Misurare risposte fisiologiche di Drosophila Neuroni sensoriali a Lipid feromoni utilizza Live Calcio Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le risposte fisiologiche dei neuroni gustativi di Drosophila ai feromoni lipidici. Questa tecnica può essere utilizzata per rispondere a domande chiave nella neurobiologia sensoriale, come l'identificazione dei ligandi per i recettori gustativi orfani. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le risposte dei singoli neuroni gustativi possono essere studiate in un animale vivo intatto.

Dopo aver anestetizzato la mosca, attaccala a un vetrino coprioggetti da 0,17 millimetri usando una piccolissima goccia di smalto trasparente. Attacca il lato della mosca allo scivolo usando l'intera caduta. Successivamente, al microscopio da dissezione, utilizzare un pennello bagnato per estendere una zampa anteriore della mosca.

Quindi, utilizzando due strisce di nastro adesivo molto sottili, fissare il primo e il quinto segmento tarsale al vetrino coprioggetto. Se i neuroni sulla proboscide devono essere visualizzati, posizionare un'altra sottile striscia di nastro adesivo sul rostro della proboscide per esporre il labello. Ora, crea un muro corto attorno alla mosca usando una penna PAP.

Lasciare che l'anestesia svanisca per mezz'ora prima di effettuare le misurazioni. Per questo protocollo, preparare le diluizioni necessarie della soluzione di legante madre da un milligrammo per millilitro, utilizzando PBST. Per iniziare la procedura, sovrapporre 10 microlitri di PBST sui segmenti tarsali fissati ed esposti.

Questo inumidisce la gamba e impedisce che vada fuori fuoco. Successivamente, mettere a fuoco i segmenti utilizzando un sistema ottico in grado di ottenere un buon segnale fluorescente con una rapida risoluzione temporale, come un microscopio confocale a disco rotante con una fotocamera sCMOS. Raccogli tre pile Z di prestimolazione dei neuroni di interesse nel segmento tarsale.

In questo esempio, le immagini vengono acquisite con esposizioni di 200 millisecondi e un binning due per due su una sezione di sei micron per mezzo micron ogni due secondi. Assicurati di ottimizzare la potenza del laser per ridurre al minimo lo sbiancamento delle foto, pur consentendo un elevato rapporto segnale/rumore. Qui, un laser a 491 nanometri da 100 milliwatt viene azionato al 30% di trasmissione.

Il segnale deve essere rilevabile prima della stimolazione ma non avvicinarsi alla saturazione. Ora, pipettare 10 microlitri di soluzione di stimolazione sul segmento tarsale di interesse. Durante il pipettaggio, fare molta attenzione a non toccare la zampa o qualsiasi parte del corpo della mosca, altrimenti i tarsi si sposteranno fuori posizione.

Quindi, acquisire immediatamente le prime immagini post-stimolazione e continuare a raccogliere immagini sufficienti per documentare la massima variazione della fluorescenza. Per l'analisi, aprire una serie di Z-stack confocali utilizzando il software di analisi ed elaborazione delle immagini Fiji o ImageJ. Effettua una proiezione dell'intensità della somma di tutte le sezioni Z per ciascuno dei punti temporali.

Qui ci sono sei fette e 120 punti temporali. Innanzitutto, seleziona l'opzione stack sotto l'immagine, quindi seleziona l'opzione Proiezione Z. Immettere uno per la sezione iniziale e quattro per la sezione finale.

Per il tipo di proiezione, immettere le sezioni di somma e selezionare tutti gli intervalli di tempo. Ora, definisci una regione di interesse, o ROI, come un corpo cellulare o una proiezione neuronale. Usa lo strumento di selezione a mano libera per disegnare intorno ai confini della struttura.

Quindi, fai clic sull'etichetta di analisi e seleziona l'opzione ROI manager in strumenti. Quantifica la fluorescenza del ROI selezionando prima l'opzione di impostazione delle misurazioni nel menu di analisi. Selezionare le caselle per la densità integrata, l'area, il valore medio e massimo di grigio e l'etichetta.

Quindi, seleziona l'opzione Altro nel menu Gestione ROI e scegli l'opzione multi-misura. Ora, calcola la variazione massima della fluorescenza per il punto temporale t. Per quantificare la fluorescenza post-stimolazione, misurare la densità integrata del ROI.

Per t uguale a zero, misurare la fluorescenza prestimolante dalle immagini prestimolo del ROI nello stesso modo. Calcola la media dei valori di tre immagini per questo t è uguale a zero. Per quantificare la fluorescenza di fondo, misurare la densità integrata da un'area di tessuto priva di neuroni rilevabili che ha le stesse dimensioni e forma del ROI.

Raccogli un valore di sfondo univoco per ogni punto temporale. L'indicatore di calcio GCamP è stato espresso utilizzando due diversi modelli di espressione di Gal4. Ogni modello etichetta una popolazione distinta di neuroni delle zampe anteriori e cellule di supporto non neuronali.

Per entrambi i modelli di espressione, sono state osservate risposte ligando-specifiche al feromone lipofilo CH503. La variazione relativa dell'intensità di fluorescenza del segnale GCamP è aumentata con concentrazioni più elevate di CH503. Curiosamente, una dose di cinque nanogrammi di CH503 può sopprimere la risposta neuronale.

Le risposte misurate dei neuroni Gr68a e ppk23 differivano. La risposta neuronale dei neuroni marcati con il driver Gal4 Gr68a ha mostrato un pattern tonico, mentre i neuroni ppk23 hanno mostrato una risposta oscillatoria fasica nella gamba. Nella proboscide, i neuroni ppk23 hanno mostrato una risposta tonica ad esordio tardivo dal corpo cellulare e una risposta oscillatoria da una proiezione assonale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare le risposte fisiologiche dei singoli neuroni gustativi ai feromoni lipidici e ad altri ligandi idrofobici. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia chemiosensoriale per misurare le risposte dei singoli neuroni gustativi in Drosophila melanogaster. Utilizzando questa tecnica, l'attività neuronale può essere silenziata o attivata utilizzando uno shibire a temperatura controllata o un transgene TRiP a-one accoppiando il microscopio a disco rotante a un incubatore a temperatura controllata.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in cinque minuti, escludendo il tempo impiegato dalla mosca per riprendersi dall'anestesia. Durante l'esecuzione di questo metodo, è importante fissare saldamente la mosca sul vetrino coprioggetti senza danneggiare la zampa anteriore. Durante l'imaging, è importante acquisire immagini non appena la zampa anteriore viene stimolata con una soluzione di feromoni.