High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

Questo video mostra un metodo per la coltura e la dispensazione di ceppi fluorescenti di CL gan per lo screening ad alta produttività di librerie chimiche o la rilevazione di contaminanti ambientali per valutare l'effetto di agenti chimici o ambientali su specifiche attività proteiche. Nella CL elgan, le colture batteriche vengono preparate per la prima volta come cibo per i vermi e GFP transgenica. I worm sincronizzati vengono coltivati.

Da 0,5 a 2 milioni di vermi vengono quindi raccolti, lavati e distribuiti in 3 84. Ai vermi vengono aggiunte piastre per microtitolazione del pozzo, quindi piccole molecole da una libreria chimica o campioni di prova come acqua, cibo o terreno. Infine, la fluorescenza dei vermi viene misurata con un lettore di micropiastre.

L'analisi dei dati delle intensità di fluorescenza rivela piccole molecole che modulano le vie trascrizionali inducibili o consentono la rilevazione di contaminanti ambientali. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi in vitro e basati su colture cellulari, è che non si spreca tempo con composti tossici o inattivi in vivo. Questo metodo ad alto rendimento può aiutare a identificare piccole molecole che modulano diversi percorsi inducibili.

Sebbene abbiamo sviluppato questo metodo per lo screening ad alto rendimento di librerie di piccole molecole, può essere applicato anche al biorilevamento di contaminanti in campioni alimentari e ambientali. A dimostrare la procedura saranno Andrew Dine, un tecnico del mio laboratorio e Q, un postdoc del mio laboratorio. Prepara in anticipo il cibo per vermi batterici.

Inizia inoculando 500 millilitri di brodo formidabile, integrato con 50 microgrammi per millilitro di streptomicina con cinque millilitri di e coli saturi. OP 50. Metti la coltura su uno shaker e fai crescere per una notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, dividere la coltura in 10 provette da 50 millilitri. Quindi mettere le provette in una centrifuga refrigerata e centrifugare a 2.500 RCF per 20 minuti. Dopo la centrifuga Resus, sospendere ogni pellet batterico in 10 millilitri di terreno di crescita di nematodi liquidi o NGM.

Agitare le sospensioni orizzontalmente. Uno scuotipavimento per 15 minuti per risospendere i batteri. Quindi, centrifugare la coltura batterica a 2.500 RCF a quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Decantare l'NGM e pesare il pellet batterico. Quindi aggiungere un volume uguale di tampone NGM e risospendere i pellet mediante vortex. Infine, aliquotare tre millilitri di coltura batterica risospesa in provette da 15 millilitri e conservarle a meno 20 gradi Celsius fino a quando non saranno necessarie.

In questa dimostrazione, l'effetto del prestito Xeno Duke che induce stress sul fattore di trascrizione Sskn uno sarà misurato come esempio. Sskn one è noto per attivare geni citoprotettivi durante lo stress ossidativo e xenobi. Viene preparata una coltura su larga scala della linea di geni Trenchgenic VP 5 96, che trasporta due costrutti fluorescenti.

I worm VP 5 96 esprimono sia il GST quattro promotori che guidano la GFP, che viene utilizzato per monitorare l'attività del fattore di trascrizione. Sskn uno e il DOP tre promotore di guida. La RFP viene utilizzata come standard per la normalizzazione del numero di worm.

Il DOP 3 è il promotore di un recettore della dopamina ed è espresso costitutivamente nei neuroni di tutto il corpo. Nell'esempio, dato lo xenobi lon attiva fortemente sskn one e aumenta la quantità di GFP espressa dal promotore GS T four per preparare le colture iniziando combinando 150 millilitri di tampone N NGM, 1,5 millilitri di LB 150, microlitri di colesterolo un molare e 75 microlitri di 100 milligrammi per millilitro. Streptomicina. L'aggiunta del LB aiuta a prevenire che i vermi si attacchino alla vetreria e alla plastica, ma questa quantità non è sufficiente per sostenere la crescita batterica.

Filtrare per sterilizzare il composto, quindi trasferirlo in un pallone sterile da un litro e mettere da parte il pallone per rilasciare le uova dai vermi adulti GR. Lavare i batteri dai vermi centrifugandoli e sostituendo il terreno NGM fino a quando il supinato non è limpido. Lavare i vermi una seconda volta con Resus sospendendoli nuovamente in centrifuga di acqua sterile dopo la centrifuga.

Rimuovere il supinato e riempire il tubo con 3,75 millilitri di acqua sterile. Aggiungere un millilitro di candeggina domestica e 250 microlitri di 10 idrossido di sodio normale mescolati immediatamente per inversione da cinque a sei volte. Posizionare il tubo in un rotatore dopo che i vermi sono stati esposti alla candeggina per quattro minuti.

Posizionare il tubo sotto uno stereomicroscopio. La maggior parte degli adulti dovrebbe essere una bugia. Agitare energicamente la provetta da 15 a 20 volte per aiutare a deporre eventuali vermi adulti rimasti dopo che la lisi si è verificata per un totale di cinque minuti, aggiungere acqua sterile fino a quando la provetta non è piena.

Mescolare per inversione cinque o sei volte per raccogliere le uova. Centrifugare la provetta per un minuto a 500 RCF. Lavate le uova tre volte da Resus, piegandole in 10 millilitri di acqua sterile, centrifugandole ed eliminando il supinato.

Successivamente, diluire un campione da 100 microlitri di uova 100 volte aggiungendo 10 millilitri di tampone NGM. Quindi pipettare al microscopio tre aliquote da cinque microlitri sul coperchio di una capsula di Petri. Conta il numero di uova in tre aliquote separate da cinque microlitri.

Per stimare il numero totale di uova. Aggiungere da 200.000 a 2 milioni di uova al pallone con il tampone NGM e agitare la coltura a 100 giri/min a 20 gradi Celsius. Almeno 16 ore dopo che le uova sono state aggiunte al pallone, utilizzare una pipetta sierologica sterile per rimuovere circa 0,5 millilitri della coltura di vermi in sospensione.

Pipettare tre gocce da cinque microlitri sul coperchio sterile di una capsula di Petri. Metti il coperchio in un congelatore a meno 20 gradi per uno o due minuti per paralizzare i vermi una volta che i vermi sono stati paralizzati. Conta il numero medio di vermi vivi nati per cinque microlitri con uno stereomicroscopio per stimare il numero totale.

Scongelare la coltura batterica OP 50 congelata preparata in precedenza ponendola su un banco per alcuni minuti. Quindi aggiungere tre millilitri di 50% OP 50 per 500.000 vermi schiusi. Agitare il pallone a 100 giri/min a 20 gradi Celsius.

I vermi si svilupperanno in L quattro larve e giovani adulti in circa 51 ore. Monitorare la quantità di batteri durante l'incubazione mediante ispezione visiva. Aggiungi altri batteri se il terreno diventa trasparente.

Utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire circa 0,5 millilitri di coltura di vermi in sospensione su una piastra di agar NGM standard. Guarda i vermi con uno stereomicroscopio per assicurarti che la maggior parte siano L quattro larve e giovani adulti al microscopio a campo chiaro, L quattro larve avranno una macchia ventrale chiara al centro del corpo. I giovani adulti saranno leggermente più grandi e non avranno una macchia chiara.

Quindi, estrarre la coltura di vermi in provette sterili da 50 millilitri. Posizionare le provette in un rack per provette nel cofano e lasciare che si depositino le uova non schiuse o i vermi che non si sviluppano. Si depositano più lentamente rispetto ai vermi sviluppati.

Dopo 10 minuti, rimuovere il supinato, che contiene vermi non schiusi e non sviluppati mediante aspirazione a circa 10 millilitri di tampone NGM per ogni pellet e sospendere i vermi facendo roteare delicatamente i tubi. Raccogli tutti i vermi in un unico tubo da 50 millilitri. Girare la centrifuga a secchio oscillante a 500 RCF per 30 secondi.

Quindi risospendere i vermi in 50 millilitri di NGM con 1% di libbra per lavarli. Ripeti l'operazione, lava tre o quattro volte per rimuovere i batteri dopo il lavaggio. Riempire la provetta con NGM più tampone LB fino a 50 millilitri.

Versalo in un pallone di erogazione di vermi personalizzato su una barra di agitazione e posizionalo su una piastra di agitazione. È necessario un minimo di circa 20 millilitri o 60.000 vermi per riempire lo spazio morto nel pallone di erogazione e nella cassetta dell'erogatore. Conta il numero di vermi in tre gocce da cinque microlitri come mostrato in precedenza.

Dopo aver contato a NGM più LB a una concentrazione di 12-15 vermi per goccia da cinque microlitri, ogni piastra da 3 84 pozzetti richiede circa 35.000 vermi o 11,5 millilitri di vermi sospesi. Caricare una cassetta di erogazione da 10 microlitri nell'erogatore e sterilizzarla adescandola con etanolo al 70%. Sciacquare l'etanolo adescandolo con acqua sterile.

Inserire l'estremità della cassetta di erogazione nel pallone in modo che si trovi appena sopra l'ancoretta senza interromperne il movimento. Assicurarsi che i vermi rimangano sospesi in tutto il pallone. Programmare l'erogatore per erogare le viti a bassa velocità con due pre impulsi di adescamento ed eseguire almeno 10 millilitri di vermi sospesi.

Riempire rapidamente le piastre di microtitolazione, che dovrebbero già contenere i composti di prova per evitare che i vermi si depositino nel tubo. Qui è necessario il composto di prova precedentemente caricato sulla piastra di microtitolazione. Ardore. Sigillare le piastre con nastro traspirante per evitare che la polvere si accumuli nei pozzetti.

Posizionare le piastre su una piattaforma di agitazione in un'incubatrice alla temperatura appropriata per il saggio. Non impilare le piastre in quanto ciò può limitare il flusso d'aria. Posizionare la piastra target in un lettore di micropiastre per misurare l'intensità di fluorescenza di ciascun pozzetto con le lunghezze d'onda di emissione ed eccitazione appropriate.

I filtri utilizzati per la GFP sono di eccitazione a 4 85 e di emissione a 5 28. I filtri per RFP sono di eccitazione a cinque 40 e di emissione a cinque 90. Dopo aver letto la piastra, calcolare il rapporto tra GFP e RFP e normalizzare con le letture dei pozzetti di controllo, che non contengono il composto attivante, per determinare l'esatta differenza di piegatura dell'intensità di fluorescenza derivata dai singoli trattamenti.

Il test SSKN one mostrato qui utilizza un doppio rapporto cromosomicamente integrato, un ceppo quando i vermi sono stati contati manualmente con uno stereomicroscopio. Il numero di vermi era correlato al volume dispensato con un valore R al quadrato di 0,94 e un valore p inferiore a 0,0001. Ciò indica che il numero di vermi erogati in ciascun pozzetto può essere controllato regolando il volume erogato.

La fluorescenza GFP totale per pozzetto mostrata a sinistra e la fluorescenza RFP per pozzetto mostrata a destra è altamente riproducibile da pozzetto a pozzetto su una piastra da 3 84 pozzetti in queste figure. XS indica la fluorescenza relativa misurata in ciascun pozzetto. Le linee continue indicano le medie e le linee tratteggiate indicano tre deviazioni standard al di sopra o al di sotto della fluorescenza media di tutti i pozzetti con un coefficiente di variazione inferiore al 9%Come mostrato in questa figura, la fluorescenza GFP dal promotore GST quattro è correlata linearmente alla fluorescenza RFP dal promotore DOP tre in 3 84 pozzetti con un valore R al quadrato di 0,62 e un valore p inferiore a 0,0001.

Pertanto, il reporter RFP non inducibile può essere utilizzato per normalizzare l'inducibile. Giornalista di GFP. Quando esprime un rapporto tra GFP e RFP, la fluorescenza diventa altamente riproducibile da pozzetto a pozzetto su una piastra da 3 84 pozzetti.

Il calcolo del rapporto tra GFP e RFP ha ridotto il coefficiente di variazione al di sotto del 6%, dimostrando la capacità del reporter RFP a tre promotori DOP di ridurre la variabilità come mostrato qui. L'induzione di GFP rispetto a RFP con uno SK N uno che attiva xenobiotici è robusta e altamente riproducibile su una piastra da 3 84 pozzetti, i rapporti medi di fluorescenza relativa di tutti i pozzetti di controllo e GLO sono contrassegnati da linee continue. Tre deviazioni standard al di sopra della media di controllo e al di sotto della media dlo sono contrassegnate da linee tratteggiate.

Una volta padroneggiato, l'avvio di una coltura di vermi può essere effettuato circa un'ora il primo giorno e la raccolta e l'erogazione. Un worms può essere fatto circa due ore se fatto correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di iniziare con almeno 60.000 vermi e tenerli sospesi durante l'erogazione, seguendo questa procedura è possibile eseguire schermate con altre, ad esempio, stringhe di rapporto per altri percorsi inducibili al fine di sviluppare modulatori per altri percorsi Dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nel campo dello screening ad alto rendimento e del biorilevamento per identificare rapidamente i modulatori del percorso di piccole molecole o rilevare contaminanti ambientali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare, erogare e misurare i ceppi elegan fluorescenti per lo screening ad alto rendimento se percorsi trascrizionali inducibili o per testare più campioni alla ricerca di contaminanti ambientali.