Enzimatica decarbossilazione Luce-driven

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di guidare le reazioni enzimatiche utilizzando la luce visibile. In questo approccio, la luce viene utilizzata per convertire gli acidi grassi in alchini terminali in condizioni di reazione blande. La decarbossilazione richiede la rottura dei legami CC.

E questo legame è molto stabile, il che rende questa reazione molto difficile. L'uso della luce è un approccio sostenibile per ottenere una reazione così difficile. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo provato ad aggiungere perossido di idrogeno direttamente alla reazione, che ha portato all'inattivazione degli enzimi.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una quantità costante di perossido di idrogeno. In primo luogo abbiamo utilizzato OleT purificato per la biocatalisi guidata dalla luce per caratterizzare il nostro enzima. Successivamente abbiamo testato anche l'estratto grezzo che sarebbe stato importante per lo sviluppo di applicazioni industriali.

Dopo aver clonato il gene sintetico OleT nel vettore di espressione e aver trasformato il plasmide in E.Coli come descritto nel protocollo di testo, inoculare le cellule in due provette contenenti tre millilitri di terreno LB con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Incubare le pre-colture in uno shaker per 15 ore. Diluire due millilitri di coltura in 200 millilitri di LB con ampicillina in due fiasche da un litro.

Incubare i flaconi in uno shaker a 37 gradi Celsius e 180 RPM fino a quando le colture raggiungono una densità ottica a 600 nanometri tra 0,6 e 0,8. Quindi, aggiungere 0,5 millimolari di acido delta aminolevulinico alle colture. E poi indurre le cellule aggiungendo tetraciclina a 0,2 microgrammi per millilitro ai flaconi.

Incubare le colture per 15 ore a 20 gradi Celsius e 180 giri/min. Dopo l'induzione, decantare le colture in provette da centrifuga e centrifugare le provette a 12000 volte G e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Scartare il surnatante.

Risospendere i pellet pipettandoli in 50 millilitri di tampone Tris ghiacciato e trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga conica. Continuare centrifugando a 4000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Scartare il surnatante e risospendere ogni pellet in tre millilitri di tampone mediante pipettaggio ripetuto.

Lisi le cellule sonicando con tre cicli di 30 secondi facendo una pausa di un minuto tra i cicli. Quindi, centrifugare il lisato a 15000 volte G e quattro gradi Celsius per 20 minuti, quindi pipettare con cura l'estratto privo di cellule in provette da centrifuga coniche. Per la preparazione dell'estratto grezzo per la biocatalisi guidata dalla luce, trasferire tre millilitri di un estratto libero da cellule in un filtro da centrifuga da 10 kilodalton e centrifugare a 4000 volte G a quattro gradi Celsius per rimuovere piccole molecole.

Risospendere la proteina in tre millilitri di Tris. Per caratterizzare l'attività di OleT nella biocatalisi guidata dalla luce, la proteina deve essere purificata. Per avviare la purificazione delle proteine, caricare tre millilitri di estratto libero da cellule su colonne di spin NTA di nichel bilanciate.

Sigillare le colonne con tappi inferiori e tappi a vite. E agitarli leggermente fino a quando la resina non sarà distribuita uniformemente. Continuare incubando le colonne in uno scuotitore ad aria.

Quindi centrifugare la colonna. Successivamente lavare le colonne aggiungendo un millilitro di tampone di lavaggio e centrifugandole a 700 volte G per due minuti. Ripetere il lavaggio altre due volte.

Dopo il lavaggio, posizionare le colonne in provette da centrifuga coniche e aggiungere un millilitro di tampone di eluizione a ciascuna colonna. Centrifugare le provette a 700 volte G per due minuti e ripetere l'eluizione altre due volte. Aggiungere gli estratti della colonna combinata a un filtro da centrifuga da 10 kilodalton e centrifugarlo a 4000 volte G e quattro gradi Celsius per separare l'imidazolo utilizzato per l'eluizione dall'enzima.

Infine, determinare la purezza e la concentrazione delle proteine come indicato nel protocollo di testo. Per avviare la procedura di biotrasformazione, aggiungere prima il 10% di un tensioattivo come il tergitolo e 28,4 milligrammi di acido stearico all'acqua distillata per ottenere 10 millilitri di una soluzione madre da 10 millimolari. Riscaldare la soluzione in una camera di riscaldamento, a 60 gradi centigradi fino a quando l'acido stearico non sarà completamente sciolto.

Utilizzare questa soluzione per preparare una miscela di reazione secondo il protocollo successivo. Aggiungere FMN, EDTA, tampone e acido stearico a due tubi di vetro trasparente e mescolare a bagnomaria a 25 gradi Celsius. Continuare aggiungendo 200 microgrammi per millilitro dell'enzima purificato o dell'estratto grezzo alle provette.

E illuminali con una lampadina a LED trasparente a una distanza di due centimetri. Successivamente, prelevare campioni da 200 microlitri in punti temporali specifici in provette preriempite con 20 microlitri di acido cloridrico al 37% per fermare le reazioni. Quindi aggiungere cinque microlitri di una soluzione di acido miristico da 10 millimolari a ciascun campione come standard interno.

Per analizzare i prodotti di reazione, aggiungere due volte 500 microlitri di acetato di etile alle provette. Capovolgere le provette per mescolarle e centrifugare per un minuto a 13.000 volte G.Successivamente, trasferire 400 microlitri di surnatanti nelle provette della microcentrifuga e farle evaporare completamente soffiando delicatamente sulle provette con aria compressa. Aggiungere 200 microlitri di MSTFA ai tubi.

E incubare la miscela a 60 gradi Celsius per 30 minuti per derivatizzare i campioni prima dell'analisi. Analizzare i prodotti della reazione iniettando un campione di quattro microlitri in un gascromatografo dotato di un rivelatore a ionizzazione di fiamma utilizzando il profilo di temperatura descritto nel protocollo di testo. Successivamente, determinare il rapporto tra un eptadecano e un beta idrossiacido formato in ciascun campione di reazione con un gascromatografo accoppiato a uno spettrometro di massa.

Utilizzare le impostazioni della temperatura del forno e dello spettrometro di massa come descritto nel protocollo di testo. Iniettare un microlitro di ciascun campione nel gascromatografo e registrare il cromatogramma. Infine, monitorare i cromatogrammi GCMS per ogni campione e analizzarli secondo il protocollo del produttore.

I pesi molecolari dei prodotti delle reazioni enzimatiche sono stati determinati utilizzando un gascromatografo accoppiato a uno spettrometro di massa. Per gli acidi grassi con catene aciliche più lunghe, l'enzima OleT, catalizza preferenzialmente la loro decarbossilazione in olefine di diverse lunghezze. I campioni della reazione di biotrasformazione sono stati analizzati da un gascromatografo dotato di un rivelatore a ionizzazione di fiamma.

È stato dimostrato che la decarbossilazione dell'acido stearico avviene tre volte più velocemente della reazione di idrossilazione con il 99% dell'acido stearico convertito in una miscela 3,3:1 di un eptadecano e acido 2-idrossistearico. Una volta padroneggiata, la biocatalisi guidata dalla luce può essere eseguita in poche ore se, ad esempio, eseguo correttamente. Nella catalisi della luce, la sfida è quella di collegare le reazioni utili alla raccolta della luce.

Nel nostro caso, abbiamo la luce all'interno della molecola FMN come fotosensibilizzante e la colleghiamo al nostro enzima tramite una molecola di trasferimento che è il perossido di idrogeno.