Name: Misurare risposte fisiologiche di Drosophila Neuroni sensoriali a Lipid feromoni utilizza Live Calcio Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Impara a misurare le risposte fisiologiche dei neuroni gustativi di Drosophila ai feromoni lipidici mediante imaging del calcio in vivo. Questo metodo consente di studiare l'attività neuronale in organismi intatti.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Singapore National Research Foundation (sovvenzione NRF-RF2010-06 a J.Y.Y.).

Preparazione 1. Esempio <ol><li> Attraversare la linea GAL4 3,22 conducente di UAS-GCaMP5G 19 mosche (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Lasciare che la croce di crescere a 25 ° C. Nota: Generazione vola con più copie dei transgeni GAL4 o UAS-GCaMP può aiutare a migliorare l&#39;intensità del segnale fluorescente. Una versione precedente del transgene UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) ha mostrato intensità di fluorescenza molto debole quando espresso sotto il controllo del pilota Gr68a-GAL4. <ol><li> Raccogliere e separati per sesso nuova eclosed mosche adulte ed aumentare a 25 ° C. Nota: il livello di base di GCaMP5G fluorescenza è ottimale in mosche di età compresa tra 14-28 giorni. Isolando le mosche per sesso preclude la possibilità di interazioni sociali che possono influenzare le risposte neurali. </li></ol></li><li> Anestetizzare una mosca sotto un flusso delicato di CO 2. </li><li> Fissare la Fmente ad un vetrino di vetro in primo luogo mettendo una piccola goccia di smalto al centro di un vetrino 0,17 millimetri. Delicatamente posizionare una mosca su un fianco sulla goccia di smalto trasparente e garantire che l&#39;intera goccia è coperto dalla mosca. </li><li> Eseguire i punti 1.5 e 1.6 sotto uno stereomicroscopio dissezione, utilizzato a 8X ingrandimento. </li><li> Utilizzare un pennello bagnato per estendere una zampa anteriore della mosca. Fissare la zampa anteriore in posizione posizionando due sottili strisce di nastro sopra primo e quinto segmenti tarso (Figura 2A). Questo esporrà segmenti tarsali T2-T4 per l&#39;imaging (Figura 2B). </li><li> Per neuroni immagine sulla proboscide, posizionare una sottile striscia di nastro adesivo sopra la tribuna della proboscide per esporre il labello (Figura 2C, D). </li><li> Disegnare una barriera idrofobica intorno al volo con una penna PAP per evitare che la soluzione di fluire sulla superficie coprioggetto. Effettuare misure entro 30 minuti di montaggio. </li></ol> 2. Preparazione di stimoloSoluzione <ol><li> Diluire ligandi lipofile (come CH503, utilizzato in questo studio) in una soluzione PBST: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 0,1% Triton X-100 (v / v ); pH 7.4. <ol><li> Fare un 1 mg / ml soluzione madre del legante con PBST. Preparare tutte le diluizioni successive della soluzione madre con PBST. Nota: A seconda della solubilità del ligando di interesse, solventi diversi possono essere necessari per sciogliere il ligando. La solubilità di CH503 in vari solventi sono descritte nella Tabella 1. A differenza di altri solventi, PBST non ha prodotto un aumento della fluorescenza. </li></ol></li></ol> 3. Stimolazione della Gustativo neuroni e Image Acquisition <ol><li> Utilizzando una pipetta 10 ml, versare 10 ml di PBST sui segmenti del tarso. Nota: Questo passaggio inumidisce la gamba ed evita i segmenti del tarso da deriva. </li><li> Utilizzare un sistema ottico che ha una fotocamera suvelocità sere sufficienti e la sensibilità per ottenere un buon segnale di fluorescenza ad alta risoluzione temporale. Nota: Per questo studio abbiamo utilizzato un microscopio confocale disco rotante e una fotocamera sCMOS (vedi Lista dei materiali). </li><li> Scegliere il segmento tarsale specifico e neuroni di essere ripreso. Acquisire tre pre-stimolazione confocale Z-stack. <ol><li> Idealmente, le impostazioni di acquisizione uso che sono abbastanza veloce per consentire la risoluzione tempo massimo, mentre ancora catturare l&#39;intero volume delle cellule. Impostazioni di acquisizione esempio sono: 200 msec esposizione, binning 2 x 2 e 6 x 0,5 micron 2 sezioni ottiche, catturate ogni 2 secondi. Nota: le gambe sono stati immobilizzati ripreso con successo per un massimo di 10 minuti, a intervalli di 30 secondi, con nessun imbianchimento discernibile del segnale GCaMP. Per i tempi di registrazione più lunghi, in modo che le gambe sono tenute molto saldamente in posizione sul vetrino. </li><li> Ottimizzare la potenza del laser per la massima segnale-rumore ottenibile con il minimo photobleaching durante l&#39;intero imaging regime. Per gli esperimenti descritti qui, utilizzare un 491 nm diodo laser (100 mW) al cambio del 30% per l&#39;imaging sia i neuroni Gr68a e ppk23 gustative sulle gambe e proboscide. Utilizzare 2 x 2 binning per consentire tempi di esposizione più brevi, pur ottenendo una risoluzione spaziale sufficiente. Nota: Le impostazioni di potenza laser sono stati ottimizzati per consentire il rilevamento di cambiamento fluorescente che vanno da un aumento 1.2- a 4,5 volte. </li></ol></li><li> Pipettare 10 ml di soluzione di stimolo sul segmenti del tarso. Per gli esperimenti di controllo, aggiungere altri 10 ml di PBST. acquisire subito 117 immagini post-stimolazione. Nota: Il numero di immagini post-stimolazione acquisiti si basa sulla quantità di tempo in cui si è raggiunto variazione massima della fluorescenza (circa 2 min). <ol><li> PUNTO CRITICO: Mentre pipettando soluzione sulla preparazione, non toccare il volo con la punta della pipetta dal momento che questo farà sì che la zampa anteriore per spostare fuori posizione. Nota: In alternativa, utilizzareun micromanipolatore per posizionare con precisione un capillare di vetro contenente stimolo vicino al segmento tarsale da acquisire. Fornire volumi controllati di stimolo utilizzando un distributore microiniezione intracellulare secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li></ol> 4. Image Processing and Analysis: quantificazione della risposta <ol><li> Aprire una serie di confocale Z-stack con Fiji ( <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 o ImageJ ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> software) analisi ed elaborazione di immagini 24. </li><li> Effettuare una proiezione somma intensità di tutti i sei fette Z per ciascuno dei 120 punti temporali. <ol><li> Selezionare l&#39;opzione &quot;stack&quot; sotto &quot;Immagine&quot;. Inoltre, selezionare l&#39;opzione &quot;proiezione Z&quot; e inserire &quot;1&quot; come la fetta di inizio e &quot;4&quot; come fetta di arresto. Per il tipo di proiezione, selezionare R20; fette somma &quot;dal menu a tendina e selezionare&quot; Tutte le strutture di tempo &quot;. </li></ol></li><li> Definire la regione di interesse (ROI) utilizzando lo strumento di selezione a mano libera per disegnare un confine intorno a un corpo cellulare o una proiezione neuronale. Fare clic sull&#39;etichetta &quot;Analizza&quot; e selezionare l&#39;opzione &quot;ROI manager&quot; sotto &quot;Strumenti&quot;. </li><li> Quantificare la fluorescenza della ROI selezionando l&#39;opzione &quot;Set misurazioni&quot;, sotto il menu &quot;Analizza&quot; e selezionando le caselle per la densità integrata, zona, media e massima valore di grigio e l&#39;etichetta. Quindi, selezionare l&#39;opzione &quot;Altro&quot; sotto il menu Gestione ROI e selezionare ulteriormente l&#39;opzione &quot;Multi misura&quot;. Nota: Questo genererà una scatola a finestra con valori per ciascuno dei parametri selezionati. </li><li> Controllare i valori massimi di grigio per assicurare che nessuno dei pixel hanno raggiunto la saturazione (ad esempio, 65.535 per una camera 16-bit). NOTA: Per gli esperimenti mostrato in tsuoi carta, le risposte sono state misurate sia da corpi cellulari neuronali o sporgenze, a seconda di dove è stato osservato l&#39;aumento massimo della Af / F. </li><li> Calcolare la variazione relativa massima della fluorescenza (Af / F) al punto di tempo t è il seguente: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol><li> Sottrarre sfondo di fluorescenza da ogni valore F (cella). Per quantificare fluorescenza di fondo, misurare la densità integrata di una ROI di forma e dimensioni equivalenti da un&#39;area dell&#39;arto anteriore (o proboscide) privo di neuroni rilevabili. </li><li> Per quantificare la post-stimolazione di fluorescenza, F (cella) t, misurare la densità integrata della ROI del corpo cellulare o di processo nel tempo punto &quot;t&quot; dopo la stimolazione. </li><li> Per quantificare la fluorescenza pre-stimolazione, F (cella) t = 0, analizzare immagini pre-stimolo del corpo cellulare o il processo nello stesso modo comeil segnale post-stimolazione. Utilizzare la densità media integrato di 3 immagini per determinare F (cella) t = 0. </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano che non vi sono interessi finanziari concorrenti.

Descriviamo qui un metodo per eseguire l&#39;imaging del calcio live di Drosophila neuroni periferici in 2 diversi organi sensoriali. Il Ca 2+ -evoked risposte fluorescenti GCaMP in Gr68a-neuroni indotte dal ligando feromone CH503 erano dose-dipendente e quantitativa. E &#39;stato anche possibile distinguere diversi modelli di risposta neurale come la fasica e le risposte tonico. I neuroni che mostrano le risposte fasiche si ritiene di consentire un rapido adattamento agl...

Gli animali si basano su informazioni olfattive e gustative di mediare decisioni essenziali per la sopravvivenza e la riproduzione. Capire come spunti chemosensory vengono rilevati ed elaborati dal sistema nervoso richiede l&#39;identificazione del recettore sensoriale (s) e le corrispondenti leganti chimici. Drosophila rilevare una varietà impressionante di composti volatili e non volatili e sono un modello eccellente in cui studiare il fisiologico meccanismi sottostanti chemosensation. Mentre gli organi olfattivi percepiscono molecole volatili, gli organi gustativi sono specializzati per rilevare i composti a bassa volatilità. Qui, vi presentiamo un metodo per misurare direttamente le risposte neuronali dagli organi del gusto di Drosophila melanogaster a bassa volatilità, ligandi lipofile. organi gustativi della mosca sono le zampe anteriori, proboscide, e le ali. Distribuita sulla superficie degli organi gustative sono strutture simili a capelli noti come sensilla che rispondono al sugars, amari, sali, acqua e feromoni 8. Il sensilla sono stati classificati morfologicamente in setole di gusto e sapore pioli 9. Ci sono circa 31 setole gusto sul labello che sono classificati in lungo (tipo L), breve (s-type) e morfologie (I-tipo) intermedi. Casa sensilla 4 neuroni sensoriali &#39;L&#39; e &#39;S&#39; che rispondono fisiologicamente allo zucchero (la cella S), basso contenuto di sale (la cella L1), di sale e composti amari (la cella L2) e l&#39;acqua (la cellula W) 10 , 11. La &#39;i&#39; Casa 2 neuroni sensoriali sensilli, di cui uno risponde sia a basso contenuto di sale e zucchero, mentre l&#39;altro risponde ad alto sale 12. Ci sono circa 41 gusto sensilli nei maschi e 26 femmine sensilla in distribuite su ciascuno degli arti anteriori. Per entrambi i maschi e femmine, ci sono 21 sensilla sul midleg, e circa il 22 sensilla sul hindleg 13. I neuroni gustative racchiuse dalla sensilla gusto sulle gambe sono anche classified in tipi L1, L2, W e S. Un metodo standard per misurare l&#39;attività elettrica da singoli neuroni utilizza elettrodi extracellulari o intracellulari per registrare il flusso di ioni. Misure elettrodi permettono la funzione neuronale di essere studiato in organismi non modello, come specie Drosophila, falene, api e che mancano ampi strumenti genetici per l&#39;etichettatura neurale. Tuttavia, mentre i metodi elettrofisiologici sono stati utilizzati di routine per misurare l&#39;attività di Drosophila gusto sensilli 4,13,14, l&#39;applicazione di questo approccio presenta diverse sfide tecniche. In primo luogo, il gusto setole devono essere identificati sulla base di morfologia e posizione spaziale. Dopo l&#39;identificazione, misurazioni elettrofisiologiche possono essere ostacolate dalle piccole dimensioni del sensilli, accessibilità limitata a causa della posizione, e difficoltà nell&#39;applicare volumi controllati di uno stimolo chimico per un gusto setola. Inoltre, la stimolazione di sensilli può generare segnali da più di untipo neuronale 15. In secondo luogo, l&#39;individuazione di segnali elettrici può essere confuso con il rumore di fondo derivanti da vibrazioni meccaniche e rumori provenienti da apparecchiature elettroniche. In terzo luogo, l&#39;uso di un elettrodo affilata può danneggiare la preparazione mosca, se usato in modo errato 14. Infine, montaggio di un impianto di perforazione elettrofisiologia richiede componenti elettronici specializzati per la consegna stimolo, la registrazione del segnale e analisi dei dati e può essere costoso. In D. melanogaster, la disponibilità di strumenti geneticamente codificati ha facilitato lo sviluppo di tecniche di imaging che consentono le risposte di piccole popolazioni di neuroni da studiare. Un tale approccio è l&#39;uso del reporter CaLexA 16. In questo metodo, sequenze di geni codificanti il ​​fattore di trascrizione LexA-VP16 e NFAT proteina sensibile calcio sono fusi insieme. Attivazione di calcio della calcineurina proteina fosfatasi catalizza la de-fosforilazione di NFAT e, a sua volta, facilitaTES sua importazione nel nucleo. All&#39;interno del nucleo, il dominio LexA lega a un motivo di legame LexAop-DNA che dirige l&#39;espressione di una verde giornalista proteina fluorescente (GFP), permettendo così l&#39;identificazione sostenuta di neuroni funzionalmente attivati. L&#39;approccio è stato utilizzato con successo per misurare la risposta della specifica glomeruli olfattivi nel lobo antenne in seguito all&#39;esposizione di mosche dal vivo ad un odorizzante 16. Recentemente, le risposte fisiologiche di IR52c neuroni recettori gustativi sono stati misurati dalle mosche dal vivo utilizzando CaLexA 7. Tuttavia, per questo studio, è stato necessario mosche di età fino a 6 settimane per migliorare la trascrizione GFP. Mentre immunocolorazione con un anticorpo anti-GFP può essere utilizzato per amplificare il segnale CaLexA, questo metodo richiederebbe fissaggio del tessuto, precludendo così la possibilità per l&#39;imaging live-cell. Il GCaMP indicatore di proteine ​​calcio geneticamente codificato è anche stato ampiamente utilizzato per studiare le risposte neuronali in diversiSpecie 17. Il GCaMP proteina fluorescente con bassa intensità prima di stimolazione neuronale. L&#39;applicazione di uno stimolo innesca un potenziale d&#39;azione nel neurone, conseguente afflusso di Ca 2+. GCaMP, legato a Ca 2+, subisce un cambiamento conformazionale, provocando la fluorescenza con intensità luminosa (Figura 1). Un approccio di imaging del calcio singolo neurone sviluppato di recente è stato utilizzato per identificare il glucosio come legante per gli specifici neuroni gustative Gr61a zampa anteriore 18. In questo studio, gli arti anteriori sezionati da transgenici Drosophila che esprimono GCaMP nei neuroni gustative Gr61a erano coperti da uno strato di agarosio prima di imaging. Tuttavia, l&#39;uso di tessuto sezionato può causare eventuale carrellata di espressione GCaMP, limitando così il tempo di misura e la sensibilità di rilevazione. Inoltre, agarosio può limitare la sensibilità a causa di alti livelli di fondo di fluorescenza e le sue proprietà di diffusione della luce. To affrontare alcuni di questi inconvenienti, si descrive l&#39;utilizzo di immagini di calcio GCaMP-mediata per registrare le risposte fisiologiche di zampa anteriore e proboscide neuroni gustative di animali intatti. Noi mostriamo le risposte fisiologiche di Gr68a e neuroni che esprimono ppk23 geneticamente codificato GCaMP5G 19 per un lipide feromone Drosophila, (3 R, 11 Z, Z 19) -3-acetossi-11,19-octacosadien-1-olo (CH503) 20, 21. risposte neuronali sono misurati quantificando l&#39;aumento della fluorescenza del segnale GCaMP5G durante la stimolazione feromone. In questo protocollo, i neuroni vengono esposte per una durata totale di 120 secondi, che è sufficiente a differenziare pattern di attivazione neuronale in singole cellule.

<table><tbody><tr><td>Gr68a-Gal4</td><td></td><td></td><td>Regalo da H. Amrein (Texas A& M Health Science Center, TX, USA) e J. Carlson (Yale University, CT, USA)</td></tr><tr><td>ppk23-Gal4</td><td></td><td></td><td>Dono di K. Scott (Univ. della California, Berkeley, CA, USA)</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP5&nbsp;</td><td></td><td>42037</td><td>Bloomington Drosophila&nbsp; Stock Center</td></tr><tr><td>0,17 mm vetrino coprioggetto (Gold-Seal coverslip)</td><td>Servizi di microscopia elettronica</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>Smalto per unghie, "Hard as Nails Clear"&nbsp;</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP penna</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>Z377821</tr><tr><td>Pennello</td><td></td><td></td><td>a punta fine</td></tr><tr><td>Nastro adesivo&nbsp;</td><td>Marca</td><td></td><td></td>scozzese</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, grado da laboratorio</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Esano, grado HPLC</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>472301</tr><tr><td>Ricetta PBST</td><td></td><td></td><td>descritta nella sezione del protocollo</td></tr><tr><td>CH503</td><td></td><td></td><td>Sintesi descritta in Mori et al., 2010</td></tr><tr><td>Fotocamera sCMOS (ORCA Flash4.0)</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio (Ti-Eclipse)</td><td>Nikon</td><td>Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Scan Head&nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1 Aquistion</td><td></td></tr><tr><td>Software (MetaMorph Premier)</td><td>Molecular Devices</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>open source</td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td></tr></tbody></table>

misurare risposte fisiologiche di<em&gt; drosophila</em&gt; neuroni sensoriali a lipid feromoni utilizza live calcio imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

A differenza dei mammiferi, insetti come Drosophila hanno più organi del gusto. I neuroni chemosensoriali sulle gambe, proboscide, ali e ovipositor di Drosophila esprimono recettori gustativi 1,2, canali ionici 3-6, e recettori ionotropici 7 che sono coinvolti nella rilevazione di segnali sensoriali volatili e non volatili. Questi neuroni contattare direttamente tastants come il cibo, sostanze e feromoni influenzano nocivi e quindi molti comportamenti complessi come l&#39;alimentazione, la deposizione delle uova e l&#39;accoppiamento. registrazioni elettrodi e l&#39;imaging di calcio sono stati ampiamente utilizzati negli insetti per quantificare le risposte neuronali evocati da queste sostanze sapide. Tuttavia, elettrofisiologia richiede attrezzature specializzate e le misurazioni ottenere da un singolo sensillum gusto può essere tecnicamente impegnativo a seconda della cellula-tipo, le dimensioni e la posizione. Inoltre, la risoluzione neurone singolo in Drosophila può essere difficile da realizzare, poiché il gusto sensilla House più di un tipo di chemosensory neurone. Il metodo di imaging di calcio in diretta qui descritta permette risposte dei singoli neuroni gustative in mosche in tensione da misurare. Questo metodo è particolarmente adatto per l&#39;imaging risposte neuronali a feromoni lipidici e altri tipi di ligandi che hanno una bassa solubilità in solventi a base acquosa.

L&#39;indicatore di calcio GCaMP è stata geneticamente espressa utilizzando i driver ppk23-GAL4 Gr68a-GAL4 o. Distinte popolazioni di neuroni e cellule zampa anteriore di supporto non-neurali sono etichettati da ogni driver (Figura 3A-C). Risposte specifiche-ligando al CH503 feromone lipofila sono stati osservati in Gr68a-GAL4 e le cellule ppk23-GAL4 espressione GCaMP (Figura 3D). La variazione relativa di intensità di fluorescenza del segnale GCaMP5G...

Le zampe anteriori e la proboscide di Drosophila contengono un ricco repertorio di neuroni sensoriali gustativi. Qui, presentiamo un metodo che utilizza l'imaging del calcio per misurare le risposte fisiologiche dei neuroni sensoriali nella zampa anteriore e nella proboscide di moscerini vivi dopo l'applicazione esogena di un feromone gustativo.

Misurare risposte fisiologiche di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni sensoriali a Lipid feromoni utilizza Live Calcio Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le risposte fisiologiche dei neuroni gustativi di Drosophila ai feromoni lipidici. Questa tecnica può essere utilizzata per rispondere a domande fondamentali nella neurobiologia sensoriale, come l'identificazione dei ligandi per recettori gustativi orfani. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le risposte di singoli neuroni gustativi possono essere studiate in un animale intatto e vivo.Dopo aver anestetizzato la mosca, fissarla su un cover slip da 0,17 millimetri utilizzando una piccola goccia di smalto trasparente. Applicare la mosca lateralmente al vetrino utilizzando l'intera goccia. Successivamente, sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare un pennello umido per distendere una delle zampe anteriori della mosca.Quindi, utilizzando due strisce molto sottili di nastro adesivo, fissare il primo e il quinto segmento tarsale al vetrino. Se si devono acquisire immagini dei neuroni del proboiscide, posizionare un'altra striscia sottile di nastro sulla rostrum del proboiscide per esporre il labellum. A questo punto, creare una breve barriera intorno alla mosca utilizzando una penna PAP.Lasciare svanire l'anestesia per me

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Descriviamo una tecnica consolidata per misurare e analizzare i cattivi odori evocati risposte di calcio nel lobo antennale di...

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

Questo video descrive l'imaging del calcio in vivo nei neuroni di Drosophila utilizzando GCaMP. La clip del protocollo in primo piano mostra come registrare i cambiamenti nella fluorescenza GCaMP dai neuroni del corpo a fungo durante un esperimento di condizionamento olfattivo.

Drosophila In Vivo Imaging del calcio: un metodo per l'imaging funzionale dell'attività neuronale

Questo video dimostra un metodo per rilevare le risposte dei neuroni sensoriali in Drosophila utilizzando il legame del ligando e l'imaging a fluorescenza. I ligandi si legano ai recettori neuronali, causando l'afflusso di calcio. Il calcio si lega ai complessi indicatori, portando all'emissione di fluorescenza, che conferma la risposta neuronale al ligando.

Rilevamento delle risposte fisiologiche dai neuroni sensoriali in Drosophila

Questo video mostra un metodo per l'imaging del calcio in vivo utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente nei moscerini. Descrive i passaggi per preparare i moscerini per la microscopia, condurre il condizionamento olfattivo e visualizzare l'afflusso di calcio indotto dagli odori.

in vivo Imaging del calcio utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente in Drosophila melanogaster

Fonte: Ishimoto, H. et. Al., Imaging del calcio ex vivo per la visualizzazione delle risposte cerebrali alla segnalazione endocrina in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Questo video dimostra l'imaging del calcio da studiareDrosophila risposte cerebrali ai neuropeptidi. I neuroni che esprimono un indicatore fluorescente di calcio rivelano la dinamica intracellulare del calcio e le risposte funzionali alle molecole di segnalazione.

Imaging ex vivo del calcio per studiare le risposte cerebrali della Drosophila ai neuropeptidi

Questo articolo descrive un adattabile ex vivo protocollo per la visualizzazione Ca 2+ durante l'attivazione uovo in Drosophila.

Calcio Imaging in<em&gt; Drosophila</em&gt; All&#39;attivazione Egg

Questo articolo descrive un protocollo per l'ex vivo imaging del calcio del cervello di Drosophila . In questo metodo, composti naturali o sintetiche possono essere applicati il buffer per testare la loro capacità di attivare particolari neuroni nel cervello.

Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

Qui presentiamo un protocollo con il quale il calcio pre e/o postsinaptico può essere visualizzato nel contesto dell'apprendimento e della memoria della Drosophila. L'imaging di calcio in vivo che utilizza sensori di calcio localizzati sinapricamente viene combinato con un classico paradigma di condizionamento olfattivo in modo tale che la plasticità sinaptica alla base di questo tipo di apprendimento associativo può essere determinata.

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Un approccio di imaging del calcio consente la registrazione delle risposte indotte dal gusto nel cervello dei moscerini svegli mentre una soluzione viene applicata al labello. Le risposte gustative primarie in Drosophila melanogaster sono utilizzate come esempio, ma questo protocollo può essere adattato per studiare i neuroni a valle o altre specie.

In vivo Imaging del calcio delle risposte neurali indotte dal gusto nella Drosophila adulta

Presentiamo i protocolli di imaging del calcio per un neurone olfattivo larvale di Drosophila , utilizzando un adesivo tissutale topico per l'immobilizzazione. Questo metodo migliora la stabilità, facilitando esperimenti affidabili in vivo ed ex-vivo . Gli script R personalizzati analizzano i segnali del calcio, fornendo una piattaforma efficiente per la ricerca neurofisiologica dettagliata.

Imaging del calcio in vivo ed ex-vivo di un neurone del circuito olfattivo nella larva di Drosophila melanogaster di terzo stadio

Impara a misurare le risposte fisiologiche dei neuroni gustativi di Drosophila ai feromoni lipidici mediante imaging del calcio in vivo. Questo metodo consente di studiare l'attività neuronale in organismi intatti.

Misurare risposte fisiologiche di

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