Name: Un metodo per Lineage Tracing di cellule corneali Utilizzando multicolori topi reporter fluorescente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Scopri il tracciamento del lignaggio multicolore di cellule epiteliali corneali utilizzando topi R26R-Confetti. Questo metodo non invasivo permette di studiare la migrazione e la sopravvivenza delle cellule staminali in vivo.

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Etica Dichiarazione: In questo la cura degli animali e l&#39;uso sono stati studio conforme alla Dichiarazione ARVO per l&#39;uso di animali in Oftalmica e Vision Research. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal comitato etico locale. 1. Scegliere un Adatto Cre-ricombinasi Esprimendo ceppo di topi <ol><li> Fuori della grande varietà di Cre linee transgeniche disponibili per l&#39;acquisto e 26 a seconda del tessuto mirato ad indagare, scegliere un Cre ceppo topo transgenico in cui il gene ricombinasi Cre è controllato da un promotore che è specifico per il tessuto di interesse. Nel caso è necessario un controllo temporale, scegliere una linea di Cre inducibile. Nota: Abbiamo scelto il tamoxifene inducibile transgene K14-Cre ERT di etichettare specificamente epiteliali cellule staminali / progenitrici del limbus corneale e 24. Si noti che ci possono essere differenze tra i ceppi, come Di Girolamo e collaboratori hanno riportato la specificità limbare senza alcuna espressione corneale per la loro K14-Cre ERT 22. Un vantaggio di utilizzare inducibile topi Cre transgenici è che permette l&#39;induzione di lineage tracing in tempi versatili. </li></ol> 2. Scegliere un adatto Strain Br mouse <ol><li> Scegli la cassetta Br appropriata a seconda del quesito di ricerca ed è disponibile la linea 16,18,20 Cre. <ol><li> Se si utilizza un non-inducibile ceppo di topi Cre, scegli una cassetta Br che non consente continue inversioni di DNA / escissioni e dare luogo a prodotti dead-end (ad esempio Br1.0 o Br1.1) 16 quindi. </li></ol></li></ol> 3. Attraversare le linee transgeniche di Interesse <ol><li> Per il protocollo mostrato qui, attraversare il omozigote ceppo R26R-Confetti (Br2.1 / Br2.1) con l&#39;omozigote ceppo Cre ERT (Cre ERT / Cre ERT) per ottenere discendenti hemizygous (Br2.1 / +; Cre / +) che sono pronti per mono-allelica lineage tracing visto che tutti contengono un singolo allele Br2.1 e unsingolo allele Cre. Nota: per aumentare l&#39;efficienza di etichettatura, si potrebbe generare topi che contengono due alleli Cre (Br2.1 / +; Cre / Cre), mentre due alleli Br2.1 (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) sarebbe aumentare combinazioni di colore (come descritto in 22). </li></ol> Induzione 4. Cre-ricombinasi Nota: La somministrazione di Tamoxifene in questi esperimenti è stata effettuata mediante iniezione intraperitoneale al giorno, per la durata di 3-4 giorni, al fine di indurre la traslocazione di Cre ricombinasi ERT nel nucleo di limbare e corneale stelo basale K14-positive / progenitore cellule epiteliali. Il seguente protocollo può essere utilizzato per l&#39;iniezione di quattro topi. In alternativa, l&#39;applicazione topica di Tamoxifen alla superficie oculare produce maggiore efficienza. La soluzione Tamoxifen può essere conservata al buio a 4 ° C per una settimana. Riscaldare la soluzione prima dell&#39;uso. <ol><li> Pesare 100 mg di tamoxifene e sciogliere in 5 ml di olio di mais performare una / soluzione di tamoxifene ml 20 mg. </li><li> Iniettare 200 ul di soluzione di Tamoxifene (4 mg) per via intraperitoneale a 8 settimane di età topi per 3-4 giorni consecutivi. Nota: La soluzione Tamoxifene può essere tenuto al buio a 4 ° C per un massimo di una settimana. Riscaldare la soluzione prima dell&#39;uso. </li><li> Per applicazione topica: pesare 60 mg di tamoxifene e sciogliere in 1 ml di olio di mais per formare un / ml soluzione tamoxifene 60 mg. Vortex e impostare la soluzione in un bagno d&#39;acqua mantenuto a 65 ° C fino a quando diventa chiaro congedo nella vasca da bagno fino al momento dell&#39;uso. <ol><li> Applicare con cura 100 microlitri della soluzione di Tamoxifen a ciascuna superficie oculare del mouse. </li></ol></li></ol> 5. Preparazione del tessuto per l&#39;imaging <ol><li> Animali sacrificio con isoflurano (2% vaporizzati in ossigeno) anestesia (confermare il corretto anestesia dalla mancanza di riflessi), seguita da CO 2 inalazione a opportuni intervalli di tempo dopo Tamoxifene iniezione e collezionare il tessuto in questione. <ol><li> Per questi esperimenti, enucleare occhi nei seguenti punti temporali: 1, 4, 8, 12, e 16 settimane dopo l&#39;iniezione Tamoxifen. Raggiungere enucleazione utilizzando pinze curve. Premere le palpebre che causano il bulbo oculare a saltar fuori della cavità oculare. Posizionare la pinza dietro il bulbo oculare che tiene il nervo ottico. Tirare delicatamente il bulbo oculare e staccarlo. Nota: In questa fase, come descritto di seguito, i tessuti possono essere preparati per l&#39;analisi wholemount di cellule marcate. Sezioni di tessuto congelato regolari possono anche essere preparati, fissati in PFA e immaginata come descritto di seguito (vedere la sezione 6 e 22). </li></ol></li><li> Posizionare ciascun occhio in un piatto 60 mm riempita con PBS. </li><li> Sotto stereomicroscopio con pinze tenere l&#39;occhio vicino al nervo ottico con la cornea rivolto verso il basso e utilizzare un bisturi per rimuovere il nervo ottico, muscolo e tessuto connettivo e fare una piccola incisione nella parte posteriore dell&#39;occhio. </li><li> Utilizzando forbici primavera allargare attentamente latagliato lasciando la lente saltar fuori e rimuovere l&#39;iride con pinze. </li><li> Appiattire la cornea, rendendo 4-5 incisioni radiali a partire dal centro verso la periferia con un bisturi. </li><li> Utilizzare un bisturi per tagliare tessuti periferici in eccesso oltre il limbus. </li><li> Fissare cornee in PFA 4% per 10 minuti, poi brevemente lavarli con PBS. </li><li> Incubare campioni con DAPI per 10 minuti e lavare brevemente con PBS. </li><li> Cornee Montare su lastre di vetro con il lato rivolto verso l&#39;alto. Epiteliale Mettere una goccia di mezzo di montaggio sulla parte superiore della cornea e la copertura con una copertura in vetro. Lasciate asciugare i vetrini O / N in RT. Mantenere diapositive a 4 ° C. </li></ol> 6. Microscopia Confocale e analisi Imaging <ol><li> Utilizzare un sistema confocale spettrale che permette la separazione delle emissioni di YFP / GFP / CFP. Set di eccitazione e lunghezze d&#39;onda di emissione di fluorescenza in funzione delle proteine ​​fluorescenti della cassetta Br. Scegliere la lunghezza d&#39;onda di eccitazione più adatto per ogni proteina volta a croce minimizzareeccitazione. Scegliere gamme di emissione strette in modo da minimizzare la perdita di segnali da differenti proteine. <ol><li> Per la cassetta Br2.1, utilizzare la seguente istituito di eccitazione di fluorescenza (ex) ed emissione (em) come punto di partenza: DAPI - ex 405 nm / em 420-480 nm, CFP - ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm, e RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm. </li></ol></li><li> Per visualizzare le aree di tessuto di grandi dimensioni ad alta risoluzione, acquisire tegola imaging. Per i risultati mostrati in Figura 2A-B, l&#39;immagine intera cornea ottenendo una matrice di 12 x 12 immagini, cioè, acquisire 144 campi (512 x 512) con 4 canali fluorescenti in ogni campo. Raccogliere complessivamente 576 immagini e quindi unire. </li><li> Per esplorare la localizzazione delle celle con tag in diverse profondità e delle strutture del tessuto, acquisire immagini Z-stack di diverse regioni di interesse. Per to l&#39;immagine intera profondità della cornea, acquisiscono 8 sezioni ottiche a 3 micron intervalli. Viste ortogonali delle sezioni raccolti, nonché proiezioni di immagini sulla base di intensità massime possono essere costruiti utilizzando software di imaging convenzionali 24. </li></ol> 7. corneale Lesioni combinato con Tamoxifene induzione <ol><li> Anestetizzare topi con isoflurano (2% vaporizzato in ossigeno) e amministrare analgesici (10 mg / kg Carpofen, iniettati per via sottocutanea). Verificare il corretto anestesia da non responsività ai piedi-pizzico. </li><li> Pesare 1 g di polvere Tamoxifene e sciogliere in 5 ml di DMSO sterile per produrre 200 mg / ml soluzione a concentrazione. </li><li> Riscaldare la soluzione Tamoxifen a 65 ° C in un bagno d&#39;acqua finché la soluzione diventa chiara. Mantenere la soluzione nella vasca fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Applicare pomata occhio all&#39;occhio controlaterale non trattato per prevenire la disidratazione durante l&#39;anestesia. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente concoscienza per mantenere decubito sternale. Non restituire i topi che avevano subito l&#39;occhio ferito alla compagnia di altri topi fino alla completa guarigione. I topi devono essere attentamente monitorati dopo l&#39;infortunio. In caso perde più del 10% del loro peso corporeo, soffrono di erosione corneale, o disagio, l&#39;esperimento deve essere interrotto. Somministrazione ripetuta analgesici ogni 24 ore durante l&#39;intero esperimento. </li><li> Utilizzando una siringa sterile, senza ago attaccato; applicare 200 microlitri soluzione Tamoxifen topicamente sull&#39;intera superficie della cornea di un occhio di ciascun topo. Nota: La soluzione liquida solidifica rapidamente sulla superficie dell&#39;occhio a temperatura ambiente. L&#39;effetto della lesione corneale dipende dalla gravità della ferita. Dopo un&#39;applicazione di soluzione Tamoxifen / DMSO effetti negativi si riscontrano nei topi. In caso di applicazioni ripetute può osservare opacità corneale. </li><li> Continuare con preparazione dei tessuti e delle immagini (vedi sezioni 5 e 6) in punti di tempo. pertinenti Per i risultati mostrati qui, sacrificano i topi (come descritto nella fase 5.1), uno settimana dopo ferimento (Figura 2 e 24). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sono stati condotti esperimenti lineage tracing per molti anni. I recenti miglioramenti tecnologici e l&#39;emergere di ceppi di topi Confetti hanno aperto nuove strade per la ricerca. Oggi, i ricercatori possono beneficiare di un gran numero di linee disponibili in commercio Cre tessuto-specifici, topi knockout e topi transgenici. Questo offre l&#39;opportunità per la progettazione di sistemi versatili sperimentali per affrontare questioni scientifiche con competenze di base, evitando la pratica laboriosa, fornendo i dati robuste e affidabili. Topi R26R-Confetti sono uno strumento elegante per il monitoraggio efficiente e studiare la natura e il comportamento di cellule in un organismo vivente. Il sistema è facile da stabilire e permette non invasivo lineage tracing di singole cellule durante l&#39;embriogenesi, la rigenerazione delle cellule staminali sotto l&#39;omeostasi, o in circostanze diverse, come lesioni, infiammazione e cancro. I dati ottenibili fornisce una robusta descriptione della sopravvivenza delle cellule bersaglio, espansione clonale delle cellule e la migrazione delle cellule, in modo quantificabile. Un passo fondamentale sarebbe quello di scegliere il ceppo di topi genetica appropriata che può permettere in modo affidabile un&#39;etichettatura specifica tessuto efficiente in fase di sviluppo preciso. Una limitazione di questo sistema è che per il monitoraggio di un organismo vivente, il tessuto deve essere accessibile e trasparente. Allo stesso modo, il monitoraggio di un tessuto spesso all&#39;interno di un animale vivente può essere facilitata solo da due fotoni o la microscopia multi-fotone. Tuttavia, il monitoraggio delle cellule è possibile in sezioni di tessuto post mortem e forse il tessuto intatto può essere studiato dopo che è stato trasformato per diventare trasparente dal metodo CLARITY 32,33. Un&#39;altra limitazione è da considerare che, sebbene celle adiacenti che esprimono la stessa fluoroforo probabile appartengono alla stessa stirpe clonale, è anche possibile che essi possono essere derivati ​​da cellule di origine indipendente che esprime in modo casuale lo stesso gene fluorescente. Questo Possibility diventa molto improbabile quando si utilizzano più alleli Br per consentire numerose combinazioni di colore. In futuro, combinando il sistema di Confetti con strumenti genetici disponibili (vale a dire, ad eliminazione diretta, i modelli knockin e topi transgenici) permetterà lo studio dei geni e delle loro mutazioni in materia di salute e patologia. Allo stesso modo, il lignaggio tracciando sotto diverse perturbazioni di sistema (ad esempio, nicchia staminale distruzione, laser mediata l&#39;ablazione delle cellule, il trattamento farmacologico) porterà nuove conoscenze sul coinvolgimento di vie di segnalazione nelle decisioni destino cellulare. In ultima analisi, l&#39;uso combinatorio di etichettatura fluorescente e bioluminescenza, reporter genetici di vie di segnalazione e di taglio microscopia bordo fornirà ai ricercatori un sistema robusto per imparare come le cellule unico rispondere alle loro circostante nel loro ambiente nativo.

Durante lo sviluppo embrionale, dei tessuti e degli organi morfogenesi avvengono attraverso un programma preciso che può essere descritto in termini di proliferazione cellulare, la migrazione delle cellule e le specifiche lignaggio 1-4. Questi processi biologici sono anche coinvolti nel mantenimento dell&#39;omeostasi tessuti adulti, che richiede la rigenerazione delle cellule staminali. Lineage tracing, l&#39;identificazione e il monitoraggio della progenie di un tipo specifico di popolazione di cellule, fornisce un importante strumento per lo studio embriogenesi e staminali omeostasi cellulare. Infatti, è sempre più utilizzato in molti settori della ricerca. In particolare, il lignaggio tracciato è diventato uno strumento essenziale per identificare l&#39;origine e il destino delle cellule staminali in omeostasi e sviluppo del cancro. Questo è perché può fornire informazioni essenziali su come la cella si comporta nel contesto del tessuto intatto o organismo, con il minimo intervento sperimentale, in contrasto con l&#39;isolamento delle cellule e in coltura o transplantati vitroil che può provocare distorsioni indesiderate. Tradizionalmente, i coloranti, come liposolubile carbocyanine, che incorporano nella membrana plasmatica delle cellule, sono stati utilizzati per lignaggio tracciamento. Sebbene questi tipi di esperimenti hanno portato con successo a importanti scoperte e concetti seminali sagomati in biologia dello sviluppo 5,6, hanno alcune limitazioni, tra cui la difficoltà di controllare la specificità di cellule bersaglio, l&#39;impatto indesiderato del colorante sul comportamento delle cellule e la diluizione dell&#39;etichetta nel tempo. Approcci di etichettatura analogo nucleotidico hanno permesso che documenta l&#39;esistenza di slow-cycling &quot;label mantenendo celle&quot; che presumibilmente corrispondono a cellule staminali quiescenti 7,8. Tuttavia, mentre questa tecnica può dimostrare la presenza di cellule proliferanti lenti basati sulla cinetica di proliferazione in un periodo di tempo limitato non potrebbe fornire indicazioni sostanziali sulla funzionalità delle cellule staminali. Un ottimale meth lineage tracingmeto- dovrebbe minimizzare l&#39;effetto dell&#39;etichettatura sulle proprietà della cella sensibile, la sua progenie o suoi vicini. Inoltre, sarebbe utile avere controllo sull&#39;induzione etichettatura, cioè, avere la possibilità di codificare la popolazione di cellule in una fase e modo dipendente tempo così come in una singola cella (clonale) modo. Un metodo di etichettatura stabile ed irreversibile che viene trasmesso a tutta la progenie della cellula fondatore è importante in modo che l&#39;etichetta sarebbe mantenuta nel tempo, e non trasferito in cellule vicine. Più di recente, sono stati sviluppati approcci genetici di marcatura delle cellule. In questi sistemi, promotori specifici cellulari possono essere utilizzati per attivare l&#39;espressione ricombinasi Cre per rimuovere un blocco stradale loxP-fiancheggiato e permettere l&#39;espressione di geni reporter come proteina fluorescente verde o Β-galattosidasi geni reporter 9-13. Questo approccio permette non solo il monitoraggio delle cellule e la loro progenie, ma permette anche di cella èolation e caratterizzazione molecolare. Inseguimento cellulare a livello di singola cellula diventato possibile per induzione dell&#39;espressione di un singolo gene reporter fluorescente. Una importante limitazione di questo sistema è il fatto che solo quando molto bassa percentuale di cellule è etichettato è possibile separare e tracciare singoli cloni. Per superare questa limitazione giornalisti multicolori possono essere utilizzati. Quando si utilizza l&#39;etichettatura multicolore, il monitoraggio del destino differenziale di cellule vicine nella stessa nicchia può essere raggiunto in modo efficiente 14-17. Recentemente, una varietà di Brainbow (Br) alleli sono stati sviluppati per lineage tracing esperimenti, consentendo una espressione stocastico di molteplici geni reporter fluorescenti che utilizzano il sistema Cre / lox. Il sistema Cre / lox costituito dalla ricombinasi enzima Cre, che riconosce e si lega a specifiche sequenze di DNA come i siti loxP. In seguito al legame di Cre ricombinasi, si verifica la ricombinazione sito specifico, che provoca la rimozione di loxP affiancato sequenze resulting nell&#39;espressione casuale di proteine ​​fluorescenti differenti (il meccanismo è descritto di seguito). Una varietà di linee Br sono disponibili per l&#39;uso (vedi recensioni 16,18,19). Le principali differenze tra i ceppi Br includono (i) differenze nel numero di geni fluorescenti inclusi nella cassetta, che vanno dal 2 (Br 2.0), 3 (Br1.0) a 4 (Br1.1, Br2.1) geni fluorescenti , (ii) la presenza di siti lox reciprocamente orientati per consentire l&#39;inversione gene (Br2.0-2.1), (iii) il tipo di siti lox utilizzati, e (iv) l&#39;espressione o il silenzio dell&#39;espressione genica fluorescenti prima dell&#39;attivazione Cre. BR3 recentemente costituito offre un metodo perfezionato per l&#39;imaging di neuroni multicolore. Una delle caratteristiche principali di questa trascrizione è che contiene un nuovo insieme di proteine ​​fotostabili farnesylated fluorescenti, che permettono anche una colorazione dei migliori neuronale processi 20. È importante sottolineare che diverse versioni di cassette Br possono contenere la specifica neuronale Thy1 promoter o il ubiquitariamente espresso CAG (CMV) promotore. Infine, mentre alcuni dei topi transgenici Br può contenere un singolo transgene Br, altri possono consistere di più copie del transgene, consentendo in tal modo la produzione di un numero immenso di possibilità di combinazioni cromatiche essere espresso in ciascuna cella (per esempio vedi 16). Nel nostro studio, abbiamo usato il mouse R26R-coriandoli, che contiene la cassetta 21 Fr. 2.1. Br2.1 è unicamente progettato per consentire inversioni DNA Cre-mediati e non solo escissioni causa dell&#39;orientamento reciproco dei siti loxP (Figura 1). Così, questi eventi di inversione / escissione che portano al cambiamento di colore possono continuare fino a quando è presente 16 Cre. Per questo motivo, un temporale sistema di espressione inducibile Cre è essenziale per il monitoraggio delle cellule affidabile utilizzando Br2.1. Come mostrato in figura. 1, il Br2.1 contiene un promotore CAG onnipresente seguito da loxP-fiancheggiato Neo R -cassette, che agisce come un posto di blocco trascrizionale, che è seguito da 4 geni fluorescenti giornalista, codifica per il verde (GFP), giallo (YFP), rosso (RFP) e ciano (PCP) proteine ​​fluorescenti, posizionati in due tandem. Nessuna fluorescenza si esprime prima dell&#39;attivazione Cre. Induzione di ricombinasi Cre provoca la rimozione della cassetta Neo-R consente l&#39;espressione casuale di una delle proteine ​​fluorescenti 4 in una data cellula. Il primo segmento contiene GFP loxP-fiancheggiato e YFP invertita, mentre il secondo segmento contiene RFP loxP-fiancheggiato e CFP invertita. Questi segmenti di DNA possono essere invertiti in continuo (con loxP che sia in orientamento inverso), o asportato, purché Cre ricombinasi è presente. Pertanto, deve essere utilizzato un transgene Cre transitoria e controllato. La cassetta Br2.1 fornisce un ottimo sistema per distinguere tra le emissioni che si sovrappongono su di posizione del segnale: l&#39;espressione di YFP e RFP è citoplasmatica, la GFP è nucleare e la PCP è legato alla membrana cellulare. GFPe le emissioni di RFP sono facilmente separati da microscopia a fluorescenza convenzionali. Al fine di separare le emissioni di YFP / GFP / CFP, è necessario un sistema di imaging confocale spettrale. Complessivamente, la cassetta Br2.1 permette casuale, inducibile, e il tessuto specifica espressione di uno su quattro geni fluorescenti distinti in ogni cella di destinazione. Infatti, quando è necessario un maggior numero di combinazioni di colori, è possibile generare topi omozigoti che contengono 2 alleli di Br2.1, conseguente espressione di 2 tag colore per ogni cella e aumentare il numero delle possibili combinazioni di colori a 10 22. Alcuni ceppi di topi Br consentono l&#39;espressione di un numero molto maggiore di possibili combinazioni di colori dal più copie della cassetta sono stati integrati nel loro genoma 16. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, le quattro combinazioni di colori forniti da un singolo allele Br2.1 sono sufficienti. Seguendo il protocollo fornito qui, si può stabilire questo metodo che utilizza un relativamente semplice messa a punto di spectrAl microscopio con poca o nessuna necessità di calibrazione. Qui forniamo un protocollo adattabile per l&#39;uso dei topi R26R-Confetti che contengono un singolo allele Br2.1, per lineage tracing esperimenti dell&#39;epitelio corneale. Questo ceppo di topo transgenico è stato utilizzato per studiare l&#39;origine e il destino dei due punti 21,23 e le cellule staminali epiteliali corneali 22,24, la presenza di attività delle cellule staminali nel cancro intestinale 25, e per la caratterizzazione podocita rene in glomerulosclerosi focale segmentale (FSGS) 17.

<table><tbody><tr><td>R26R-Confetti topi transgenici omozigoti per la cassetta Brainbow 2.1</td><td>ceppo Jackson</td><td>#013731</td><td></td></tr><tr><td>K14-CreERT topi</td><td>Jackson</td><td>ceppo #005107</td><td></td></tr><tr><td>tamoxifene</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano USP Terrell</td><td>Piramal Critical Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprieve 30</td><td>b.wt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>utilizzato a concentrazione di 4&#160; &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Immu Mount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 Sistema confocale a scansione laser Meta agganciato ad un microscopio motorizzato invertito (Axiovert 200M) dotato di tavolino motorizzato</td><td>Zeiss</td><td></td><td>La sovrapposizione spettrale tra GFP, YFP e CFG richiede l'utilizzo dell'imaging spettrale che permette la separazione degli spettri di emissione delle proteine fluorescenti. Qui utilizziamo il microscopio confocale metaspettrale Zeiss LSM 510. Il rivelatore Meta incluso in questo sistema ha 32 elementi rivelatori ciascuno che raccoglie l'emissione da una banda d'onda di 10 nanometri. Questa tecnica, denominata "impronta digitale spettrale", consente all'utente di impostare i limiti più adeguati per il filtraggio della banda d'onda. Esiste una varietà di sistemi confocali spettrali che possono essere utilizzati, tra cui Leica SP5 (rif. #21), SP8, Zeiss LSM 780 (rif. #22).</td></tr><tr><td>Zen 2009 Software di imaging</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duratears-unguento per gli occhi</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo per lineage tracing di cellule corneali utilizzando multicolori topi reporter fluorescente

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Gli esperimenti di tracciamento del lignaggio definiscono l'origine, il destino e il comportamento delle cellule in un tessuto o organismo specifico. Questa tecnica è stata applicata con successo per molti decenni, rivelando risultati fondamentali nella biologia dello sviluppo. Più recentemente, è stato adottato dai biologi delle cellule staminali per identificare e tracciare diverse popolazioni di cellule staminali con un intervento sperimentale minimo. I recenti sviluppi nella genetica dei topi, la disponibilità di un gran numero di ceppi di topi e i progressi nella microscopia a fluorescenza consentono la progettazione semplice di potenti sistemi di tracciamento del lignaggio per vari tessuti con competenze di base, utilizzando strumenti disponibili in commercio. Di recente abbiamo sfruttato questa potente metodologia per esplorare l'origine e il destino delle cellule staminali sulla superficie oculare utilizzando il topo R26R-Confetti. Questo modello offre un sistema genetico multicolore, per l'espressione di 4 geni fluorescenti in modo casuale. Qui descriviamo i principi di questa metodologia e forniamo un protocollo adattabile per la progettazione di esperimenti di tracciamento del lignaggio; specifico per l'epitelio corneale e per altri tessuti.

Recentemente, abbiamo puntato a individuare l&#39;origine, la sopravvivenza e la migrazione delle cellule staminali e cellule progenitrici dell&#39;epitelio corneale 24. Accumulare prova sostiene il dogma che l&#39;epitelio corneale viene rigenerato dalle cellule staminali si trovano esclusivamente nella nicchia limbare, una zona a forma di anello alla periferia della cornea. Questa teoria è supportata da in vitro e in vivo dei dati, e da evidenze cliniche che ha fornito la base per la riuscita pionieristica terapia con cellule staminali limbari 27-29. Tuttavia, questo argomento è rimasto molto dibattuto negli ultimi anni a causa di uno studio basato su esperimenti di innesto limbari che suggerivano che il limbo del mouse non partecipa rinnovamento corneale 30. Per verificare questa ipotesi interessante, lineage tracing esperimenti con i topi sono stati effettuati R26R-Confetti, a seguire il destino delle cellule epiteliali staminali / progenitrici del limbus corneale e in condizioni stazionarie per un massimo di 120 giorni 24.Gli occhi erano enucleato e-montaggio piatte cornee sono stati analizzati con confocale spettrale microscopia a scansione laser a fluorescenza 10 e 120 giorni dopo l&#39;iniezione Tamoxifene. Come previsto, piccoli gruppi sporadici di cellule fluorescenti sono state osservate su tutta la superficie oculare 10 giorni dopo l&#39;iniezione, mentre 1-4 mesi (Figura 2B e 24), striature allungate che si estendono dal limbus verso il centro corneale lentamente sviluppati. Questo risultato suggerisce che la cornea viene rigenerato dalle cellule che migrano dal limbus verso il centro della cornea. Successivamente, la rigenerazione della cornea in condizioni ferendone è stato esaminato. Al fine di testare il destino delle cellule corneali / limbari K14-positivi in ​​condizioni ferendone mentre induce il monitoraggio delle cellule efficiente, abbiamo sciolto il Tamoxifene in dimetilsolfossido (DMSO), che causa lesioni alla cornea su applicazione topica. In questo modo siamo riusciti a indurre ferimento lieve se una singola applicazione topica è stato applicato (Figura 2C), mo<html> declassare ferendo se ulteriore trattamento solo DMSO è stato applicato il giorno prima dell&#39;induzione Tamoxifene o grave ferita quando DMSO da solo è stato applicato localmente in 2 giorni consecutivi prima dell&#39;induzione Tamoxifen. In contrasto con le strisce limbari sottili che lentamente sviluppate e hanno raggiunto il centro della cornea entro 4 mesi in condizioni di stato stazionario, la migrazione delle cellule dopo un trauma è stato rapido. Sorprendentemente, strisce lunghe e spesse limbari sono stati già sviluppati in queste condizioni entro 7 giorni. È interessante notare che, diversità di colore a volte era minimo (Figura 2D). Nelle nostre mani, di tanto in tanto, soprattutto i globuli rossi sono stati identificati in tutto cornea, che indica che la diversità di colore può essere sbilanciato verso fluorofori specifici. Questo pregiudizio indesiderata può essere calibrato con test dose-risposta come riportato in precedenza in Br1.0L 31 e in Br2.1 21. les / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Illustrazione schematica del costrutto R26R-Confetti. (A) Il costrutto R26R-coriandoli contiene un promotore CAG per elevati livelli di espressione, un loxP (triangolo nero) -flanked Neo R -roadblock e la cassetta Brainbow2.1 a livello del locus Rosa26 16,21. La cassetta Brainbow2.1 comprende due testa-coda dimeri loxP-fiancheggiato. Uno dimero costituito da proteine ​​nucleare localizzata verde fluorescente (GFP) e citoplasmatica proteina fluorescente giallo reverse-oriented (YFP, l&#39;orientamento invertito è designato - PFY). Il secondo dimero contiene RFP citoplasmatica e una proteina fluorescente ciano membrana-tethered reverse-oriented (PCP, l&#39;orientamento invertito è designato - PFC) 16. (B - E) In seguito all&#39;attivazione Cre-ricombinasi, possono verificarsi diversi eventi escissione e di inversione; possibili risultati sono exemplified in B - E. L&#39;attività Cre induce riassetto stocastica della cassetta che porta a rimozioni di geni e / o inversioni e quindi risultati nell&#39;espressione casuale di una delle quattro proteine ​​fluorescenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53370/53370fig2.jpg" /> Figura 2. Lignaggio corneale tracing sotto omeostasi e lesioni. R26R-coriandoli / topi K14-Cre sono stati iniettati con 4 mg di tamoxifene come descritto nel protocollo. Nel tempo indicato punti inviare induzione appiattito cornee sono stati ripresi (A - B). Ferimento corneale accoppiato con induzione Cre è stato ottenuto mediante applicazione topica di Tamoxifen disciolto in DMSO (C - D). Immagini ottenute MosaicoPavimenti e rivestimenti da multicanale microscopia confocale spettrale sono indicati (A - D). Nell&#39;omeostasi, strisce limbari radiali di cellule che migrano lento esteso tra il limbo e il centro della cornea. Queste strisce sviluppate lentamente, raggiungendo il centro della cornea in 4-5 mesi (B). Gruppi di cellule corneali erano evidenti e (frecce bianche, B). Per contro, le grandi striature limbari apparso in una sola settimana in condizioni ferendo (C). Un esempio di polarizzazione della diversità colore verso globuli rossi (D). Il confine limbare-corneale è annotata da una linea tratteggiata. Barra della scala è di 500 micron. Abbreviazioni: CFP, proteina fluorescente ciano; GFP, la proteina fluorescente verde; RFP, proteina fluorescente rosso; YFP, proteina fluorescente gialla. Questa cifra è stata modificata dal 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande</a>questa figura.

In questo articolo descriviamo i principi per progettare ed eseguire un esperimento di tracciamento del lignaggio multicolore utilizzando i topi R26R-Confetti. Forniamo un protocollo specifico per il tracciamento delle cellule epiteliali corneali che può essere modificato per altri tessuti di interesse.

Un metodo per Lineage Tracing di cellule corneali Utilizzando multicolori topi reporter fluorescente

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

L'obiettivo generale di questo metodo è localizzare e seguire la migrazione, l'espansione e la sopravvivenza delle cellule staminali e delle cellule progenitrici nell'epitelio corneale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare dell'epitelio corneale riguardo l'omeostasi, la riparazione del tessuto, l'invecchiamento e la patologia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice da stabilire e permette un tracciamento non invasivo delle linee cellulari in maniera clonale.Per iniziare, selezionare innanzitutto una linea di topi transgenici Cree con un promotore inducibile e specifico per tessuto per etichettare le cellule progenitrici e le cellule staminali dell'epitelio limbale e corneale. Viene utilizzata la linea K14 Cree ERT inducibile con tamoxifene. Successivamente, scegliere la cassetta brainbow appropriata in base alla domanda di ricerca e alla linea Cree disponibile.In questo caso, viene utilizzata la linea Brainbow 2.1. Incrociare la linea R 26 R confetti omozigote con la linea K 14 Cree ERT omozigote per generare topi con cellule positive per K 14 di quattro colori. Per indurre la ricombinazione nei topi transgenici, pesare innanzitutto 80 milligrammi di Tamoxifene e scioglierli in un millilitro di olio di mais mediante vortex.Posizionare la soluzione in un bagnomaria agitato, mantenuto a 65 gradi Celsius fino a quando non si sarà completamente disciolta, e lasciarla nel bagnomaria fino all'uso successivo per l'anestesia. Utilizzare un topo eterozigote Brainbow 2.1 Cree ERT di otto settimane di età e verificare attentamente la profondità dell'anestesia mediante il test della pressione sulle dita dei piedi; applicare quindi 100 microlitri della soluzione di Tamoxifene su ciascuna superficie oculare del topo. L'applicazione diretta di Tamoxifene garantisce un'elevata efficienza nell'induzione di Cree. Conservare qualsiasi soluzione residua di Tamoxifene al riparo dalla luce a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana.Riscaldare la soluzione prima dell'applicazione, che viene ripetuta per tre giorni consecutivi per ogni topo. Sciogliere innanzitutto un grammo di polvere di Tamoxifene in cinque millilitri di dimetilsulfossido sterile. Per ottenere una soluzione da 200 milligrammi per millilitro, porre la soluzione in un bagno d'acqua agitato, mantenuto a 65 gradi Celsius finché non diventa limpida, e lasciarla nel bagno fino all'uso.Quindi anestetizzare il topo e verificare la profondità dell'anestesia mediante una pinzatura del dito del piede, applicare un unguento oculare sull'occhio non trattato del topo per proteggerlo dalla disidratazione durante l'intervento e somministrare un adeguato analgesico. Successivamente, aspirare 200 microlitri della soluzione di Tamoxifene in una siringa senza alcun ago applicato e applicarla topicamente su tutta la cornea dell'occhio. Il liquido si solidifica sui tessuti a temperatura ambiente.Assistere il topo fino a quando mantiene una posizione sterno-abdominale e restituirlo al gruppo solo quando è completamente cosciente. Dopo l'eutanasia dei topi nei punti temporali appropriati successivi all'induzione, effettuare un trauma oculare come descritto nel protocollo testuale. Espellere l'occhio premendo innanzitutto la palpebra per far uscire il bulbo oculare dalla cavità orbitaria.Fare scivolare le pinze curve dietro il bulbo oculare per trattenere il nervo ottico e sollevare il bulbo oculare per staccarlo. Posizionare ogni bulbo oculare in una piastra da 60 millimetri contenente PBS. Posizionare la piastra con l'occhio sotto un microscopio stereoscopico chirurgico.Assicurarsi di riconoscere la struttura di base dell'occhio, la cornea, il limbo e il nervo ottico. Rimuovere il nervo ottico, i muscoli e il tessuto connettivo intorno all'occhio. Tenere l'occhio nella parte posteriore con la cornea rivolta verso il basso ed effettuare un'incisione nella sclera nella parte posteriore del bulbo oculare utilizzando forbici a molla.Allargare l'incisione per permettere al cristallino di fuoriuscire e rimuovere l'iride con pinzette. Successivamente, eseguire quattro o cinque incisioni radiali tagliando dal centro verso la periferia per appiattire la cornea, quindi rimuovere eventuali residui di iride con una spatola sottile e piatta. Infine, tagliare il tessuto periferico in eccesso intorno al limbo per fissare la cornea.Trasferire il tessuto dissezionato in una piastra a 12 pozzetti e incubarlo in paraformaldeide al 4% per 10 minuti. Lavare quindi brevemente il tessuto in PBS per colorare i nuclei cellulari. Incubare la cornea in una soluzione di DPI a due microgrammi per millilitro per 10 minuti, seguita da un breve lavaggio in PBS.Successivamente, posizionare la cornea su un vetrino con il lato epiteliale rivolto verso l'alto. Quindi aggiungere una goccia di mezzo di montaggio sulla cornea e coprirla con un coprioggetto. Lasciare asciugare i vetrini tutta la notte a temperatura ambiente e conservarli a quattro gradi Celsius.Per l'imaging della cornea, utilizzare un sistema confocale a spettro che consenta la separazione delle emissioni di R-F-P-Y-F-P-G-F-P e CFP. Impostare innanzitutto le lunghezze d'onda di fluorescenza, eccitazione e emissione in base alle proteine fluorescenti del cervello. Bo cassette, avendo cura di prevenire l'eccitazione incrociata o la sovrapposizione dei segnali di emissione.Successivamente, acquisire immagini a mosaico per visualizzare l'intera cornea ad alta risoluzione. In questo caso, ottenere un array di 12 per 12 immagini in tutti e quattro i canali fluorescenti. Infine, unire le immagini per creare un linaggio composito.Sono stati eseguiti esperimenti di tracciamento utilizzando topi R 26 R confetti per seguire il destino delle cellule progenitrici epiteliali limbali e corneali. In condizioni di stato stazionario, sono stati osservati piccoli gruppi di cellule fluorescenti 10 giorni dopo l'induzione, come previsto. Dopo quattro mesi, si sono sviluppati strie che si estendevano dal limbo al centro della cornea, suggerendo che le cellule migrano dal limbo per rigenerare la cornea a seguito di un danno corneale.La migrazione dal limbo è avvenuta rapidamente, con lo sviluppo di ampie strisce limbiche entro sette giorni. Questo modello è utile per tracciare e studiare le cellule staminali e progenitrici corneali in diverse condizioni. Permetterà l'analisi dell'espansione clonale delle cellule, della loro sopravvivenza e migrazione in condizioni di stato stazionario e in condizioni di stress, come ferite, ustioni chimiche, mutazioni e altre in futuro.Questo modello può essere utilizzato anche per analizzare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione corneale normale e patologica. Questa tecnica può contribuire alla comprensione di diverse condizioni patologiche come le distrofie corneali, le ustioni e il trauma corneale, oltre che alla valutazione dell'impatto di diversi trattamenti sulla rigenerazione corneale, sull'espansione cellulare e sulla migrazione.

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Qui sviluppiamo gli strumenti necessari...

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

Fonte: Laboissonniere, et. al. RNA-seq a singola cellula di sottoinsiemi definiti di cellule gangliari retiniche. J. Vis. Exp. (2017).  Questo video mostra una tecnica di tracciamento fluorescente per identificare i sottotipi di cellule gangliari retiniche (RGC) in una retina di topo transgenico. Il processo prevede il fissaggio della retina isolata in una camera di registrazione, il mantenimento della vitalità cellulare con perfusione ossigenata e il targeting di RGC marcate in fluorescenza...

Identificazione dei sottotipi di cellule gangliari retiniche di topo mediante tracciatura fluorescente

Organizzazione delle cellule di ossa cranio-facciali è stato a lungo ipotizzato ma mai visualizzato direttamente. Marcatura delle cellule Multi-spettrale e in vivo vivo   l'imaging consente di visualizzare il comportamento delle cellule dinamica mandibola zebrafish. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo di manipolare Zebrabow pesci transgenici e osservare direttamente intercalazione cellulare e cambiamenti morfologici di condrociti nella cartilagine di Meckel.

Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel

Descriviamo qui un modello di topo reporter transgenico per visualizzare le cellule produttrici di IL-22 all'interno di diversi tessuti di topo. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare la posizione di altre citochine o proteine secretarie nel topo.

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Qui, presentiamo un protocollo per una tecnica di etichettatura mosaico che permette la visualizzazione dei neuroni derivati ​​da una cellula progenitrice comune in due colori distinti. Questo facilita l'analisi lignaggio neurale con la capacità di singoli neuroni nascita aggiornamento e la funzione del gene studiando negli stessi neuroni di diversi individui.

Le analisi delle cellule lignaggio e studi la funzione del gene Impiegando doppi loco MARCM

Questo metodo descrive l'uso del modello murino R26R-Confetti (Coriandoli) per studiare i tessuti mineralizzati, coprendo tutte le fasi dalla strategia di allevamento all'acquisizione di immagini. Incluso è un protocollo generale che può essere applicato a tutti i tessuti molli e un protocollo modificato che può essere applicato ai tessuti mineralizzati.

Clonal Genetic Tracing utilizzando il mouse Corfetti per studiare i tessuti mineralizzati

Qui è presentata una piattaforma microscopica multifoto per l'imaging della superficie oculare del mouse vivo. Il mouse transgenico fluorescente consente la visualizzazione di nuclei cellulari, membrane cellulari, fibre nervose e capillari all'interno della superficie oculare. I segnali di seconda generazione armonica non lineari derivati da strutture collagenose forniscono immagini senza etichette per architetture tropiche.

Una piattaforma di microscopia multifoto personalizzata per l'imaging dal vivo di Mouse Cornea e Conjunctiva

Viene presentato un protocollo per eseguire il tracciamento del lignaggio e l'analisi genetica funzionale dei geni candidati a livello di singola cellula utilizzando l'analisi del mosaico con doppi marcatori (MADM). L'analisi clonale MADM fornisce un quadro quantitativo per misurare il comportamento proliferativo, l'output cellulare e la relazione di lignaggio dei singoli progenitori e delle loro cellule figlie.

Tracciamento del lignaggio e analisi clonale nello sviluppo della Corteccia cerebrale utilizzando l'analisi mosaica con doppi marcatori (MADM)

La capacità di marcare in modo permanente le cellule staminali e la loro progenie con un fluoroforo utilizzando una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza.

Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

Qui proponiamo tre diversi metodi per danneggiare le fibre sensoriali che innervano la cornea. Questi metodi facilitano lo studio della rigenerazione degli assoni nei topi. Questi tre metodi, adattabili ad altri modelli animali, sono ideali per lo studio della fisiologia e della rigenerazione dell'innervazione corneale.

Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

Scopri il tracciamento del lignaggio multicolore di cellule epiteliali corneali utilizzando topi R26R-Confetti. Questo metodo non invasivo permette di studiare la migrazione e la sopravvivenza delle cellule staminali in vivo.

Un metodo per Lineage Tracing di cellule corneali Utilizzando multicolori topi reporter fluorescente

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