Un metodo per Lineage Tracing di cellule corneali Utilizzando multicolori topi reporter fluorescente

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di localizzare e tracciare la migrazione, l'espansione e la sopravvivenza delle cellule staminali e delle cellule progenitrici nell'epitelio corneale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule epiteliali corneali riguardanti l'omeostasi, la riparazione dei tessuti, l'invecchiamento e la patologia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da stabilire e consente il tracciamento non invasivo del lignaggio delle cellule in modo clonale.

Per iniziare, seleziona prima un ceppo di topo transgenico Cree con un promotore tessuto-specifico inducibile per marcare le cellule progenitrici epiteliali limbari e corneali e le cellule staminali. Viene utilizzata la linea Tamoxifen Inducible K 14 Cree ERT. Successivamente, scegli la cassetta brainbow appropriata in base alla domanda di ricerca e alla linea Cree disponibile.

In questo caso, viene utilizzata la linea Brainbow 2.1. Incrocia il ceppo omozigote di coriandoli R 26 R con il ceppo omozigote K 14 Cree ERT per generare topi con quattro cellule K 14 positive di colore per indurre la ricombinazione nei topi transgenici. Per prima cosa pesate 80 milligrammi di Tamoxifene e scioglietelo in un millilitro di olio di mais mediante Vortexing.

Mettere la soluzione in un bagnomaria agitante, mantenuto a 65 gradi Celsius fino a completa dissoluzione, e lasciarla nella vasca fino al successivo utilizzo dell'anestetizzazione. Un topo eterozigote Brainbow 2.1 Cree ERT di otto settimane e controllare la profondità dell'anestesia con il pizzico della punta applicare con cura 100 microlitri della soluzione di tamoxifene su ciascuna superficie oculare del topo. L'applicazione diretta del tamoxifene produce un'elevata efficienza dell'induzione Cree Conservare qualsiasi soluzione residua di tamoxifene protetta dalla luce a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana.

Riscaldare la soluzione prima dell'applicazione, che viene ripetuta per tre giorni consecutivi per ogni topo. Per prima cosa sciogliere un grammo di polvere di tamoxifene in cinque millilitri di dimetilsolfossido sterile. Per produrre una soluzione da 200 milligrammi per millilitro, mettere la soluzione in un bagno d'acqua agitante, mantenere i suoi 65 gradi Celsius fino a quando non diventa limpida e lasciarla nella vasca fino all'uso.

Quindi anestetizzare il topo e verificare la profondità dell'anestesia usando un pizzico per le dita dei piedi, applicare un unguento per gli occhi sull'occhio non trattato del topo per proteggerlo dalla disidratazione durante la procedura e somministrare analgesici adeguati. Quindi, aspirare 200 microlitri della soluzione di tamoxifene in una siringa senza alcun ago attaccato e applicarla localmente su tutta la cornea dell'occhio. Il liquido si solidifica sul tessuto a temperatura ambiente.

Prestare attenzione al topo fino a quando non mantiene la posizione sdraiata sternale e riportarlo in compagnia degli altri solo quando è pienamente cosciente. Dopo aver sacrificato i topi in momenti appropriati dopo l'induzione, una ferita all'occhio come descritto nel protocollo di testo. Nuclea l'occhio premendo prima la palpebra per estrarre il bulbo oculare dall'orbita.

Fai scorrere una pinza curva dietro il bulbo oculare per tenere il nervo ottico e tira il bulbo oculare verso l'alto per staccarlo. Metti ogni bulbo oculare in un piatto da 60 millimetri contenente PBS. Posizionare l'occhio contenente la piastra sotto uno stereomicroscopio operatorio.

Assicurati di riconoscere la struttura di base dell'occhio, la cornea, il limbus e il nervo ottico. Rimuovere il nervo ottico, i muscoli e il tessuto connettivo intorno all'occhio. Tenere l'occhio nella parte posteriore con la cornea rivolta verso il basso e praticare un'incisione nella sclera nella parte posteriore del bulbo oculare usando le forbici a molla.

Ingrandisci il taglio per consentire all'obiettivo di fuoriuscire e rimuovi l'iride con una pinza. Successivamente, praticare quattro o cinque incisioni radiali tagliando dal centro verso la periferia per appiattire la cornea e quindi rimuovere eventuali parti rimanenti dell'iride con una spatola sottile e piatta. Infine, tagliare il tessuto periferico in eccesso che circonda il limbus per fissare la cornea.

Trasferire il tessuto sezionato in una piastra a 12 pozzetti e incubarlo in para al 4% di formaldeide per 10 minuti. Quindi lavare brevemente il tessuto in PBS per colorare i nuclei cellulari. Incubare la cornea in due microgrammi per millilitro di soluzione DPI per 10 minuti, seguita da un breve lavaggio in PBS.

Quindi, posizionare la cornea su un vetrino con il lato epiteliale rivolto verso l'alto. Quindi posizionare una goccia di mezzo di montaggio sopra la cornea e coprirla con un vetrino coprioggetto. Lasciare asciugare i vetrini per una notte a temperatura ambiente e conservarli a quattro gradi Celsius.

Per l'imaging corneale, utilizzare un sistema confocale spettrale che consenta la separazione delle emissioni R-F-P-Y-F-P-G-F-P e CFP. Per prima cosa imposta le lunghezze d'onda di fluorescenza, eccitazione ed emissione a seconda delle proteine fluorescenti del cervello. Bo, avendo cura di evitare l'eccitazione incrociata o la sovrapposizione dei segnali di emissione.

Successivamente, acquisisci immagini affiancate per visualizzare l'intera cornea in alta risoluzione. Qui, ottieni una serie di immagini 12 per 12 in tutti e quattro i canali fluorescenti. Infine, unisci le immagini per creare un lignaggio composito.

Sono stati eseguiti esperimenti di tracciamento utilizzando topi coriandoli R 26 R per seguire il destino delle cellule progenitrici epiteliali limbari e corneali. In condizioni di stato stazionario, piccoli gruppi di cellule fluorescenti sono stati osservati 10 giorni dopo l'induzione, come previsto. Dopo quattro mesi, si sono sviluppate striature dal limbus al centro della cornea, suggerendo che le cellule migrano dal limbus per rigenerare la cornea dopo una lesione corneale.

La migrazione delle seghe dal limbus è avvenuta rapidamente con strisce limbari lunghe e spesse che si sono sviluppate entro sette giorni. Questo modello è prezioso per il monitoraggio e lo studio delle cellule staminali corneali e delle cellule progenitrici in diverse circostanze. Consentirà lo studio dell'espansione, della sopravvivenza e della migrazione delle cellule clonali in condizioni stazionarie e in condizioni di stress come ferite, mutazioni di ustioni chimiche e altro ancora in futuro.

Questo modello può anche essere utilizzato per sezionare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione corneale normale e patologica. Questa tecnica può contribuire alla comprensione di diverse condizioni patologiche come distrofie corneali, ustioni e traumi corneali, oltre alla valutazione dell'impatto di diversi trattamenti sulla rigenerazione corneale, sull'espansione cellulare e sulla migrazione.