Visualizzazione delle interazioni microbiota-ospite intestinale tramite ibridazione fluorescente in situ , colorazione della lectina e imaging

Questo protocollo semplificato descrive in dettaglio un flusso di lavoro per rilevare e visualizzare batteri in campioni di tessuto complessi, dal fissaggio del tessuto alla colorazione dei microbi con ibridazione fluorescente in situ .

I microbi associati all'ospite costituiscono questo ecosistema molto complesso che richiede davvero l'imaging per essere compreso. E attraverso questa particella, ti mostreremo come passare attraverso il processo di colorazione e ottenere la visualizzazione dell'interfaccia del microbioma ospite. Comprendere la biologia dei batteri associati all'ospite richiede una comprensione della loro localizzazione all'interno di micro ambienti.

E questa tecnica ci permetterà di visualizzare i singoli taxa all'interno degli ambienti ospiti, così come nel contesto di altri batteri. Attraverso questa tecnica, sarà possibile determinare quali batteri possono essere penetrati attraverso il tessuto ospite, nonché determinare se le caratteristiche chiave come il muco ospite possono essere esaurite. Preparare il metacarn fresco in un contenitore compatibile con il 60% di metanolo assoluto, il 30% di cloroformio e il 10% di acido acetico glaciale.

Usando strumenti nitidi e puliti, taglia i segmenti intestinali dai topi per l'imaging. Ridurre al minimo il disturbo del campione il più possibile e gestire le sezioni dalle loro creste per evitare di influenzare l'area di imaging. Fissare il campione il prima possibile dopo la dissezione per evitare la degradazione.

Posizionare le sezioni intestinali in cassette di istologia tenendo delicatamente un bordo del tessuto con una pinzetta. Chiudere la cassetta e immergerla completamente in una soluzione di metacarn fresco, assicurandosi che la soluzione non sia più vecchia di qualche ora dopo l'immersione delle cassette. Per i campioni clinici che verranno raccolti in una suite clinica senza accesso a una cappa aspirante, utilizzare un contenitore di stoccaggio in polietilene con un lembo tagliato nel coperchio che consentirà il passaggio delle cassette istologiche.

Nastro chiuso questo lembo quando non si passano campioni per impedire la fuoriuscita di fumi tossici. Mettere la paraffina in un contenitore resistente al calore e sciogliere in un forno a 60 gradi Celsius durante la notte. Lavare il fazzoletto versando il liquido nell'apposito ricettacolo di scarto e incubandolo sequenzialmente in metanolo assoluto, etanolo assoluto e xilene come descritto nel manoscritto di testo.

Aprire leggermente le cassette per consentire alla paraffina di entrare senza perdere i segmenti di tessuto utilizzando doppi guanti o pinzette. Immergere e chiudere le cassette nel contenitore di paraffina fusa. Riposizionare il contenitore nel forno a 60 gradi Celsius, assicurandosi che le cassette siano riempite di paraffina e che non rimangano grandi bolle d'aria.

Dopo l'incubazione per due ore, rimuovere il contenitore dal forno. Usando una pinza, rimuovere con attenzione le cassette. Riscaldare il forno a 60 gradi Celsius e prebellicare un barattolo di Coplin.

Aggiungere abbastanza volume di xilene in una bottiglia di vetro per coprire due volte i vetrini nel barattolo e posizionare il parafilm attorno al coperchio per evitare l'evaporazione degli xileni. Lasciare che la temperatura degli xileni raggiunga i 60 gradi Celsius. Preparare la soluzione di ibridazione FISH come indicato nel manoscritto di testo.

Posizionare le diapositive nel barattolo Coplin, assicurandosi che le sezioni non entrino in contatto con altre diapositive o il barattolo e cuocere le diapositive a 60 gradi Celsius per 10 minuti. Nella cappa aspirante, riempire il barattolo Coplin con xileni preriscaldati dal forno, facendo attenzione a non versare direttamente sopra i campioni e potenzialmente rimuovere i tessuti. Riposizionare il barattolo Coplin nel forno a 60 gradi.

Versare gli xileni usati in un apposito contenitore per i rifiuti, facendo attenzione a non disturbare le sezioni di tessuto sui vetrini e utilizzando un paio di pinze per evitare che i vetrini cadano dal barattolo Coplin. Ricostituire il barattolo Coplin con gli xileni rimanenti e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente nella cappa aspirante. Incubare le sezioni in etanolo al 99,5% per cinque minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, rimuovere i vetrini dal barattolo Coplin. Pulire il retro dei vetrini su una salvietta da laboratorio o un tovagliolo di carta e asciugare brevemente all'aria fino a quando le goccioline di etanolo non sono sparite. Creare cerchi molto ravvicinati attorno a ciascuna sezione di tessuto utilizzando un bloccante liquido o una penna PAP per limitare l'area di espansione necessaria per essere coperta dalla soluzione di ibridazione, evitando il contatto dell'inchiostro con la sezione.

Preparare la soluzione di ibridazione e aggiungere 0,5 microgrammi di sonda per ogni 50 microlitri della soluzione utilizzata. Pipettare la soluzione sulle sezioni della diapositiva. Sovrapporre la sezione con coperture flessibili in plastica, assicurando che il volume di liquido utilizzato copra l'intera sezione.

Creare una camera umida con una scatola di punta della pipetta con salviette o asciugamani di carta che sono stati imbevuti di soluzione di ibridazione in eccesso o PBS per fornire umidità. Incubare la slitta nella camera umida a 45-50 gradi Celsius per almeno tre ore a seconda della sonda impostata per ridurre l'evaporazione. Rimuovere le coperture di plastica e incubare le diapositive nel tampone di lavaggio FISH in un barattolo Coplin entrambi preriscaldati a 50 gradi Celsius.

Riposizionare il barattolo Coplin nel forno a 50 gradi Celsius per 10-20 minuti. Rimuovere il tampone di lavaggio FISH e sostituirlo con PBS nel barattolo Coplin. Subito dopo aver riempito il barattolo Coplin con PBS, decantare il PBS.

Rimuovere le diapositive dal barattolo e pipettare la contromacchia sulla parte superiore dell'intera sezione, assicurandosi di non toccare il tessuto con la punta della pipetta. Incubare a quattro gradi Celsius per 45 minuti. Lavare le macchie tre volte rapidamente con PBS fresco.

Pulire il retro dei vetrini contro una salvietta o un tovagliolo di carta e lasciare evaporare la maggior parte del PBS dalle sezioni aiutato da una linea di vuoto collegata a una punta della pipetta. Montare le sezioni utilizzando un mezzo di montaggio. Apporre le coverslips alla diapositiva dipingendo lungo i bordi della coverslip con smalto trasparente, avendo cura di stare lontano dal bordo della diapositiva.

Lasciare impostare a temperatura ambiente. Qui sono mostrate immagini del colon distale di topo mono-colonizzato con Muribaculum intestinale e quello bi-colonizzato con Muribaculum intestinale e Bacteroides thetaiotaomicron. I campioni sono stati colorati con una sonda FISH a tre primi cianine-3 marcati specifici per l'isolato di Muribaculum e anche controcolorati con la lectina legata alla rodamina UEA-1 e DAPI.

Le immagini delle sezioni macchiate con ciano-3 FISH, DAPI e canali combinati cyanine-3 FISH e DAPI mostrano la localizzazione di Muribaculum intestinale. Tutti i segnali DAPI a forma di batteri e di dimensioni batteriche sono etichettati con cianine-3 nello stato di monocolonizzazione. Nello stato di bicolonizzazione, oltre a queste cellule ciano-3 e DAPI doppie positive, ci sono cellule batteriche colorate con DAPI che sono cianone-3 negative come previsto.

Ad eccezione dei batteri filamentosi più lunghi, le strutture DAPI-positive più grandi sono materiale vegetale o nuclei delle cellule ospiti. Un segmento intestinale che è stato sezionato a una profondità che fornisce una vista del lume, nonché viste longitudinali dell'epitelio e un segmento di sezione poco profondo che rivela solo sezioni trasversali di cripte e nessuno strato di muco o batteri costante dimostra che il sezionamento superficiale non fornirà fette luminali dell'intestino. La copertura irregolare del tessuto o del coverslip si traduce in scansioni di piastrelle sfocate e illuminate in modo non uniforme.

Un esempio di sfondo normale e sfondo alto sono mostrati anche qui. Man mano che impariamo di più sul microbiota, è diventato davvero ovvio che i test di massa come il sequenziamento non sono sufficienti per determinare davvero cosa succede tra le diverse specie microbiche e come interagiscono insieme. E per questo, abbiamo davvero bisogno di imaging.

Questo tipo di tecnica ha permesso alcune scoperte davvero importanti, ad esempio, che la privazione di fibre dalla dieta provoca assottigliamento dello strato di muco e potenzialmente infezione da agenti patogeni come studi del gruppo Martins, nonché studi sugli effetti della diarrea osmotica e su come l'esaurimento dello strato di muco influisce davvero sia sull'ospite che sul microbiota. E questi erano studi fatti dal gruppo Sonnenberg, così come dal nostro gruppo.