Name: High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Scopri lo screening ad alto rendimento e la biopercezione con ceppi fluorescenti di C. elegans. Questo metodo consente di rilevare in vivo contaminanti ambientali e modulatori di vie trascrizionali inducibili.

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C. elegans transgeni sono stati forniti dalla genetica Caenorhabditis Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R21 concedere NS0667678-01 a KS. Tutti gli autori hanno partecipato alla raccolta, analisi e interpretazione dei dati. CKL, KS, e KPC ha partecipato alla stesura e alla revisione del manoscritto.

1. Preparazione dei cibi verme batterica Giorno 1 <ol><li> Aggiungere 5 ml di saturi E. coli OP50 coltura batterica di 500 ml di brodo Terrific integrata con 50 mg / ml di streptomicina e crescere in un incubatore agitazione (225 rpm) durante la notte a 37 ° C. </li></ol> 2 ° giorno <ol start="2"><li> Suddividere la cultura batterica durante la notte in dieci provette da 50 ml e batteri centrifuga in una centrifuga refrigerata a 2.500 rcf per 20 minuti. </li><li> Decantare brodo LB e risospendere ogni pellet batterico in 10 ml di liquidi crescita nematode (NGM). Agitare orizzontalmente in un piano shaker per 15 minuti per risospendere i batteri. Per fare tampone NGM, aggiungere 3 g di NaCl a 1 L di acqua deionizzata e autoclave. Raffreddare a 55 ° C e aggiungere in ordine le seguenti soluzioni sterili: 1 ml di 1 M CaCl 2, 1 ml di 1 M MgSO 4, e 25 ml di 1 M di potassio fosfato, pH 6,0. </li><li> Centrifugare la coltura batterica in una centrifuga refrigerata a 2.500 rcf per 20 minuti. </li><li> Decantare il tampone in NGM e pesare il pellet batterico. </li><li> Aggiungere un volume equivalente di tampone NGM per risospendere il pellet, aliquota 3 ml di concentrato di batteri in provette da 15 ml, e conservare a -20 ° C. </li></ol> 2. Su larga scala C. elegans coltura liquida Noi usiamo una linea transgenica VP596 (dvIs19 [pAF15 (gst-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [dop-3:: RFP]) portando due costrutti fluorescenti: Pgst -4:: GFP 14 a monitorare SKN-1 attività e PDOP-3:: RFP 17 a servire come standard per la normalizzazione verme numero. Giorno 1 <ol><li> Mescolare 150 ml NGM tampone, 1,5 ml di brodo LB, 150 ml di 5 mg / ml colesterolo (in etanolo), e 75 ml di 100 mg / ml di streptomicina. Filtro-sterilizzare la miscela e aggiungere in un matraccio 1 litro sterile. NOTA: L'aggiunta di brodo LB 1% a tampone NGM aiuta a prevenire i vermi si attacchino al vetro e di plastica, ma questa somma non è sufficiente a sostenere la crescita dei batteri. </li><li> Sincronizzare i vermi con la procedura di ipoclorito di serie 18. Fino a 0,5 ml di vermi gravido possono essere elaborati in un unico tubo 15 ml con 5 ml di soluzione di ipoclorito (3,75 ml di acqua sterile, 1 ml di candeggina per uso domestico, e 250 microlitri 10 N NaOH). Lavare le uova rilasciato con acqua sterile e risospendere in 10 ml di tampone NGM. </li><li> Diluire un campione delle uova a 100 volte in NGM tampone (ad esempio, 100 l in 10 ml) e contare il numero di uova in tre distinte aliquote 5 microlitri. Multiplo del numero medio da 200.000 (100 fattore di diluizione x 2.000) per stimare il numero totale di uova. </li><li> Aggiungi 200.000 a 2 milioni di uova al pallone con il tampone NGM e agitare la cultura a 100 rpm a 20 ° C. </li></ol> 2 ° giorno <ol start="5"><li> Almeno 16 h dopo l'aggiunta di uova al pallone, usare una pipetta sterile sierologico per rimuovere circa 0,5 ml di cultura verme sospeso. Pipettare 5 gocce tre microlitri sul coperchio sterile di una piastra di Petri. Mettere il coperchio in un congelatore di -20 ° C per 1-2 minuti per paralizzare i vermi. Contare il numero medio di vivere vermi nati per 5 microlitri e poi più di 30.000 (150 ml / 5 microlitri) per stimare il numero totale di vermi nati. </li><li> Scongelare un tubetto di surgelati OP50 coltura batterica (protocollo 1.6) e aggiungere 3 ml di 50% OP50 nella cultura verme vermi ogni 500.000 nati. Agitare il pallone a 100 rpm a 20 ° C. Worm si svilupperà in L4 e giovani adulti in circa 51 ore. L'OD600 di batteri dovrebbe essere di circa 2,200 all'inizio. Monitorare la quantità di batteri mediante assorbimento e aggiungere di più se il diametro esterno 600 scende al di sotto 0,900. </li></ol> 3. Worm raccolta e distribuzione 4 ° giorno <ol><li> Utilizzare una pipetta sterile sierologica per il trasferimento di circa 0,5 ml della cultura verme sospeso per una piastra standard agar NGM. Vedi i vermi con un stereomicroscopio per assicurarsi che la maggior parte sono L4 larve o giovani adulti. L4 avrà un posto ventrale chiara nel mezzo del corpo. I giovani adulti sarà leggermente più grande e non avrà un posto libero. </li><li> Versare la cultura verme in sterili provette da 50 ml e posto i tubi in un rack provetta sul bancone. Lasciare che il worm decantare per circa 10 minuti. Eliminare il surnatante tramite aspirazione o pipettaggio. NOTA: questo passaggio può essere importante per rimuovere le uova non schiuse o worm che non si è sviluppata perché si accontentano più lento di L4 e giovani adulti. </li><li> Raccogliere tutti i vermi in un unico tubo da 50 ml e lavare con tampone NGM con brodo LB 1% (NGM LB +) 3-4 volte a rimuovere i batteri. NOTA: Questo è fatto meglio in un secchio oscillante-centrifuga attraverso la raccolta di vermi a 500 rcf per 30 secondi e sostituendo il surnatante con freschi NGM + buffer di LB. </li><li> Dopo il lavaggio, riempire il tubo con NGM + tampone LB a 50 ml e versare in una bottiglia verme personalizzate di erogazione. Aggiungere un piccolo bar mescolare e mescolare per mantenere i vermi sospeso. Conte °indirizzo e numero di worm in tre 5 gocce microlitri come sopra indicato. Diluire con LB NGM + fino ad ottenere 12-15 worm per 5 goccia microlitri (~ 2,5-3,0 worm / mL). NOTA: un minimo di circa 20 ml (60.000 worm) è necessaria per riempire lo spazio morto del pallone di erogazione e cassetta dispenser. Ogni 384 pozzetti richiede circa 35.000 worm o 11,5 ml di vermi sospeso. </li><li> Carico di 10 microlitri cassetta di erogazione e sterilizzare in fondo con etanolo al 70%. Sciacquare l'etanolo da fondo con acqua sterile. </li><li> Inserire l'estremità della cassetta di erogazione nel pallone in modo che sia appena sopra la barra di mescolare senza interrompere il suo movimento. Assicurarsi che il worm rimane sospeso per tutto il fiasco intero. Programmare il dispenser per erogare a bassa velocità con 2 pre-impulsi. Primo ed eseguire almeno 10 ml di vermi sospeso. Riempire le piastre in base alle esigenze rapidamente per evitare che i vermi da stabilirsi nel tubo. </li><li> Sigillare i piatti con del nastro adesivo traspirante. </li><li> Posizionare le piastre su una piattaforma di agitazione in un incubatore alla temperatura appropriata per la propria analisi. Non impilare i piatti. </li></ol> 4. Analisi di fluorescenza <ol><li> Posizionare la piastra segnale in un lettore di micropiastre per misurare l'intensità di fluorescenza di ogni bene con la lunghezza d'onda appropriata di emissione e di eccitazione (Filtri per i nostri test: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em). </li><li> Calcolare il rapporto di GFP / RFP e normalizzare con le letture dei pozzi di controllo (senza attivare composto) per determinare la differenza esatta piega l'intensità di fluorescenza derivati ​​da trattamenti individuali. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Il nostro SKN-1 test utilizza un ceppo cromosomicamente integrato giornalista doppio (VP596). Come mostrato nella Figura 1, il numero di worm è ben correlata al volume erogato. Come mostrato nelle figure 2A e 2B, totale GFP e RFP fluorescenza per bene è altamente riproducibile da pozzetto a pozzetto su una piastra ben 384. Come mostrato nella Figura 2C, non-indotta Pgst-4:: GFP fluorescenza è linearmente correlata alla PDOP-3:: RFP attraverso 384 pozzetti. Se espresso come rapporto di GFP / RFP, fluorescenza diventa altamente riproducibili da pozzetto a pozzetto attraverso una piastra ben 384 (confrontare coefficiente di variazione dalla figura 2D a 2A) che dimostrano la capacità del PDOP-3:: reporter RFP per ridurre la variabilità. Come mostrato nella Figura 3, l'induzione di rispetto GFP a RFP con un SKN-1 attivazione xenobiotici (38 mM juglone) è robusto e altamente riproducibile su un piatto ben 384. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Numero di vermi rispetto al volume erogato. I worm sono stati diluiti a circa 2/μl e dispensati in un piatto ben 24 per il conteggio manuale con uno stereomicroscopio. N = 8 pozzetti per volume. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fluorescenza totale di vermi dispensato in un piatto ben 384 è riproducibile. I worm sono stati diluiti a circa microlitri 2.5/μl e 30 è stato dispensato in tutti i pozzetti di una piastra ben 384. GFP (A) e RFP (B) fluorescenza di tutti i pozzetti aveva un coefficiente di variazione inferiore al 9%. (C) GFP fluorescenza è fortemente correlato alla RFP fluorescenza. (D) calcolo del rapporto tra GFP di RFP ridotto il coefficiente di variazione al di sotto del 6% (A, B e D) Le linee continue indicano i mezzi e le linee tratteggiate indicano tre deviazioni standard al di sopra o al di sotto della media. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 Attivazione di Pgst-4:: GFP è robusto e coerente. Circa il 75 L4 worm sono state erogate in tutti i pozzetti di una piastra ben 384 e 38 mM juglone è stato aggiunto in ogni colonna. GFP e RFP fluorescenza è stata misurata dopo 21 h di incubazione. La media del rapporto relativo fluorescenza di ogni controllo (1,0) e juglone pozzi (8,9) sono contrassegnati da linee continue. Tre deviazioni standard sopra la media dei controlli e al di sotto della media juglone sono segnati con linee spezzate.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vi presentiamo un metodo per la coltura e l&#39;erogazione un gran numero di nematodi transgenici. Le attrezzature utilizzate per la coltura worm è standard per i laboratori che effettuano la clonazione molecolare e la gestione dei liquidi e delle attrezzature fluorescenza è standard per i laboratori di lavorazione un gran numero di micropiastre. Altri metodi di dispensare un gran numero di vivere C. elegans richiedono costosi impianti di smistamento delle particelle 19. Il Pgst-4:: GFP test...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> LB brodo </td><td> Ricerca Products International Corp. </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> Terrific brodo </td><td> Ricerca Products International Corp. </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy HT ™ Multi-mode micropiastre Reader </td><td> Biotek </td><td></td><td> Filtri: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo Seleziona Dispenser </td><td> Biotek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Worm fiasco di erogazione </td><td> Southern Scientific Inc., Micanopy, FL </td><td></td><td> Assemblati su misura (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 micropiastre </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> Nastro di tenuta traspirante </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-idrossi-p-naphthoqinone) Juglone </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglone è dissolto in DMSO </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans ceppo transgenico </td><td> Autore di laboratorio </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4:: GFP e PDOP-3:: RFP </td></tr></tbody></table>

high-throughput screening e biopercezione con fluorescente c. elegans ceppi

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) è un approccio potente per identificare modulatori chimici dei processi biologici. Tuttavia, molti composti identificati nel schermi utilizzando modelli di coltura cellulare si trovano spesso ad essere tossici o farmacologicamente attive in vivo 1-2. Lo screening in modelli animali tutto può aiutare ad evitare queste trappole e semplificare il percorso per lo sviluppo di farmaci. C. elegans è un organismo pluricellulare modello adatto per HTS. Si tratta di piccole dimensioni (&lt;1 mm) e può essere economicamente colto e dispensati in liquidi. C. elegans è anche uno dei modelli animali più docili sperimentalmente che consentono la determinazione rapida e dettagliata dei farmaci modalità d&#39;azione 3. Abbiamo descritto un protocollo per la coltura e l&#39;erogazione ceppi fluorescenti di C. elegans per high-throughput screening di librerie chimiche o rilevamento di contaminanti ambientali che alterano l&#39;espressione di un gene specifico. Un gran numero di vermi evolutivamente sincronizzati sono cresciuti in coltura liquida, raccolte, lavate, e sospeso ad una densità definita. I worm sono poi aggiunti al nero, dal fondo piatto a 384 pozzetti utilizzando un dosatore peristaltico liquido. Piccole molecole da una biblioteca chimica o campioni (per esempio, acqua, cibo, o suolo) possono essere aggiunti ai pozzetti con i vermi. In vivo, in tempo reale intensità di fluorescenza viene misurata con un lettore di fluorescenza per micropiastre. Questo metodo può essere adattato a qualsiasi gene inducibile in C. elegans per i quali un giornalista idonei. Lo stress inducibile molti e di sviluppo percorsi trascrizionale sono ben definiti in C. elegans GFP e reporter di ceppi transgenici esistono già per molti di loro 4. Quando combinato con i giornalisti appropriato transgenico, il nostro metodo può essere usato per individuare modulatori percorso o per sviluppare robuste analisi biosensore per i contaminanti ambientali. Dimostriamo il nostro C. elegans, la cultura e la dispensazione di protocollo con un dosaggio HTS abbiamo sviluppato per monitorare la C. trascrizione elegans cap &#39;n&#39; fattore collare SKN-1. SKN-1 e il suo omologo di mammifero Nrf2 attivare i geni citoprotettivo durante lo stress ossidativo e xenobiotici 5-10. Nrf2 mammiferi protegge da numerose malattie legate all&#39;età come il cancro, neurodegenerazione, e l&#39;infiammazione cronica ed è diventato uno dei principali bersagli chemioterapici 11-13. La nostra analisi si basa su un reporter GFP transgenico per il SKN-1 gene bersaglio -4 gst 14, che codifica per una glutatione s-transferasi 6. Il reporter gst -4 è anche un biosensore per le sostanze chimiche xenobiotiche e ossidativo che attivano SKN-1 e può essere utilizzato per rilevare i bassi livelli di contaminanti quali acrilamide e il metilmercurio 15-16.

Una procedura per liquidi a base di coltura e distribuzione dei<em&gt; C. elegans</em&gt; Giornalista ceppi che esprimono proteine ​​fluorescenti è descritto che non richiede costose attrezzature di smistamento. Questo approccio può essere applicato a numerosi inducibile<em&gt; C. elegans</em&gt; Geni per la scoperta di nuovi farmaci o sensori biologici di contaminanti.

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Lo screening ad alta produttività (HTS) è un approccio potente per l'identificazione di modulatori chimici dei processi biologici. Tuttavia, molti composti identificati in...

Questo video illustra un metodo per coltivare e distribuire ceppi fluorescenti di CL gans per lo screening ad alto rendimento di librerie chimiche o per la rilevazione di contaminanti ambientali, al fine di valutare l'effetto di agenti chimici o ambientali sull'attività di proteine specifiche. In CL elgan, le colture batteriche vengono inizialmente preparate come fonte alimentare per i vermi e per i vermi transgenici GFP. I vermi sincronizzati vengono coltivati.Da 0,5 a 2 milioni di vermi vengono quindi raccolti, lavati e distribuiti in 3 piastre microtitolazione da 84 pozzetti, quindi vengono aggiunte molecole di piccole dimensioni da una libreria chimica o campioni di prova come acqua, cibo o suolo. Infine, la fluorescenza dei vermi viene misurata mediante un lettore di micropiastre.L'analisi dei dati delle intensità di fluorescenza rivela piccole molecole che modulano vie di trascrizione induttibili o consente la rilevazione di contaminanti ambientali. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi in vitro e quelli basati su colture cellulari, è che non si perderà tempo con composti tossici o inattivi in vivo. Questo metodo ad alto rendimen

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Fonte: Ali, I., et al. Screening ad alto rendimento di isolati microbici con impatto sulla salute di Caenorhabditis elegans . J. Vis. Esp. (2022)Questo video mostra un saggio fluorescente ad alta produttività per valutare come i batteri intestinali influenzino la resilienza allo stress in Caenorhabditis elegans. Tracciando la fluorescenza blu dei granuli intestinali rotti, il test rivela segnali di morte precedenti nei vermi esposti ai batteri testati.

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Viene descritto un protocollo per il rilevamento in vivo degli effetti degli inibitori mitocondriali nell'organismo modello Caenorhabditis elegans e per l'identificazione di potenziali composti potenzianti. Questo protocollo può essere utilizzato per lo screening di librerie di farmaci alla ricerca di composti che modulano la funzione mitocondriale.

Un Screenable<em&gt; In Vivo</em&gt; Saggio per mitocondriale modulatori Uso Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Qui descriviamo un protocollo semplice per produrre rapidamente centinaia di agar media di crescita del nematode, piastre di coltura 96 pozzetti con un numero consistente di Caenorhhabditis elegans per pozzetto. Queste culture sono utili per lo screening fenotipico di interi organismi. Qui ci concentriamo sull'utilizzo di queste culture ai prodotti chimici schermo per effetti di pro-longevità.

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Qui descriviamo un protocollo che è un host adattabile, intero, strumento di screening ad alto contenuto che possa essere utilizzata per studiare le interazioni ospite-patogeno ed essere utilizzato per la scoperta di nuovi farmaci.

Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l'analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell'embriogenesi.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

I microbi intestinali possono avere un impatto positivo o negativo sulla salute del loro ospite attraverso meccanismi specifici o conservati. Caenorhabditis elegans è una comoda piattaforma per lo screening di tali microbi. Il presente protocollo descrive lo screening ad alto rendimento di 48 isolati batterici per l'impatto sulla resistenza allo stress dei nematodi, utilizzati come proxy per la salute dei vermi.

Screening ad alta produttività di isolati microbici con impatto sulla salute di Caenorhabditis elegans

Qui forniamo istruzioni su come utilizzare efficacemente SegElegans, un sistema di deep learning che abbiamo sviluppato per la segmentazione automatizzata di singoli vermi in immagini di microscopia a campo largo, per il successivo utilizzo in software di analisi delle immagini come ImageJ. Forniamo modi per utilizzare il sistema sia online che offline.

Analisi automatizzata delle immagini a fluorescenza di C. elegans utilizzando SegElegans

Scopri lo screening ad alto rendimento e la biopercezione con ceppi fluorescenti di C. elegans. Questo metodo consente di rilevare in vivo contaminanti ambientali e modulatori di vie trascrizionali inducibili.

High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

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