 100 microlitri di nematodi in microprovette separate contenenti 900 microlitri di terreno, integrate con pipettaggio allo 0,01% tra 20 e verso il basso alcune volte per rilasciare eventuali vermi che aderiscono alla punta.

Quindi contare i nematodi in quattro goccioline separate da 10 microlitri da ciascuna delle provette di diluizione triplicata e calcolare il volume della sospensione di nematodi necessaria per impostare due colture da 20 millilitri con 10 nematodi per 10 microlitri, decantare i volumi approssimativi in due provette coniche da 15 millilitri pre-pesate. Pesare le provette per determinare il volume effettivo erogato. Quindi per regolare delicatamente il vortice dei volumi target e rimuovere il volume in eccesso.

Ora, lavare i nematodi in un totale di 14 millilitri di S fresco, terreno completo per tubo e sospendere nuovamente i pellet in cinque millilitri di terreno completo S con 30 grammi per litro di uguale. OP 50. Trasferire i nematodi in fiaschi di vetro conici contenenti 15 millilitri di S completi di 30 grammi per litro di uguaglianza.

OP 50 per un volume totale di 20 millilitri per pallone e registrare il tempo di alimentazione. Fare la media del numero di nematodi in nove goccioline da 10 microlitri per confermare che le colture sono diluite a 10 nematodi per 10 microlitri. Metti le colture nell'incubatrice per 42-44 ore.

Il settimo giorno, estrarre le colture di nematodi in un unico pallone con un leggero vortice continuo. Quindi trasferire tre, quattro aliquote da millilitri di nematodi in un singolo trogolo sterile da 60 millilitri. Utilizzare una pipetta a otto canali per Eloqua, 25 microlitri di nematodi sospesi per pozzetto in 96.

Piastre per microtitolazione ben nere con fondo piatto e trasparente. Quindi rimetti i coperchi sui piatti e metti da parte i piatti. Ogni volta che due piastre sono state seminate, trasferire altre due aliquote da 2,5 millilitri di nematodi nella mangiatoia per sostituire il volume perso.

Dopo aver seminato da 13 a 14 piastre con nematodi, aggiungere 74 microlitri di terreno completo S a ciascun pozzetto e trasferire le piastre in una camera umida e in un'incubatrice agitante fino alla somministrazione del farmaco, mentre le piastre stanno agitando. Scongelare 2 96 piastre di farmaci saldate per il test. Quindi utilizzare una pipetta multicanale e cambiare i puntali ogni volta.

Trasferire un microlitro dalla prima colonna della prima piastra del farmaco alle colonne da uno a cinque di una piastra per nematodi. Trasferire un altro microlitro dalla seconda colonna della piastra del farmaco alle colonne da otto a 12 della piastra del nematode. Quindi aggiungere un microlitro di veicolo alle colonne sei e sette della piastra del nematode.

Utilizzare le colonne rimanenti nella piastra del farmaco per trattare il resto delle piastre dei nematodi allo stesso modo, assicurandosi di includere anche due piastre trattate con tutti i veicoli. Quindi rimetti tutte le piastre nelle camere umide nell'incubatrice a scuotimento per altre 20-22 ore l'ottavo giorno. Per preparare una piastra di controllo dello sfondo per le letture della fluorescenza, combinare il contenuto del pozzetto di una piastra per nematodi trattata con tutto il veicolo e lasciare che i nematodi si stabilizzino per due o tre minuti.

Quindi raccogliere i batteri contenenti snat e caricare campioni da 100 microlitri in ciascun pozzetto di una micropiastra nera con fondo trasparente. Osservare la lastra al microscopio, annotando i pozzetti in cui si possono vedere i nematodi per consentire l'esclusione di questi pozzetti dalla stima del fondo fluorescente. Quindi leggere la fluorescenza per misurare la bioluminescenza per ogni piastra.

A sua volta, erogare 50 microlitri di tampone di luminescenza appena preparato a ciascuno, posizionare bene la piastra su una piattaforma di agitazione e avviare il timer dopo tre minuti. Leggere la luminescenza a un secondo per misurazione. In questo primo esperimento rappresentativo, il marciume noto come inibitore del complesso mitocondriale uno ha ridotto l'emissione di luce da parte dei nematodi dopo esposizioni relativamente brevi e più lunghe a un intervallo di concentrazioni.

In questo esperimento, è stato dimostrato che l'erbicida paraquat riduce significativamente la fluorescenza GFP di bioluminescenza e la bioluminescenza normalizzata del ceppo C PE 2 54. Inoltre, il declino della bioluminescenza è stato maggiore di quello della fluorescenza, in linea con gli effetti noti della diminuzione della funzione mitocondriale e della riduzione della produzione di TP suscitata dal farmaco. Questo grafico illustra un esempio di un composto che migliora la bioluminescenza del nematode, l'ossalacetato intermedio del ciclo dell'acido citrico a una singola concentrazione di otto millimolari.

Si noti che la variabilità sperimentale osservata tra queste repliche non è insolita per gli esperimenti basati su Lucifer. Qui, è stato osservato che i composti inibitori della luciferasi Firefly influenzano l'attività dei luciferi in vitro a 25 micromolari e 100 micromolari con un'attenuazione quasi completa dell'attività da parte del composto DDD. 1, 4 3 4, sebbene non direttamente confrontabile, è stato osservato un calo significativo della bioluminescenza anche dopo il trattamento con il composto inibitorio di Lucifer in vivo.

Dimostrare che i cambiamenti nella bioluminescenza possono derivare dall'azione degli inibitori dell'enzima Lucifero piuttosto che da cambiamenti nei livelli di A TP in vivo. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante considerare che i composti possono influenzare direttamente l'attività dell'enzima luciferasi della lucciola piuttosto che influenzare lo stato energetico del verme. E quindi, i sub riscaldamenti possono essere convalidati utilizzando molte tecniche per valutare la funzione mitocondriale, come, ad esempio, la determinazione del consumo di ossigeno, la determinazione del potenziale di membrana mitocondriale delle specie reattive dell'ossigeno o la visualizzazione dei mitocondri in ceppi di eleganza marina.

Con tag GFP, mitocondri.