Un metodo per Lineage Tracing di cellule corneali Utilizzando multicolori topi reporter fluorescente

L'obiettivo generale di questo metodo è localizzare e seguire la migrazione, l'espansione e la sopravvivenza delle cellule staminali e delle cellule progenitrici nell'epitelio corneale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare dell'epitelio corneale riguardo l'omeostasi, la riparazione del tessuto, l'invecchiamento e la patologia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice da stabilire e permette un tracciamento non invasivo delle linee cellulari in maniera clonale.

Per iniziare, selezionare innanzitutto una linea di topi transgenici Cree con un promotore inducibile e specifico per tessuto per etichettare le cellule progenitrici e le cellule staminali dell'epitelio limbale e corneale. Viene utilizzata la linea K14 Cree ERT inducibile con tamoxifene. Successivamente, scegliere la cassetta brainbow appropriata in base alla domanda di ricerca e alla linea Cree disponibile.

In questo caso, viene utilizzata la linea Brainbow 2.1. Incrociare la linea R 26 R confetti omozigote con la linea K 14 Cree ERT omozigote per generare topi con cellule positive per K 14 di quattro colori. Per indurre la ricombinazione nei topi transgenici, pesare innanzitutto 80 milligrammi di Tamoxifene e scioglierli in un millilitro di olio di mais mediante vortex.

Posizionare la soluzione in un bagnomaria agitato, mantenuto a 65 gradi Celsius fino a quando non si sarà completamente disciolta, e lasciarla nel bagnomaria fino all'uso successivo per l'anestesia. Utilizzare un topo eterozigote Brainbow 2.1 Cree ERT di otto settimane di età e verificare attentamente la profondità dell'anestesia mediante il test della pressione sulle dita dei piedi; applicare quindi 100 microlitri della soluzione di Tamoxifene su ciascuna superficie oculare del topo. L'applicazione diretta di Tamoxifene garantisce un'elevata efficienza nell'induzione di Cree. Conservare qualsiasi soluzione residua di Tamoxifene al riparo dalla luce a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana.

Riscaldare la soluzione prima dell'applicazione, che viene ripetuta per tre giorni consecutivi per ogni topo. Sciogliere innanzitutto un grammo di polvere di Tamoxifene in cinque millilitri di dimetilsulfossido sterile. Per ottenere una soluzione da 200 milligrammi per millilitro, porre la soluzione in un bagno d'acqua agitato, mantenuto a 65 gradi Celsius finché non diventa limpida, e lasciarla nel bagno fino all'uso.

Quindi anestetizzare il topo e verificare la profondità dell'anestesia mediante una pinzatura del dito del piede, applicare un unguento oculare sull'occhio non trattato del topo per proteggerlo dalla disidratazione durante l'intervento e somministrare un adeguato analgesico. Successivamente, aspirare 200 microlitri della soluzione di Tamoxifene in una siringa senza alcun ago applicato e applicarla topicamente su tutta la cornea dell'occhio. Il liquido si solidifica sui tessuti a temperatura ambiente.

Assistere il topo fino a quando mantiene una posizione sterno-abdominale e restituirlo al gruppo solo quando è completamente cosciente. Dopo l'eutanasia dei topi nei punti temporali appropriati successivi all'induzione, effettuare un trauma oculare come descritto nel protocollo testuale. Espellere l'occhio premendo innanzitutto la palpebra per far uscire il bulbo oculare dalla cavità orbitaria.

Fare scivolare le pinze curve dietro il bulbo oculare per trattenere il nervo ottico e sollevare il bulbo oculare per staccarlo. Posizionare ogni bulbo oculare in una piastra da 60 millimetri contenente PBS. Posizionare la piastra con l'occhio sotto un microscopio stereoscopico chirurgico.

Assicurarsi di riconoscere la struttura di base dell'occhio, la cornea, il limbo e il nervo ottico. Rimuovere il nervo ottico, i muscoli e il tessuto connettivo intorno all'occhio. Tenere l'occhio nella parte posteriore con la cornea rivolta verso il basso ed effettuare un'incisione nella sclera nella parte posteriore del bulbo oculare utilizzando forbici a molla.

Allargare l'incisione per permettere al cristallino di fuoriuscire e rimuovere l'iride con pinzette. Successivamente, eseguire quattro o cinque incisioni radiali tagliando dal centro verso la periferia per appiattire la cornea, quindi rimuovere eventuali residui di iride con una spatola sottile e piatta. Infine, tagliare il tessuto periferico in eccesso intorno al limbo per fissare la cornea.

Trasferire il tessuto dissezionato in una piastra a 12 pozzetti e incubarlo in paraformaldeide al 4% per 10 minuti. Lavare quindi brevemente il tessuto in PBS per colorare i nuclei cellulari. Incubare la cornea in una soluzione di DPI a due microgrammi per millilitro per 10 minuti, seguita da un breve lavaggio in PBS.

Successivamente, posizionare la cornea su un vetrino con il lato epiteliale rivolto verso l'alto. Quindi aggiungere una goccia di mezzo di montaggio sulla cornea e coprirla con un coprioggetto. Lasciare asciugare i vetrini tutta la notte a temperatura ambiente e conservarli a quattro gradi Celsius.

Per l'imaging della cornea, utilizzare un sistema confocale a spettro che consenta la separazione delle emissioni di R-F-P-Y-F-P-G-F-P e CFP. Impostare innanzitutto le lunghezze d'onda di fluorescenza, eccitazione e emissione in base alle proteine fluorescenti del cervello. Bo cassette, avendo cura di prevenire l'eccitazione incrociata o la sovrapposizione dei segnali di emissione.

Successivamente, acquisire immagini a mosaico per visualizzare l'intera cornea ad alta risoluzione. In questo caso, ottenere un array di 12 per 12 immagini in tutti e quattro i canali fluorescenti. Infine, unire le immagini per creare un linaggio composito.

Sono stati eseguiti esperimenti di tracciamento utilizzando topi R 26 R confetti per seguire il destino delle cellule progenitrici epiteliali limbali e corneali. In condizioni di stato stazionario, sono stati osservati piccoli gruppi di cellule fluorescenti 10 giorni dopo l'induzione, come previsto. Dopo quattro mesi, si sono sviluppati strie che si estendevano dal limbo al centro della cornea, suggerendo che le cellule migrano dal limbo per rigenerare la cornea a seguito di un danno corneale.

La migrazione dal limbo è avvenuta rapidamente, con lo sviluppo di ampie strisce limbiche entro sette giorni. Questo modello è utile per tracciare e studiare le cellule staminali e progenitrici corneali in diverse condizioni. Permetterà l'analisi dell'espansione clonale delle cellule, della loro sopravvivenza e migrazione in condizioni di stato stazionario e in condizioni di stress, come ferite, ustioni chimiche, mutazioni e altre in futuro.

Questo modello può essere utilizzato anche per analizzare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione corneale normale e patologica. Questa tecnica può contribuire alla comprensione di diverse condizioni patologiche come le distrofie corneali, le ustioni e il trauma corneale, oltre che alla valutazione dell'impatto di diversi trattamenti sulla rigenerazione corneale, sull'espansione cellulare e sulla migrazione.