Name: Sistemi modello di tessuto organotipico per lo studio delle interazioni ospite-patogeno in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Impara a utilizzare modelli organotipici di tessuto orale per studiare le interazioni ospite-patogeno in vitro. Questo metodo permette di analizzare le risposte infiammatorie e valutare nuove terapie antibiofilm.

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<table><tbody><tr><td>Dischi di idrossiapatite (HA) da 13 mm Plasma</td><td>Biotal Limited</td><td>n/a (su ordinazione)</td><td>Substrato per la formazione di biofilm orali, che imita la superficie del dente</td></tr><tr><td>Ago da 19 G (40 mm)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>613-2028</td><td>Utilizzato per facilitare la rimozione dei dischi HA dalle piastre e per ritagliare il tessuto dagli inserti</td></tr>: <tr><td>piastre per microtitolazione a fondo piatto trattate con TC a 24 pozzetti con coperchi&nbsp;</td><td>Forniture per Laboratorio Scientifico</td><td>3524 (confezione da 100)</td><td>Piastre per la coltura di biofilm ed esperimenti di co-coltura tissutale</td></tr><tr><td>Perle di vetro lavate con acido (425-600 &mu; m)</td><td>Merck: Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>Per la lisi tissutale per migliorare la resa dell'estrazione dell'RNA&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Actinomyces naeslundii DSM 17233&nbsp;</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>n/a</td><td>Uno dei microrganismi utilizzati per il modello di biofilm complesso</td></tr><tr><td>Bead Mill 24 Omogeneizzatore (o equivalente)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-163</td><td>Per la lisi dei tessuti per migliorare la resa dell'estrazione dell'RNA&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Bijoux&nbsp; (7 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>189170 (700 per sacchetto)</td><td>Utilizzato per la sonicazione del biofilm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di sintesi di cDNA (ad alta capacità)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368814 (per 200 reazioni)</td><td>Sintesi di cDNA da base di RNA tissutale</td></tr><tr><td>Columbia Blood Agar (CBA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CM0331B (per 500 grammi)</td><td>Utilizzato per preparare piastre CBA per la coltura di microrganismi aerobi</td></tr><tr><td>Sangue di cavallo defibrinato</td><td>E& O Laboratories</td><td>DHB</td><td>Utilizzato per integrare le piastre CBA e FAA per la coltura di microrganismi aerobici e anaerobici</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (dPBS: senza CaCl2 e MgCl2)</td><td>Merck: Sigma-Aldrich</td><td>DB537</td><td>dPBS per la co-coltura cellulare con biofilm sonicato</td></tr><tr><td>Fusobacterium nucleatum ATCC 10953</td><td>American Type Culture Collection</td><td>n/a</td><td>Uno dei microrganismi utilizzati per il modello di biofilm complesso</td></tr><tr><td>Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) vincentii DSM 19507</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>n/a</td><td>Uno dei microrganismi utilizzati per il modello di biofilm complesso</td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Versione 10)GraphPad</td> <td>Software, Inc</td><td>n/a</td><td>Per la creazione di grafici e l'analisi dei dati&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit ELISA per IL-8 umano (kit ELISA non rivestito con piastre)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>88-8086-86 (per test 10 x 96)</td><td>Kit ELISA e piastre per la valutazione delle proteine dei terreni tissutali esausti</td></tr><tr><td>Epitelio orale umano (HOE)&nbsp;</td><td>Episkin</td><td>n/a (su ordinazione)</td><td>Il tessuto epiteliale utilizzato per il sistema modello di co-coltura</td></tr><tr><td>Anse di inoculazione (monouso, 10 &; micro; L, o equivalente)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12870155 (confezione da 1000)</td><td>Per colture microbiologiche in terreni solidi e liquidi</td></tr><tr><td>Piastre qPCR a 96 pozzetti MicroAmp Fast Reaction (0,1 mL)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907 (per 10 piastre)</td><td>Per la profilazione dell'espressione genica qPCR dei tessuti</td></tr><tr><td>Microbank Diagnostics</td><td></td><td>PL.170</td><td>Conservazione e ciroconservazione di microrganismi&nbsp;</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9935 (10 x 1,5 mL)</td><td>Acqua di grado RT-PCR per esperimenti qPCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastre di Petri (90 mm)</td><td>Fisher Scientific (Sterilin)&nbsp;</td><td>11309283 (confezione da 500)</td><td>Utilizzato per la preparazione di piastre di agar per coltura microbica</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>18912014 (confezione da 100 compresse)</td><td>PBS per la standardizzazione dei microrganismi e le fasi di lavaggio del biofilm</td></tr><tr><td>Rneasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106 (per 250 reazioni)</td><td>Kit di estrazione dell'RNA su colonna per tessuti&nbsp;</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td><td>medio Merck: Sigma-Aldrich</td><td>R7755-10L (per 10 L)</td><td>Terreni per la coltura di biofilm&nbsp;</td></tr><tr><td>Array di profilatori RT2</td><td>Qiagen</td><td>330171 (su misura)</td><td>Array qPCR contenente primer già pronti per la profilazione dell'espressione genica</td></tr><tr><td>Base di agar anaerobo Schaedler</td><td>Merck: Sigma-Aldrich (Millipore)</td><td>91019 (per 500 g)</td><td>Utilizzato per preparare piastre di agar anaerobiche Fastdious&nbsp;</td></tr><tr><td>Schaedler brodo anaerobo</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>CM0497B (per 500 g)</td><td>Terreno liquido per la crescita di microrganismi anaerobi</td></tr><tr><td>Tubo O-Ring Beadbug con tappo a vite&nbsp;</td><td>Forniture per laboratorio scientifico</td><td>Z763837-1000EA (confezione da 1000)</td><td>Per l'uso nell'omogeneizzatore Bead Mill 24, per la lisi dei tessuti</td></tr><tr><td>Bagno di sonicazione</td><td>Fisher Scientific (Fisherbrand)</td><td>n/a</td><td>Per la sonicazione di biofilm da dischi HA&nbsp;</td></tr><tr><td>Streptococcus intermedius DSM 20753&nbsp;</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>n/a</td><td>Uno dei microrganismi utilizzati per il modello di biofilm complesso</td></tr><tr><td>Streptococcus mitis NCTC 12261</td><td>National Collection of Type Cultures</td><td>n/a</td><td>Uno dei microrganismi utilizzati per il modello di biofilm complesso</td></tr><tr><td>Streptococcus oralis NTCC 11427&nbsp;</td><td>Collezione Nazionale di Colture Tipo</td><td>n/a</td><td>Uno dei microrganismi utilizzati per il modello di biofilm complesso</td></tr><tr><td>SYBR-green (qPCRBIO, SyGreen Mix, Hi-ROX)</td><td>PCR Biosystems</td>, <td>PB20.12</td>, <td>SYBR-green mix per qPCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Brodo Todd Hewitt</td><td>Merck: Sigma-Aldrich</td><td>T1438&nbsp;</td><td>Terreni per la coltura di biofilm&nbsp;</td></tr><tr><td>Brodo di soia triptonico (TSB) medio</td><td>Merck: Sigma-Aldrich</td><td>22092 (per 500 g)</td><td>Terreno liquido per la crescita di microrganismi aerobici</td></tr><tr><td>Pinzette (150 mm, acciaio inossidabile, seghettato)</td><td>RS-Pro&nbsp;</td><td>545-187</td><td>Utilizzato per spostare dischi HA e inserti di tessuto/estratti di tessuto</td></tr><tr><td>Tubi universali (30 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>201150 (400 per sacchetto)</td><td>Recipienti per la coltura di microrganismi in coltura liquida&nbsp;</td></tr><tr><td>Veillonella dispar NCTC 11831</td><td>National Collection of Type Cultures</td><td>n/a'Uno</td> <td>dei microrganismi utilizzati per il complesso modello di biofilm</td></tr><tr><td>&beta;-metacaptoetanolo</td><td>Merck: Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>RNasi deactivation in tissue samples</td></tr></tbody></table>

sistemi modello di tessuto organotipico per lo studio delle interazioni ospite-patogeno in vitro

Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro

In questo esperimento, HOE è stato esposto a 7 specie di biofilm sonicato contenente l'organismo rappresentativo del passaggio dalla salute orale all'infiammazione delle gengive (nota come gengivite). Questa malattia deriva dall'infiammazione del tessuto epiteliale gengivale o orale a causa di perturbazioni microbiche dovute all'accumulo di placca dentale sulla superficie del dente. Dopo la stimolazione, il tessuto e i terreni esauriti vengono utilizzati per le analisi trascrizionali e proteomiche, come discusso in precedenza. Per questo esperimento, l'espressione genica di un pannello di biomarcatori infiammatori è stata rilevata nel tessuto dopo la stimolazione con biofilm sonicato (Figura 2). Ciò è stato ottenuto utilizzando un array di profilatori RT2 PCR personalizzato contenente 16 geni diversi e l'espressione genica è stata mostrata come variazione di piega rispetto al tessuto non stimolato in seguito alla normalizzazione del gene GAPDH. La stimolazione microbica ha aumentato l'espressione di tutti i geni ad eccezione di CXCL5, con differenze statistiche osservate per NFKB, CCL2, CXCL1, CXCL3, CSF2, CSF3, TNF, IL1A, IL1B e TLR4 (Figura 2A). La maggiore variazione di piega è stata osservata per CCL2, CXCL1 e CSF3, con aumenti rispettivamente di 16,9, 10,3 e 15,1 (Figura 2B).
I terreni HOE esauriti sono stati utilizzati per le analisi proteomiche per rilevare le proteine prodotte e rilasciate dal tessuto dopo la stimolazione. Questo è utile per determinare se l'espressione genica è correlata alla produzione di proteine. Per fare ciò, l'espressione genica di IL8 e il rilascio della proteina IL-8 sono stati valutati nel tessuto di controllo e nel tessuto stimolato con sonicazione del biofilm (Figura 3). L'espressione genica è stata valutata utilizzando la qPCR basata su SYBR-green con primer per IL8 e GAPDH come precedentemente descritto3. L'espressione dell'mRNA IL8 nell'HOE è aumentata di 8,67 volte dopo la stimolazione con biofilm sonicato (Figura 3A). A livello proteico, i livelli di IL-8 sono stati quantificati utilizzando un kit ELISA per IL-8. La concentrazione di IL-8 nei terreni esauriti è aumentata da ~1,005 ng/mL nel tessuto di controllo a ~4,245 ng/mL nel tessuto stimolato con sonicazione del biofilm (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67487/67487fig01.jpg"> 
Figura 1: Diverse applicazioni per modelli di co-coltura di tessuti organotipici. Sospensioni standardizzate di microrganismi vengono applicate direttamente al tessuto per studiare le interazioni specie-ospite (A). Questi sono spesso utilizzati per valutare la colonizzazione microbica in un breve periodo di tempo (ad esempio, &lt;24 ore). I biofilm complessi vengono sonicati per studiare gli effetti delle cellule disperse o degli aggregati di biofilm sui tessuti (B). Questo è importante in quanto in precedenza è stato dimostrato che tali cellule hanno fenotipi unici rispetto alle controparti planctoniche o a biofilm; a tal fine, i biofilm intatti possono essere aggiunti direttamente al tessuto utilizzando ulteriori inserti più piccoli per creare un'esposizione adiacente con l'ospite (C). Infine, le cellule planctoniche vengono aggiunte al tessuto in terreni di coltura appropriati per valutare la colonizzazione microbica, la formazione di biofilm e le dinamiche di crescita sul tessuto (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67487/67487fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67487/67487fig02.jpg"> 
Figura 2: Espressione genica del tessuto HOE in seguito alla stimolazione con biofilm sonicato a 7 specie. Variazione del ripiegamento dell'espressione dell'mRNA di un totale di 15 geni infiammatori normalizzati al gene housekeeping, GAPDH, in tessuto HOE in campioni di controllo non stimolati e che sono stati esposti a 100 μL di biofilm sonicato (A) a 7 specie. I tre geni (CCL2, CXCL1, CSF3) con le più alte variazioni nell'espressione dell'mRNA sono mostrati in (B). Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando un test T parametrico non accoppiato, con variazioni significative rappresentate rispettivamente come *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01 e ***p &lt; 0,001. I dati sono stati tracciati e analizzati utilizzando software statistici e grafici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67487/67487fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67487/67487fig03.jpg"> 
Figura 3: Espressione genica di IL8 e livelli di proteina IL-8 prodotti dal tessuto HOE. Variazione del ripiegamento dell'espressione dell'mRNA di IL8 nel tessuto HOE come determinato dalla qPCR (A) basata su SYBR-green e dai livelli di proteina IL-8 quantificati dai terreni tissutali esauriti utilizzando la metodologia ELISA (B). Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando un test T parametrico non appaiato, con variazioni significative rappresentate rispettivamente come *p &lt; 0,05 e ****p &lt; 0,0001. I dati sono stati tracciati e analizzati utilizzando software statistici e grafici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67487/67487fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Sistemi modello di tessuto organotipico per lo studio delle interazioni ospite-patogeno in vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While ...

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Source: Alshehri, M. et. al., Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates a co-culture model using multi-species oral biofilms and human oral epithelium. It highlights epithelial immune activation and enables the downstream analysis of host-pathogen interaction.

A Transwell Tissue Model for Studying Interactions Between Human Oral Biofilms and Epithelium

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Un sistema di coltura di organi intestinali ex vivo per studiare le interazioni ospite-microbiota

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