Name: High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Scopri lo screening ad alto rendimento e la biopercezione con ceppi fluorescenti di C. elegans. Questo metodo consente di rilevare in vivo contaminanti ambientali e modulatori di vie trascrizionali inducibili.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C. elegans transgeni sono stati forniti dalla genetica Caenorhabditis Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R21 concedere NS0667678-01 a KS. Tutti gli autori hanno partecipato alla raccolta, analisi e interpretazione dei dati. CKL, KS, e KPC ha partecipato alla stesura e alla revisione del manoscritto.

1. Preparazione dei cibi verme batterica Giorno 1 <ol><li> Aggiungere 5 ml di saturi E. coli OP50 coltura batterica di 500 ml di brodo Terrific integrata con 50 mg / ml di streptomicina e crescere in un incubatore agitazione (225 rpm) durante la notte a 37 ° C. </li></ol> 2 ° giorno <ol start="2"><li> Suddividere la cultura batterica durante la notte in dieci provette da 50 ml e batteri centrifuga in una centrifuga refrigerata a 2.500 rcf per 20 minuti. </li><li> Decantare brodo LB e risospendere ogni pellet batterico in 10 ml di liquidi crescita nematode (NGM). Agitare orizzontalmente in un piano shaker per 15 minuti per risospendere i batteri. Per fare tampone NGM, aggiungere 3 g di NaCl a 1 L di acqua deionizzata e autoclave. Raffreddare a 55 ° C e aggiungere in ordine le seguenti soluzioni sterili: 1 ml di 1 M CaCl 2, 1 ml di 1 M MgSO 4, e 25 ml di 1 M di potassio fosfato, pH 6,0. </li><li> Centrifugare la coltura batterica in una centrifuga refrigerata a 2.500 rcf per 20 minuti. </li><li> Decantare il tampone in NGM e pesare il pellet batterico. </li><li> Aggiungere un volume equivalente di tampone NGM per risospendere il pellet, aliquota 3 ml di concentrato di batteri in provette da 15 ml, e conservare a -20 ° C. </li></ol> 2. Su larga scala C. elegans coltura liquida Noi usiamo una linea transgenica VP596 (dvIs19 [pAF15 (gst-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [dop-3:: RFP]) portando due costrutti fluorescenti: Pgst -4:: GFP 14 a monitorare SKN-1 attività e PDOP-3:: RFP 17 a servire come standard per la normalizzazione verme numero. Giorno 1 <ol><li> Mescolare 150 ml NGM tampone, 1,5 ml di brodo LB, 150 ml di 5 mg / ml colesterolo (in etanolo), e 75 ml di 100 mg / ml di streptomicina. Filtro-sterilizzare la miscela e aggiungere in un matraccio 1 litro sterile. NOTA: L'aggiunta di brodo LB 1% a tampone NGM aiuta a prevenire i vermi si attacchino al vetro e di plastica, ma questa somma non è sufficiente a sostenere la crescita dei batteri. </li><li> Sincronizzare i vermi con la procedura di ipoclorito di serie 18. Fino a 0,5 ml di vermi gravido possono essere elaborati in un unico tubo 15 ml con 5 ml di soluzione di ipoclorito (3,75 ml di acqua sterile, 1 ml di candeggina per uso domestico, e 250 microlitri 10 N NaOH). Lavare le uova rilasciato con acqua sterile e risospendere in 10 ml di tampone NGM. </li><li> Diluire un campione delle uova a 100 volte in NGM tampone (ad esempio, 100 l in 10 ml) e contare il numero di uova in tre distinte aliquote 5 microlitri. Multiplo del numero medio da 200.000 (100 fattore di diluizione x 2.000) per stimare il numero totale di uova. </li><li> Aggiungi 200.000 a 2 milioni di uova al pallone con il tampone NGM e agitare la cultura a 100 rpm a 20 ° C. </li></ol> 2 ° giorno <ol start="5"><li> Almeno 16 h dopo l'aggiunta di uova al pallone, usare una pipetta sterile sierologico per rimuovere circa 0,5 ml di cultura verme sospeso. Pipettare 5 gocce tre microlitri sul coperchio sterile di una piastra di Petri. Mettere il coperchio in un congelatore di -20 ° C per 1-2 minuti per paralizzare i vermi. Contare il numero medio di vivere vermi nati per 5 microlitri e poi più di 30.000 (150 ml / 5 microlitri) per stimare il numero totale di vermi nati. </li><li> Scongelare un tubetto di surgelati OP50 coltura batterica (protocollo 1.6) e aggiungere 3 ml di 50% OP50 nella cultura verme vermi ogni 500.000 nati. Agitare il pallone a 100 rpm a 20 ° C. Worm si svilupperà in L4 e giovani adulti in circa 51 ore. L'OD600 di batteri dovrebbe essere di circa 2,200 all'inizio. Monitorare la quantità di batteri mediante assorbimento e aggiungere di più se il diametro esterno 600 scende al di sotto 0,900. </li></ol> 3. Worm raccolta e distribuzione 4 ° giorno <ol><li> Utilizzare una pipetta sterile sierologica per il trasferimento di circa 0,5 ml della cultura verme sospeso per una piastra standard agar NGM. Vedi i vermi con un stereomicroscopio per assicurarsi che la maggior parte sono L4 larve o giovani adulti. L4 avrà un posto ventrale chiara nel mezzo del corpo. I giovani adulti sarà leggermente più grande e non avrà un posto libero. </li><li> Versare la cultura verme in sterili provette da 50 ml e posto i tubi in un rack provetta sul bancone. Lasciare che il worm decantare per circa 10 minuti. Eliminare il surnatante tramite aspirazione o pipettaggio. NOTA: questo passaggio può essere importante per rimuovere le uova non schiuse o worm che non si è sviluppata perché si accontentano più lento di L4 e giovani adulti. </li><li> Raccogliere tutti i vermi in un unico tubo da 50 ml e lavare con tampone NGM con brodo LB 1% (NGM LB +) 3-4 volte a rimuovere i batteri. NOTA: Questo è fatto meglio in un secchio oscillante-centrifuga attraverso la raccolta di vermi a 500 rcf per 30 secondi e sostituendo il surnatante con freschi NGM + buffer di LB. </li><li> Dopo il lavaggio, riempire il tubo con NGM + tampone LB a 50 ml e versare in una bottiglia verme personalizzate di erogazione. Aggiungere un piccolo bar mescolare e mescolare per mantenere i vermi sospeso. Conte °indirizzo e numero di worm in tre 5 gocce microlitri come sopra indicato. Diluire con LB NGM + fino ad ottenere 12-15 worm per 5 goccia microlitri (~ 2,5-3,0 worm / mL). NOTA: un minimo di circa 20 ml (60.000 worm) è necessaria per riempire lo spazio morto del pallone di erogazione e cassetta dispenser. Ogni 384 pozzetti richiede circa 35.000 worm o 11,5 ml di vermi sospeso. </li><li> Carico di 10 microlitri cassetta di erogazione e sterilizzare in fondo con etanolo al 70%. Sciacquare l'etanolo da fondo con acqua sterile. </li><li> Inserire l'estremità della cassetta di erogazione nel pallone in modo che sia appena sopra la barra di mescolare senza interrompere il suo movimento. Assicurarsi che il worm rimane sospeso per tutto il fiasco intero. Programmare il dispenser per erogare a bassa velocità con 2 pre-impulsi. Primo ed eseguire almeno 10 ml di vermi sospeso. Riempire le piastre in base alle esigenze rapidamente per evitare che i vermi da stabilirsi nel tubo. </li><li> Sigillare i piatti con del nastro adesivo traspirante. </li><li> Posizionare le piastre su una piattaforma di agitazione in un incubatore alla temperatura appropriata per la propria analisi. Non impilare i piatti. </li></ol> 4. Analisi di fluorescenza <ol><li> Posizionare la piastra segnale in un lettore di micropiastre per misurare l'intensità di fluorescenza di ogni bene con la lunghezza d'onda appropriata di emissione e di eccitazione (Filtri per i nostri test: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em). </li><li> Calcolare il rapporto di GFP / RFP e normalizzare con le letture dei pozzi di controllo (senza attivare composto) per determinare la differenza esatta piega l'intensità di fluorescenza derivati ​​da trattamenti individuali. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Il nostro SKN-1 test utilizza un ceppo cromosomicamente integrato giornalista doppio (VP596). Come mostrato nella Figura 1, il numero di worm è ben correlata al volume erogato. Come mostrato nelle figure 2A e 2B, totale GFP e RFP fluorescenza per bene è altamente riproducibile da pozzetto a pozzetto su una piastra ben 384. Come mostrato nella Figura 2C, non-indotta Pgst-4:: GFP fluorescenza è linearmente correlata alla PDOP-3:: RFP attraverso 384 pozzetti. Se espresso come rapporto di GFP / RFP, fluorescenza diventa altamente riproducibili da pozzetto a pozzetto attraverso una piastra ben 384 (confrontare coefficiente di variazione dalla figura 2D a 2A) che dimostrano la capacità del PDOP-3:: reporter RFP per ridurre la variabilità. Come mostrato nella Figura 3, l'induzione di rispetto GFP a RFP con un SKN-1 attivazione xenobiotici (38 mM juglone) è robusto e altamente riproducibile su un piatto ben 384. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Numero di vermi rispetto al volume erogato. I worm sono stati diluiti a circa 2/μl e dispensati in un piatto ben 24 per il conteggio manuale con uno stereomicroscopio. N = 8 pozzetti per volume. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fluorescenza totale di vermi dispensato in un piatto ben 384 è riproducibile. I worm sono stati diluiti a circa microlitri 2.5/μl e 30 è stato dispensato in tutti i pozzetti di una piastra ben 384. GFP (A) e RFP (B) fluorescenza di tutti i pozzetti aveva un coefficiente di variazione inferiore al 9%. (C) GFP fluorescenza è fortemente correlato alla RFP fluorescenza. (D) calcolo del rapporto tra GFP di RFP ridotto il coefficiente di variazione al di sotto del 6% (A, B e D) Le linee continue indicano i mezzi e le linee tratteggiate indicano tre deviazioni standard al di sopra o al di sotto della media. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 Attivazione di Pgst-4:: GFP è robusto e coerente. Circa il 75 L4 worm sono state erogate in tutti i pozzetti di una piastra ben 384 e 38 mM juglone è stato aggiunto in ogni colonna. GFP e RFP fluorescenza è stata misurata dopo 21 h di incubazione. La media del rapporto relativo fluorescenza di ogni controllo (1,0) e juglone pozzi (8,9) sono contrassegnati da linee continue. Tre deviazioni standard sopra la media dei controlli e al di sotto della media juglone sono segnati con linee spezzate.

<ol><li>Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-throughput+screen+identifies+inhibitors+of+the+Schistosoma+mansoni+redox+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade.</a> PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).</li>
<li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+small+animal+models%2C+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li>
<li>Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+a+versatile+platform+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery.</a> Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).</li>
<li>WormBase [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbase.org">http://www.wormbase.org</a> (2012).</li>
<li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).</li>
<li>Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WD40+repeat+protein+WDR-23+functions+with+the+CUL4%2FDDB1+ubiquitin+ligase+to+regulate+nuclear+abundance+and+activity+of+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).</li>
<li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide-responsive+genes+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).</li>
<li>Tullet, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+inhibition+of+the+longevity-promoting+factor+SKN-1+by+insulin-like+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans.</a> Cell. 132, 1025-1038 (2008).</li>
<li>Oliveira, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-adapted+stress+and+longevity+gene+regulation+by+Caenorhabditis+elegans+SKN-1%2FNrf%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf.</a> Aging Cell. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Park, S. -K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8, 258-269 (2009).</li>
<li>Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+chemoprevention+mechanisms+mediated+through+the+Keap1-Nrf2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway.</a> Antioxid Redox Signal. , (2010).</li>
<li>Kwak, M. K., Kensler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+NRF2+signaling+for+cancer+chemoprevention%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).</li>
<li>Leiser, S. F., Miller, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+signaling%2C+a+mechanism+for+cellular+stress+resistance+in+long-lived+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice.</a> Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).</li>
<li>Link, C. D., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+transgenes+for+study+of+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).</li>
<li>Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1%2FNrf2+inhibits+dopamine+neuron+degeneration+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+methylmercury+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity.</a> Toxicol Sci. , (2010).</li>
<li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+inexpensive+method+to+screen+for+common+foods+that+reduce+the+action+of+acrylamide%2C+a+harmful+substance+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food.</a> Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).</li>
<li>Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+extrasynaptic+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).</li>
<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%2C+a+Practical+Guide%22">C. elegans, a Practical Guide</a>. , Oxford University Press. (2005).</li>
<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vi presentiamo un metodo per la coltura e l&#39;erogazione un gran numero di nematodi transgenici. Le attrezzature utilizzate per la coltura worm è standard per i laboratori che effettuano la clonazione molecolare e la gestione dei liquidi e delle attrezzature fluorescenza è standard per i laboratori di lavorazione un gran numero di micropiastre. Altri metodi di dispensare un gran numero di vivere C. elegans richiedono costosi impianti di smistamento delle particelle 19. Il Pgst-4:: GFP test...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> LB brodo </td><td> Ricerca Products International Corp. </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> Terrific brodo </td><td> Ricerca Products International Corp. </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy HT ™ Multi-mode micropiastre Reader </td><td> Biotek </td><td></td><td> Filtri: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo Seleziona Dispenser </td><td> Biotek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Worm fiasco di erogazione </td><td> Southern Scientific Inc., Micanopy, FL </td><td></td><td> Assemblati su misura (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 micropiastre </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> Nastro di tenuta traspirante </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-idrossi-p-naphthoqinone) Juglone </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglone è dissolto in DMSO </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans ceppo transgenico </td><td> Autore di laboratorio </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4:: GFP e PDOP-3:: RFP </td></tr></tbody></table>

high-throughput screening e biopercezione con fluorescente c. elegans ceppi

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) è un approccio potente per identificare modulatori chimici dei processi biologici. Tuttavia, molti composti identificati nel schermi utilizzando modelli di coltura cellulare si trovano spesso ad essere tossici o farmacologicamente attive in vivo 1-2. Lo screening in modelli animali tutto può aiutare ad evitare queste trappole e semplificare il percorso per lo sviluppo di farmaci. C. elegans è un organismo pluricellulare modello adatto per HTS. Si tratta di piccole dimensioni (&lt;1 mm) e può essere economicamente colto e dispensati in liquidi. C. elegans è anche uno dei modelli animali più docili sperimentalmente che consentono la determinazione rapida e dettagliata dei farmaci modalità d&#39;azione 3. Abbiamo descritto un protocollo per la coltura e l&#39;erogazione ceppi fluorescenti di C. elegans per high-throughput screening di librerie chimiche o rilevamento di contaminanti ambientali che alterano l&#39;espressione di un gene specifico. Un gran numero di vermi evolutivamente sincronizzati sono cresciuti in coltura liquida, raccolte, lavate, e sospeso ad una densità definita. I worm sono poi aggiunti al nero, dal fondo piatto a 384 pozzetti utilizzando un dosatore peristaltico liquido. Piccole molecole da una biblioteca chimica o campioni (per esempio, acqua, cibo, o suolo) possono essere aggiunti ai pozzetti con i vermi. In vivo, in tempo reale intensità di fluorescenza viene misurata con un lettore di fluorescenza per micropiastre. Questo metodo può essere adattato a qualsiasi gene inducibile in C. elegans per i quali un giornalista idonei. Lo stress inducibile molti e di sviluppo percorsi trascrizionale sono ben definiti in C. elegans GFP e reporter di ceppi transgenici esistono già per molti di loro 4. Quando combinato con i giornalisti appropriato transgenico, il nostro metodo può essere usato per individuare modulatori percorso o per sviluppare robuste analisi biosensore per i contaminanti ambientali. Dimostriamo il nostro C. elegans, la cultura e la dispensazione di protocollo con un dosaggio HTS abbiamo sviluppato per monitorare la C. trascrizione elegans cap &#39;n&#39; fattore collare SKN-1. SKN-1 e il suo omologo di mammifero Nrf2 attivare i geni citoprotettivo durante lo stress ossidativo e xenobiotici 5-10. Nrf2 mammiferi protegge da numerose malattie legate all&#39;età come il cancro, neurodegenerazione, e l&#39;infiammazione cronica ed è diventato uno dei principali bersagli chemioterapici 11-13. La nostra analisi si basa su un reporter GFP transgenico per il SKN-1 gene bersaglio -4 gst 14, che codifica per una glutatione s-transferasi 6. Il reporter gst -4 è anche un biosensore per le sostanze chimiche xenobiotiche e ossidativo che attivano SKN-1 e può essere utilizzato per rilevare i bassi livelli di contaminanti quali acrilamide e il metilmercurio 15-16.

Una procedura per liquidi a base di coltura e distribuzione dei<em&gt; C. elegans</em&gt; Giornalista ceppi che esprimono proteine ​​fluorescenti è descritto che non richiede costose attrezzature di smistamento. Questo approccio può essere applicato a numerosi inducibile<em&gt; C. elegans</em&gt; Geni per la scoperta di nuovi farmaci o sensori biologici di contaminanti.

High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

Lo screening ad alta produttività (HTS) è un approccio potente per l'identificazione di modulatori chimici dei processi biologici. Tuttavia, molti composti identificati in...

Questo video illustra un metodo per coltivare e distribuire ceppi fluorescenti di CL gans per lo screening ad alto rendimento di librerie chimiche o per la rilevazione di contaminanti ambientali, al fine di valutare l'effetto di agenti chimici o ambientali sull'attività di proteine specifiche. In CL elgan, le colture batteriche vengono inizialmente preparate come fonte alimentare per i vermi e per i vermi transgenici GFP. I vermi sincronizzati vengono coltivati.Da 0,5 a 2 milioni di vermi vengono quindi raccolti, lavati e distribuiti in 3 piastre microtitolazione da 84 pozzetti, quindi vengono aggiunte molecole di piccole dimensioni da una libreria chimica o campioni di prova come acqua, cibo o suolo. Infine, la fluorescenza dei vermi viene misurata mediante un lettore di micropiastre.L'analisi dei dati delle intensità di fluorescenza rivela piccole molecole che modulano vie di trascrizione induttibili o consente la rilevazione di contaminanti ambientali. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi in vitro e quelli basati su colture cellulari, è che non si perderà tempo con composti tossici o inattivi in vivo. Questo metodo ad alto rendimento può aiutare a identificare piccole molecole che modulano diverse vie induttibili.Benché abbiamo sviluppato questo metodo per lo screening ad alto rendimento di librerie di piccole molecole, può essere applicato anche al biosensing di contaminanti in campioni alimentari e ambientali. La procedura sarà dimostrata da Andrew Dine, tecnico del mio laboratorio, e Q long, ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Preparare in anticipo il cibo batterico per i vermi.Iniziare inoculando 500 millilitri di terrific broth, integrati con 50 microgrammi per millilitro di streptomicina, con cinque millilitri di e coli OP 50 saturo. Posizionare la coltura su un agitatore e far crescere tutta la notte a 37 gradi Celsius.Il giorno successivo, suddividere la coltura in 10 provette da 50 millilitri. Quindi posizionare le provette in una centrifuga refrigerata e centrifugare a 2.500 RCF per 20 minuti. Dopo la centrifugazione, sospendere ogni pellet batterico in 10 millilitri di terreno liquido per la crescita di nematodi o NGM.Agitare orizzontalmente le sospensioni. Utilizzare un agitatore da pavimento per 15 minuti per risospendere i batteri. Successivamente, centrifugare la coltura batterica a 2.500 RCF a quattro gradi Celsius per 20 minuti.Decantare l'NGM e pesare il pellet batterico. Quindi aggiungere un volume uguale di tampone NGM e risospendere i pellet mediante vortex. Infine, aliquotare tre millilitri della coltura batterica risospesa in provette da 15 millilitri e conservarle a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso.In questa dimostrazione, verrà misurato l'effetto dello stress indotto dal Xeno Duke loan sul fattore di trascrizione Sskn one, a titolo esemplificativo. È noto che Sskn one attiva geni citoprotettivi durante lo stress ossidativo e xenobiotico. Viene preparata una coltura su larga scala della linea Trenchgenic c gans VP 5 96, che contiene due costrutti fluorescenti.I vermi VP 5 96 esprimono sia il promotore GST four che guida GFP, utilizzato per monitorare l'attività del fattore di trascrizione Sskn uno, sia il promotore DOP three che guida RFP, utilizzato come standard per la normalizzazione del numero di vermi.DOP tre è il promotore per un recettore della dopamina ed è costitutivamente espresso nei neuroni in tutto l'organismo. Nell'esempio, poiché lo xenobio lon attiva fortemente sskn uno e aumenta la quantità di GFP espressa dal promotore GS T quattro, per preparare le colture iniziare mescolando 150 millilitri di tampone N NGM, 1,5 millilitri di LB 150, microlitri di colesterolo uno molare e 75 microlitri di streptomicina 100 milligrammi per millilitro. L'aggiunta del LB aiuta a impedire ai vermi di aderire alla vetreria e alla plastica, ma questa quantità non è sufficiente a sostenere la crescita batterica.Filtrare la miscela per sterilizzarla, quindi trasferirla in un flacone sterile da un litro e mettere da parte il flacone per liberare le uova dai vermi adulti GR. Lavare i batteri dai vermi centrifugandoli e sostituendo il mezzo NGM fino a quando il sopranatante non diventa limpido. Lavare i vermi una seconda volta risospendendoli in acqua sterile, quindi centrifugare nuovamente dopo la risospensione.Rimuovere il sopernatante e riempire il tubo con 3,75 millilitri di acqua sterile. Aggiungere un millilitro di candeggina domestica e 250 microlitri di idrossido di sodio 10 normal, mescolando immediatamente capovolgendo il tubo da cinque a sei volte. Posizionare il tubo su un agitatore rotatorio dopo che i vermi sono stati esposti alla candeggina per quattro minuti.Posizionare il tubo sotto un microscopio stereoscopico. La maggior parte degli adulti dovrebbe essere distesa. Agitare vigorosamente il tubo da 15 a 20 volte per favorire la distensione di eventuali vermi adulti rimanenti dopo la lisi; dopo un tempo totale di cinque minuti, aggiungere acqua sterile fino a riempire il tubo.Mescolare mediante inversione da cinque a sei volte per raccogliere le uova. Centrifugare il tubo per un minuto a 500 RCF. Lavare le uova tre volte mediante Resus, sospensandole in 10 millilitri di acqua sterile, centrifugando ed eliminando il soprannatante.Successivamente, diluire un campione di 100 microlitri di uova di 100 volte aggiungendo 10 millilitri di tampone NGM. Quindi, pipettare tre aliquote di cinque microlitri ciascuna su un coperchio di piastra di Petri sotto un microscopio. Contare il numero di uova in tre aliquote separate da cinque microlitri.Per stimare il numero totale di uova, aggiungere da 200.000 a 2 milioni di uova al matraccio con tampone NGM e agitare la coltura a 100 giri al minuto a 20 gradi Celsius. Almeno 16 ore dopo l'aggiunta delle uova al matraccio, utilizzare una pipetta sierologica sterile per prelevare circa 0,5 millilitri della coltura di vermi in sospensione.Deporre con pipetta tre gocce da cinque microlitri sul coperchio sterile di una piastra di Petri. Posizionare il coperchio in un congelatore a meno 20 gradi per uno o due minuti per paralizzare i vermi; una volta paralizzati i vermi, contare il numero medio di vermi vivi schiusi ogni cinque microlitri utilizzando un microscopio stereoscopico per stimare il numero totale.Scongelare la coltura batterica OP 50 congelata preparata in precedenza lasciandola a temperatura ambiente per alcuni minuti. Aggiungere quindi tre millilitri di OP 50 al 50% per ogni 500.000 worm appena schiusi. Agitare il matraccio a 100 giri al minuto a 20 gradi Celsius.I vermi si svilupperanno in larve di quarto stadio e giovani adulti in circa 51 ore. Monitorare la quantità di batteri durante l'incubazione mediante ispezione visiva. Aggiungere ulteriori batteri se il mezzo diventa chiaro.Utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire circa 0,5 millilitri della coltura di vermi sospesa su una piastra standard in agar NGM. Osservare i vermi con un microscopio stereoscopico per verificare che la maggior parte siano larve di stadio L4 e giovani adulti in microscopia a campo chiaro; le larve L4 presenteranno una zona chiara ventrale al centro del corpo. I giovani adulti saranno leggermente più grandi e non avranno una zona chiara.Successivamente, aspirare la coltura di vermi in provette sterili da 50 millilitri. Posizionare le provette in un portaprovette all'interno della cappa e lasciarle riposare in modo da far sedimentare le uova non schiuse o i vermi non sviluppati, che sedimentano più lentamente rispetto ai vermi sviluppati.Dopo 10 minuti, rimuovere il soprannatante, che contiene vermi non schiusi e non sviluppati, aspirando circa 10 millilitri di tampone NGM per ogni pellet e sospendere i vermi agitando delicatamente i tubi. Raccogliere tutti i vermi in un unico tubo da 50 millilitri. Centrifugare nel centrifugatore con rotor swinging bucket a 500 RCF per 30 secondi.Quindi risospendere i vermi in 50 millilitri di NGM con 1% di lb per lavarli. Ripetere questa operazione, effettuando da tre a quattro lavaggi, per rimuovere i batteri dopo il lavaggio. Riempire il tubo con NGM più tampone LB fino a 50 millilitri.Versare questo in un flacone personalizzato per la distribuzione di vermi contenente un’asta magnetica e posizionarlo su un agitatore magnetico. È necessaria una quantità minima di circa 20 millilitri o 60.000 vermi per riempire lo spazio morto del flacone di distribuzione e della cassetta del distributore. Contare il numero di vermi in tre gocce da cinque microlitri come mostrato in precedenza.Dopo il conteggio in NGM più LB, per una concentrazione di 12-15 vermi per goccia di cinque microlitri, ogni piastra da 84 pozzetti richiede circa 35.000 vermi o 11,5 millilitri di vermi sospesi. Inserire una cassetta dosatrice da 10 microlitri nell'erogatore e sterilizzarla preinnestandola con etanolo al 70%. Rimuovere l'etanolo preinnestando con acqua sterile.Inserire l'estremità della cassetta di dispensazione nel pallone in modo che si trovi appena sopra la barretta magnetica senza interferire con il suo movimento. Assicurarsi che i vermi rimangano sospesi in tutto il pallone. Programmare il distributore per erogare i vermi a bassa velocità con due preimpulsi di priming ed erogare almeno 10 millilitri di vermi in sospensione.Riempire rapidamente le piastre a microtitolazione, che dovrebbero già contenere i composti in prova, per evitare che i vermi si accumulino nei tubi. In questo caso, il composto in prova precedentemente caricato sulla piastra a microtitolazione è Glow. Sigillare le piastre con nastro traspirante per impedire l'accumulo di polvere nelle pozzette.Posizionare le piastre su una piattaforma agitata all'interno di un incubatore alla temperatura appropriata per il saggio. Non impilare le piastre poiché ciò potrebbe ostacolare il flusso d'aria. Inserire la piastra bersaglio in un lettore per micropiastre per misurare l'intensità di fluorescenza di ogni pozzetto con le lunghezze d'onda di emissione ed eccitazione appropriate.I filtri utilizzati per la GFP prevedono un'eccitazione a 485 e un'emissione a 528. I filtri per la RFP prevedono un'eccitazione a 540 e un'emissione a 590. Dopo aver letto la piastra, calcolare il rapporto tra GFP e RFP e normalizzare con le letture dei pozzetti di controllo, che non contengono il composto attivatore, per determinare l'esatto incremento del valore dell'intensità di fluorescenza derivante dai singoli trattamenti.Il saggio SSKN qui mostrato utilizza un reporter doppio integrato a livello cromosomico, una ceppa in cui i vermi sono stati contati manualmente mediante microscopio stereoscopico. Il numero di vermi ha mostrato una correlazione con il volume dispensato, con un valore R quadro di 0,94 e un valore p inferiore a 0,0001. Ciò indica che il numero di vermi dispensato in ciascun pozzetto può essere controllato regolando il volume dispensato.La fluorescenza GFP totale per pozzetto mostrata a sinistra e la fluorescenza RFP per pozzetto mostrata a destra sono altamente riproducibili da pozzetto a pozzetto su una piastra da 3 84 pozzetti in queste figure. Le XS indicano la fluorescenza relativa misurata in ciascun pozzetto. Le linee continue indicano le medie e le linee tratteggiate indicano tre deviazioni standard sopra o sotto la fluorescenza media di tutti i pozzetti, con un coefficiente di variazione inferiore al 9%. Come mostrato in questa figura, la fluorescenza GFP proveniente dal promotore GST quattro è linearmente correlata alla fluorescenza RFP proveniente dal promotore DOP tre su 3 84 pozzetti, con un valore di R quadro di 0,62 e un valore p inferiore a 0,0001.Pertanto, il reporter RFP non inducibile può essere utilizzato per normalizzare il reporter GFP inducibile. Quando si esprime, il rapporto tra la fluorescenza GFP e RFP diventa altamente riproducibile da pozzetto a pozzetto su una piastra da 3 84 pozzetti.Il calcolo del rapporto tra GFP e RFP ha ridotto il coefficiente di variazione al di sotto del 6%, dimostrando la capacità del reporter RFP con tre promotori DOP di ridurre la variabilità, come mostrato qui. L'induzione di GFP rispetto a RFP mediante un xenobiotico attivante SK N uno è robusta e altamente riproducibile su una piastra 3 84 pozzetti; i rapporti medi di fluorescenza relativa di tutti i pozzetti di controllo e dei pozzetti dovuti a GLO sono indicati con linee continue. Tre deviazioni standard al di sopra della media del controllo e al di sotto della media dlo sono indicate con linee tratteggiate.Una volta acquisita padronanza, l'allestimento di una coltura di vermi richiede circa un'ora il primo giorno, per la messa in coltura e la distribuzione. La raccolta e la distribuzione dei vermi possono essere completate in circa due ore se eseguite correttamente. È importante ricordare, durante il tentativo di questa procedura, di iniziare con almeno 60.000 vermi e di mantenerli in sospensione durante la distribuzione; seguendo questo protocollo, schermate con altri ceppi, ad esempio ceppi reporter per altre vie inducibili, possono essere effettuate al fine di sviluppare modulatori per altre vie dopo il loro sviluppo.Questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nei settori dello screening ad alto rendimento e del biosensing, consentendo di identificare rapidamente modulatori di percorsi molecolari di piccole dimensioni o di rilevare contaminanti ambientali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare, distribuire e misurare ceppi fluorescenti di elegans per lo screening ad alto rendimento di percorsi trascrizionali inducibili o per testare più campioni alla ricerca di contaminanti ambientali.

high-throughput-screening-biosensing-with-fluorescent-c-elegans

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descriviamo un metodo per identificare i regolatori sensibilizzati postembrionale di espressione proteica e la localizzazione...

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

Quantitative e automatica High-throughput Genome-wide Schermi RNAi in C. elegans</em

Fonte: Anderson, Q. L. et al. Un patosistema C . elegans ad alto rendimento, ad alto contenuto e a base liquida. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra un metodo di screening ad alto rendimento che utilizza Caenorhabditis elegans per studiare i knockdown genici durante le interazioni ospite-patogeno. Descrive la procedura per preparare i vermi knockdown e trasferirli su piastre di saggio per valutare gli effetti dell'uccisione dei vermi indotta da agenti patogeni.

Un test a base liquida multipozzetto per lo screening di abbattimenti di C. elegans

Fonte: Ali, I., et al. Screening ad alto rendimento di isolati microbici con impatto sulla salute di Caenorhabditis elegans . J. Vis. Esp. (2022)Questo video mostra un saggio fluorescente ad alta produttività per valutare come i batteri intestinali influenzino la resilienza allo stress in Caenorhabditis elegans. Tracciando la fluorescenza blu dei granuli intestinali rotti, il test rivela segnali di morte precedenti nei vermi esposti ai batteri testati.

Test fluorescente ad alta produttività per studiare le interazioni microbio-vermi

Un metodo di valutazione quantitativa della risposta chemiotattica...

C. elegans Chemiotassi Assay

Viene descritto un protocollo per il rilevamento in vivo degli effetti degli inibitori mitocondriali nell'organismo modello Caenorhabditis elegans e per l'identificazione di potenziali composti potenzianti. Questo protocollo può essere utilizzato per lo screening di librerie di farmaci alla ricerca di composti che modulano la funzione mitocondriale.

Un Screenable<em&gt; In Vivo</em&gt; Saggio per mitocondriale modulatori Uso Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Qui descriviamo un protocollo semplice per produrre rapidamente centinaia di agar media di crescita del nematode, piastre di coltura 96 pozzetti con un numero consistente di Caenorhhabditis elegans per pozzetto. Queste culture sono utili per lo screening fenotipico di interi organismi. Qui ci concentriamo sull'utilizzo di queste culture ai prodotti chimici schermo per effetti di pro-longevità.

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Qui descriviamo un protocollo che è un host adattabile, intero, strumento di screening ad alto contenuto che possa essere utilizzata per studiare le interazioni ospite-patogeno ed essere utilizzato per la scoperta di nuovi farmaci.

Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l'analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell'embriogenesi.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

I microbi intestinali possono avere un impatto positivo o negativo sulla salute del loro ospite attraverso meccanismi specifici o conservati. Caenorhabditis elegans è una comoda piattaforma per lo screening di tali microbi. Il presente protocollo descrive lo screening ad alto rendimento di 48 isolati batterici per l'impatto sulla resistenza allo stress dei nematodi, utilizzati come proxy per la salute dei vermi.

Screening ad alta produttività di isolati microbici con impatto sulla salute di Caenorhabditis elegans

Qui forniamo istruzioni su come utilizzare efficacemente SegElegans, un sistema di deep learning che abbiamo sviluppato per la segmentazione automatizzata di singoli vermi in immagini di microscopia a campo largo, per il successivo utilizzo in software di analisi delle immagini come ImageJ. Forniamo modi per utilizzare il sistema sia online che offline.

Analisi automatizzata delle immagini a fluorescenza di C. elegans utilizzando SegElegans

Scopri lo screening ad alto rendimento e la biopercezione con ceppi fluorescenti di C. elegans. Questo metodo consente di rilevare in vivo contaminanti ambientali e modulatori di vie trascrizionali inducibili.

High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

Esplora altri video