Sistemi modello di tessuto organotipico per lo studio delle interazioni ospite-patogeno in vitro

I biofilm della placca dentale sono composti da centinaia di microrganismi che possono guidare l'infiammazione nel loro epitelio orale, portando a malattie come la gengivite. Vogliamo comprendere meglio queste interazioni, utilizzando modelli tissutali organotipici. Questi sistemi forniscono piattaforme utili per valutare modalità di trattamento alternative in modo controllato.

Quindi il progresso delle tecnologie di sequenziamento negli ultimi anni sta trasformando il campo della biologia delle infezioni. Queste tecnologie ci consentono di studiare realmente le interazioni ospite-patogeno, utilizzando molteplici tecniche OMIC attraverso la valutazione delle firme microbiche e dell'ospite a livello proteomico, trascrittomico e metabolomico. La nostra recente ricerca ha evidenziato l'importanza delle interazioni inter-regno e polimicrobiche nelle infezioni correlate al biofilm.

Attraverso l'uso di sistemi modello in vitro, siamo stati in grado di studiare le interazioni tra biofilm dell'ospite, testare nuove terapie anti-biofilm e profilare le comunità microbiche, utilizzando tecnologie innovative come la RAM e la spettroscopia. Gli studi futuri, utilizzando questi modelli di tessuto organotipico, mireranno a ottenere una firma multi-OMIC e la profilazione del microrganismo e del tessuto ospite e della coltura, insieme. Speriamo di scoprire e districare le complesse interazioni tra l'ospite e specifici batteri e specie fungine nei nostri modelli di biofilm.

Per iniziare, rimuovi i gambi congelati delle perle porose contenenti specie di streptococco a partire da 80 gradi Celsius. Rianima le specie di streptococcus sulle piastre di base della coclea del sangue Columbia, contenenti il 5% di sangue di cavallo defibrinato sterile. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore.

Il giorno successivo, trasferire tre o quattro colonie dalla piastra a 10 millilitri di brodo di soia triptone. Coltivare il brodo a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 16-18 ore. Dopo l'incubazione, centrifugare le sospensioni cellulari a 3.000 G per cinque minuti a 20 gradi Celsius.

Lavare i pellet cellulari con 10 millilitri di PBS sterile. Risospendere i pellet in 10 millilitri di PBS e standardizzare la sospensione di ogni specie di streptococco, individualmente, utilizzando uno spettrofotometro impostato a 550 nanometri. Dopo la standardizzazione, diluire ciascuna sospensione di streptococco, da uno a 10, per raggiungere una concentrazione di una volta 10 alla potenza di sette cellule per millilitro in una miscela uno a uno di brodo Todd Hewitt e terreno del Roswell Park Memorial Institute.

Pipettare 500 microlitri di sospensioni cellulari diluite in una piastra per microtitolazione a 24 pozzetti, contenente un disco di idrossiapatite da 13 millimetri. Incubare la coltura per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per consentire la formazione del biofilm. In modo simile, coltura per microrganismi anaerobi su una base di coclea anaerobica meticolosa, contenente il 5% di sangue di cavallo defibrinato sterile.

Standardizzare ogni microrganismo anaerobico a una specifica assorbanza e diluirli in una miscela uno a uno di brodo Todd Hewitt e terreno del Roswell Park Memorial Institute. Dopo la maturazione del biofilm dello streptococco, rimuovere con cura le cellule non aderenti e i terreni esauriti dai pozzetti. Aggiungere 500 microlitri di una volta per 10 standardizzata alla potenza di sette cellule per millilitro di sospensioni di quattro microrganismi anaerobi in ciascun pozzetto.

Incubare i biofilm per 24 ore in condizioni anaerobiche a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere le cellule non aderenti e i terreni esauriti dai pozzetti. Aggiungere 500 microlitri di miscela sterile uno a uno di brodo Todd Hewitt e terreno del Roswell Park Memorial Institute.

Coltura dei biofilm in condizioni anaerobiche per 24 ore. Il settimo giorno, lavare i biofilm due volte con 500 microlitri di PBS sterile per la co-coltura. Per iniziare, disimballare e trasferire l'epitelio orale umano o il tessuto e il terreno HOE in un armadio di sicurezza di classe due.

Aggiungere un millilitro del terreno di mantenimento fornito con il tessuto a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Utilizzando una pinzetta sterile, rimuovere gli inserti in policarbonato contenenti il tessuto HOE dalla coclea dei nutrienti e dalla piastra di spedizione a 24 pozzetti. Trasferire il tessuto nella piastra a 12 pozzetti preparata.

Incubare i modelli di tessuto per 24 ore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per acclimatarli alle condizioni di laboratorio. Nel frattempo, per rimuovere i biofilm dai dischi di idrossiapatite, utilizzare un ago calibro 19 e una pinzetta per sollevare i dischi dal fondo della piastra a 24 pozzetti. Trasferisci i dischi in un bijou, contenente un millilitro di DPBS sterile.

Sonicare i dischi a 35 kilohertz per 10 minuti in un bagno d'acqua di sonicazione. Dopo l'acclimatazione, utilizzare una pinzetta per rimuovere gli inserti di tessuto dalla piastra a 12 pozzetti. Pipettare 100 microlitri di sospensione sonicata di biofilm direttamente sui modelli di tessuto.

Trasferire gli inserti in un'altra piastra a 12 pozzetti contenente un millilitro di terreno di manutenzione fresco. Incubare i modelli di tessuto per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per il trattamento dei tessuti, preparare 350 microlitri di tampone di lisi RLT, contenente l'1% di mercaptoetanolo a fascio in un tubo O-ring con tappo a vite da due millilitri.

Aggiungere circa 100 microlitri di perle di vetro lavate con acido da 0,5 millimetri al tubo. Utilizzando una pinzetta, rimuovere gli inserti contenenti il tessuto dal terreno ed eliminare l'eventuale sospensione microbica rimanente dall'inserto. Tenere l'inserto capovolto all'altezza degli occhi, quindi utilizzare un ago calibro 19 per tagliare con cura il tessuto e la membrana dal fondo dell'inserto.

Trasferire il tessuto e la membrana nel tampone RLT preparato. Omogeneizzare il tessuto per 30 secondi, utilizzando un omogeneizzatore beader da banco. Estrarre l'RNA dal lisato risultante, seguendo le istruzioni del produttore del kit di estrazione dell'RNA.

Raccogliere i terreni tissutali esausti rimanenti per le analisi proteomiche, utilizzando metodologie a bassa e alta produttività. L'espressione genica dei biomarcatori infiammatori nel tessuto HOE era significativamente sovraregolata dopo l'esposizione al biofilm sonicato, rispetto al controllo non stimolato. Le maggiori variazioni di piega sono state osservate per CCL2, CXCL1 e CSF3.

L'espressione dell'mRNA IL8 nel tessuto HOE è aumentata di 8,67 volte, dopo la stimolazione con biofilm sonicato, rispetto al tessuto controllato. I livelli di proteina IL8 nei terreni esauriti sono aumentati da 1,005 nanogrammi per millilitro nel tessuto di controllo a 4,245 nanogrammi per millilitro nel tessuto stimolato sonicato con biofilm.