Name: Enzimatica decarbossilazione Luce-driven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Scopri la biocatalisi guidata dalla luce per convertire acidi grassi in alchini terminali usando l'enzima OleT. Questo metodo sostenibile genera perossido di idrogeno in modo controllato, evitando l'inattivazione enzimatica e aprendo applicazioni industriali.

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R.K. e F.H. sono grati alla Commissione Europea per il sostegno finanziario all'interno delle Biocascate Marie-Sklodowska ITN (Nr. 634200).

Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell&#39;uso. Molti dei prodotti chimici utilizzati in queste sintesi sono altamente tossici e cancerogeni. Tutte le fasi che coinvolgono solventi organici nocivi, in particolare l&#39;estrazione dei prodotti di reazione e la derivatizzazione di acidi grassi devono essere effettuate sotto una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni full-length, scarpe chiuse ). Tutte le operazioni che coinvolgono organismi geneticamente modificati in questo lavoro richiedono installazioni che sono stati approvati per la gestione di organismi geneticamente modificati della S1 livello di sicurezza. 1. L&#39;espressione della ricombinante decarbossilasi olet JE in E. coli <ol><li> Preparazione del ceppo produttivo <ol><li> Preparare un gene sintetico di Olet JE dal Jeotgalicoccus e clonato nel vettore di espressione PASK-IBA37plus come descritto. 8 </sup&gt; NOTA: Per evitare la degradazione degli acidi grassi dagli enzimi del metabolismo batterico, E. coli ceppo JW5020 della collezione Keio con un percorso disfunzionale per la degradazione degli acidi grassi è stato utilizzato. </li></ol></li><li> La coltivazione e l&#39;induzione di espressione dell&#39;enzima <ol><li> Preparare una pre-cultura inoculando la E. coli JW5020 olet mutante da un LB-plate (contenente 100 mg ml -1 ampicillina) in due 3 ml di LB-media in provetta. Pipetta ampicillina (100 ug ml -1) da una soluzione madre nel mezzo di selezione e incubare a 37 ° C per 15 h in un incubatore agitazione a 180 rpm. </li><li> Aggiungere 2 ml di pre-culture di due 200 ml di LB-media, contenente ampicillina (100 mg ml -1), in 1 fiaschi L agitare. Incubazione procede a 37 ° C e 180 rpm. </li><li> Monitorare il cambiamento di OD 600nm dopo l&#39;inoculazione. Quando la OD 600 raggiunge un valore compreso tra 0,6 und 0.8 indurre l&#39;espressione con l&#39;aggiunta di tetraciclina (0,2 mg ml -1). Incubare le culture per 15 ore a 20 ° C e 180 rpm. NOTA: Poiché Olet JE contiene un cofattore eme, è necessaria aggiunta di acido levulinico δ-Amino (0,5 mM) prima dell&#39;induzione di fornire la cultura con un precursore per la sintesi cofattore. </li></ol></li><li> La lisi cellulare <ol><li> Eseguire i seguenti passi sul ghiaccio. Trasferire le culture per decantazione o pipettando nella provette da centrifuga e utilizzare una scala per garantire la parità di distribuzione. Centrifugare le colture per 20 min a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Eliminare attentamente il supernatante e risospendere il pellet in 50 ml di tampone (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) pipettando e trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga conica. </li><li> Dopo centrifugazione per 15 min a 4000 xga 4 ° C scartare il surnatante, risospendere ogni pellet in 3 ml di tampone pipettando. </li><li> Eseguire la lisi cellulare da cosìnicating le soluzioni su ghiaccio (tre cicli x 30 sec) lasciando un 1 minuto di pausa tra i cicli. Centrifugare le soluzioni per 20 min a 15.000 xg a 4 ° C per rimuovere detriti cellulari e trasferire il surnatante in un tubo di centrifugazione conica senza disturbare il pellet pipettando. Eliminare il pellet. NOTA: Una frazione solventi sarà utilizzato direttamente per biocatalisi dopo piccole molecole vengono rimossi. La seconda frazione sarà utilizzata per la purificazione del His-tag Olet JE. </li></ol></li><li> La rimozione di piccole molecole di Cell-estratti <ol><li> Prima di utilizzare l&#39;estratto grezzo in biocatalisi rimuovere piccole molecole che possono interferire con la formazione di perossido di idrogeno o trasferimento elettronico pipettando 3 ml di estratto cellulare in un&#39;unità filtrante centrifuga con 10 kDa membrana e centrifugare a 4000 xga 4 ° C. Risospendere la proteina residua in 3 ml di Tris-HCl-buffer. </li></ol></li><li> Purificazione di Olet </strong&gt; <ol><li> Applicare 3 ml del secondo estratto cellulare ai suoi Pur Ni-NTA colonne di rotazione, che sono stati equilibrati prima con tampone di equilibrazione (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazolo 10 mM). </li><li> Sigillare le colonne con i tappi di fondo e tappi a vite superiore e stringere leggermente fino a quando la resina viene distribuito equamente con l&#39;estratto cellulare. Incubare le colonne caricate per 30 min in un agitatore testa a 4 ° C. </li><li> Lavare le colonne di 1 ml di tampone di lavaggio (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazolo 20 mM, pH 7,4) per centrifugazione a 700 xg per 2 minuti. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Posizionare le colonne in un tubo di centrifugazione conica fresco e aggiungere 1 ml di tampone di eluizione (Tris 20 mM, NaCl 300 mm, 250 mm imidazolo, pH 7,4) olet JE. Centrifugare a 700 g per 2 minuti e ripetere l&#39;operazione due volte. NOTA: Imidazole si legherà al nichel e quindi rimuovere olet JE dalla colonna. </li><li> Trasferire il eluizione di un gruppo filtro centrifuga (10 mem kDabrane) e centrifugare a 4000 xga 4 ° C per rimuovere imidazolo. </li><li> Controllare la purezza dell&#39;enzima da un SDS-PAGE (15%). 9 Mix 3 microlitri della eluizione con SDS-buffer (1x concentrazione finale) e incubare la soluzione a 95 ° C per 5 minuti per denaturazione. Successivamente applicare la quantità totale su un SDS-PAGE. Attivare il gel a 35 mA utilizzando uno standard commerciale proteine. Rilevare la proteina a 50 kDa. </li><li> Per determinare la concentrazione proteica utilizzare una disposizione BSA-kit commerciale. Pipettare 50 ml di campioni di proteine ​​diluito (1: 100, 1: 200, 1: 500) e standard di BSA (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml -1) in una piastra a 96 pozzetti . Aggiungere 200 ml di reagente di Bradford, misurare l&#39;assorbanza a 595 nm dopo 15 min con un fluorimetro e calcolare le concentrazioni utilizzando la curva standard. </li></ol></li></ol> 2. Biotrasformazione Light-catalizzata <ol><li> Le reazioni biocatalitici senza aggiunta di perossido di idrogeno<ol><li> Preparare una soluzione di 10 ml di 10 mM di acido stearico (M r 284,5 g mol -1) aggiungendo 10% (v / v) tergitol e 0,0284 g di acido stearico di acqua distillata. Riscaldare la soluzione in una stufa a 60 ° C fino l&#39;acido grasso è completamente sciolto. </li><li> Biocatalisi e campionamento <ol><li> Preparare due 2 ml miscele di reazione contenenti 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN, 0,5 mM acido stearico in Tris-HCl-buffer. Aggiungere una barra di agitazione magnetica per apporto di ossigeno sufficiente e posizionare i tubi di vetro in un bagno d&#39;acqua, riscaldata a 25 ° C. </li><li> Aggiungere 200 mg ml -1 di enzima purificato o 10% (v / v) estratto cellulare a ciascuna delle miscele di reazione e illuminare con una lampadina di vetro chiaro (120 W) in 15 cm di distanza delle provette di reazione. </li><li> Prendere 200 campioni microlitri in punti temporali specifici (0, 10, 30, 60 e 120 min e durante la notte) fermare la reazione con 20 l 37% di HCl. Aggiungere 5 ml di acido miristico (10 mM magazzino cosìluzione) come standard interno. </li></ol></li></ol></li><li> Analisi dei prodotti di reazione <ol><li> Per l&#39;estrazione aggiungere 500 microlitri di acetato di etile ai campioni due volte, invertire i tubi e centrifugare per 1 min a 13.000 x g. </li><li> Togliere 400 ml di surnatante e lasciare che il solvente completamente evaporare. </li><li> Derivatize gli acidi carbossilici in acido trimethylsilylcarboxylic aggiungendo 200 microlitri N -methyl- N - (trimetilsilil) acetammide trifluoro (MSTFA). Incubare la soluzione a 60 ° C per 30 minuti per convertire i gruppi ossidrilici di trimetilsilil etere. </li><li> Determinazione della conversione in GC / FID NOTA: Determinare la formazione di 1-eptadecene (RT: 8,34 min), acido stearico α- e β-idrossi (RT: 12.05 e 12.1 min) e la diminuzione del substrato (RT: 11,15 min) mediante GC / FID. <ol><li> Impostare il profilo di temperatura descritto di seguito impostare la temperatura di iniezione a 340 ° C. tenerela temperatura iniziale del forno è a 90 ° C per 3,5 minuti e successivamente aumenta a 45 ° C min -1. A 220 ° C, mantenere la temperatura per 2 min. Dopo un ripetuto aumento di 45 ° C min -1, mantenere la temperatura a 280 ° C per 2 minuti e poi aumentare con 60 ° C min -1. NOTA: La temperatura massima di 330 ° C è tenuto per 1.44 min. </li><li> Iniettare 4 ml di campione, con un rapporto di divisione di 5 per ottenere una rapida volatilizzazione e miscelazione omogenea con elio gas di trasporto. NOTA: In dipendenza dalla temperatura crescente substrato e prodotti entreranno nella fase gassosa. Le sostanze sono rilevati dal rilevatore / FID GC dopo aver superato la colonna in tempi di ritenzione specifici e vengono visualizzati come picchi sullo schermo. Osservare la formazione del picco sul monitor. </li><li> Calcolare la concentrazione di prodotto formato dalla seguente formula: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; NOTA: Il fattore di calibrazione è stata determinata specificamente per questa colonna per ogni substrato e prodotto calcolando la curva standard dalla quantità note delle sostanze derivatizzati e la loro area del picco corrispondente. </li></ol></li><li> Identificare i picchi di acido olefine e beta-idrossi mediante GC / MS. <ol><li> Identificare i picchi di acido olefine e beta-idrossi mediante GC / MS. Impostare il profilo di temperatura. Impostare la temperatura di iniezione a 250 ° C. Mantenere la temperatura del forno a 100 ° C per 5 minuti e poi aumentare a 20 ° C min -1. NOTA: massima temperatura viene mantenuta per 7,5 min. </li><li> Impostare la temperatura del rivelatore spettrometro di massa a 250 ° C e la scansione da 50 a 500 m / z in modalità impatto elettronico. NOTA: Electron impatto ionizzazione rimuove un singolo elettrone causando la formazione di un catione radicale che verrà passato in avanti per l&#39;analisi di massa. A causa dei legami covalenti energia intramolar alte all&#39;interno delpausa molecola creando frammenti di bassa m / z. Questi frammenti formano un&#39;impronta digitale specifico per una sostanza. </li><li> Iniettare 1 ml di campione. Detect 1-eptadecene dopo 11.4 min Tempo di ritenzione dal corrispondente impronta digitale (Figura 2). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Kourist, R., Domìnguez de Marìa, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chem%22%5BJournal%5D)">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li>
<li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+taming+of+oxygen%3A+biocatalytic+oxyfunctionalisations%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Comm%22%5BJournal%5D)">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li>
<li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ang.+Chem.+In.+Ed%22%5BJournal%5D)">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li>
<li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis%3A+Nonconventional+Regeneration+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22ChemCatChem%22%5BJournal%5D)">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li>
<li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Appl.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li>
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<li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+olefin+%281-alkene%29+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li>
<li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide-independent+production+of+%CE%B1-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide-independent production of α-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28(2014).</li>
<li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La generazione di luce-driven di perossido di idrogeno può essere applicato per una gamma redox trasformazioni, tra cui peroxygenases 3, chloroperoxidases 10 e P450 monoossigenasi 5. Si tratta di un approccio semplice e praticabile. A lungo termine, l&#39;uso di luce visibile apre la prospettiva di utilizzare la luce solare per trasformazioni chimiche, che è un&#39;alternativa sostenibile per reazioni ricchi di energia. Il metodo è applicabile con l&#39;enzima purificato o con estratto cellulare. Mentre quest&#39;ultimo richiede meno costi e lavoro, va notato che le piccole molecole nel estratto grezzo possono interferire con la conversione catalizzata luce. Un approccio possibile è rimuovere questi piccoli componenti con micromembrana (cioè, per centrifugazione in un gruppo filtro centrifugo o dialisi). La concentrazione della molecola luce raccolta FMN determina la concentrazione del perossido di idrogeno. A seconda della affinity del ossidoreduttasi, questa concentrazione è determinante per l&#39;attività enzimatica. Un altro fattore importante è la concentrazione di EDTA donatore di elettroni sacrificale. Il parametro più importante, tuttavia, è la stabilità operativa e l&#39;attività dell&#39;enzima. Il olefinization di acidi grassi è un elegante reazione per la conversione di acidi grassi a base biologica in olefine che appartengono ai principali prodotti per l&#39;industria chimica. Il biocatalitica decarbossilazione light-driven può essere effettuata a temperatura ambiente ed a pH neutro, che offre evidenti vantaggi in termini di sostenibilità. I nostri risultati mostrano che generazione in situ di perossido di idrogeno è una strategia per fornire il cofattore senza compromettere la stabilità dell&#39;enzima, portando ad una conversione elevata. metodi attuali per la rigenerazione del cofattore utilizzano prodotti agricoli o prodotti chimici a base di petrolio. Le reazioni luce-driven stanno emergendo come alternativa rinnovabile. Futuroricerca sarà dedicata ai metodi per la sostituzione del reagente EDTA sacrificale da molecole più economici e per ridurre la quantità della molecola FMN luce raccolta.

Il cambiamento climatico e il prevedibile esaurimento delle risorse rinnovabili rappresenta una grave minaccia per la nostra società. In questo contesto, catalisi enzimatica rappresenta un potenziale ancora pienamente sfruttata per lo sviluppo di sostenibile e &#39;verde&#39; chimica 1. Ossidoriduttasi hanno la capacità di catalizzare l&#39;introduzione e la modifica dei gruppi funzionali in condizioni lievi reazioni e appartengono alle più importanti biocatalizzatori 2. La maggior parte delle trasformazioni redox richiedono la fornitura di esterna di cofattori quali NAD (P) H. Metodi per la rigenerazione del cofattore sono stati applicati in scala industriale. Tuttavia, ancora si traducono in alti costi di processo, che limita la loro applicazione soprattutto per prodotti di alto valore. È interessante notare che diversi perossidasi 3,4 e monoossigenasi P450 5 accetta elettroni da perossido di idrogeno attraverso la cosiddetta shunt perossido. Mentre H 2 O 2 è un buon co-reagente, è riferito harmful per molti enzimi. Una costante formazione in situ di basse concentrazioni di perossido di idrogeno è un approccio praticabile per guidare la reazione senza compromettere la stabilità operativa di enzima. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> Figura 1. Set-up sperimentale della decarbossilazione photobiocatalytic di acidi grassi da olet JE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> L&#39;uso della luce come fonte di energia per processi chimici e biologici ha ricevuto una crescente attenzione negli ultimi anni 6. Generazione di luce-driven di perossido di idrogeno è emerso come un metodo semplice e robusto per la fornitura di acqua ossigenata per le trasformazioni redox (Figura 1). Un fotocatalizzatore come flavina adenina mononucleotide (FMN) permette la riduzione dell&#39;ossigeno molecolare al perossido di idrogeno, che viene quindi utilizzato come cofattore per la reazione enzimatica oxyfunctionalization. Possibili donatori di elettroni sono acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), ascorbato o formiato poco costoso. Il metodo è generalmente applicabile per H 2 O 2 enzimi -dipendenti, tra cui perossidasi 3,4 e monoossigenasi P450 5. Abbiamo recentemente studiato l&#39;applicazione di una decarbossilasi batterica novel 7 per la trasformazione dei grassi naturali in olefine 8. Questo sarebbe un percorso sostenibile per la sintesi di sostanze chimiche piattaforma ampiamente utilizzati da una fonte a base biologica. Il decarbossilasi olet JE dal batterio gram-positivi Jeotgalicoccus sp. catalizza la decarbossilazione ossidativa degli acidi grassi e forma 1-alcheni come prodotti. Olet JE è strettamente legato al monoossigenasi batteriche P450 e ha bisogno di elettroni fperossido di idrogeno rom per la reazione. Sfortunatamente, l&#39;aggiunta di H 2 O 2 ad una soluzione di substrato e l&#39;enzima provocato basse conversioni e una scarsa riproducibilità dei risultati, presumibilmente a causa di un effetto nocivo di perossido di idrogeno sulla stabilità del Olet JE. Generazione di una proteina di fusione con la NADPH-reduttasi RhFred fatto un decarbossilazione NADPH-dipendente possibile. 9 Tuttavia, il prezzo elevato di NADPH e le attuali limitate possibilità di una rigenerazione conveniente ci hanno spinto a indagare donatori di elettroni meno costosi. Ispirato dalla somiglianza di olet JE con monoossigenasi P450, abbiamo usato la generazione di luce-catalizzata di H 2 O 2. Siamo stati lieti di ottenere elevate conversioni (fino a&gt; 95%) utilizzando estratti privi di cellule o soluzioni di enzimi purificati. Con l&#39;esempio di decarbossilazione degli acidi grassi, vi presentiamo un protocollo generale per enzym luce-driventrasformazioni redox ATIC utilizzando FMN come il perossido di fotocatalizzatore e idrogeno come cofattore. I metodi presentati includono la produzione dell&#39;enzima in cellule ricombinanti di E. coli, la purificazione dell&#39;enzima, l&#39;applicazione per la sintesi di 1-alcheni e l&#39;analisi dei prodotti di reazione.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Bradford</td><td>Roth</td><td>K015.1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90604-29-8</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di etile</td><td>Fisher Chemical</td><td>141-78-6</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavina 5-monofosfato sale sodico idrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>130-40-5</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>&delta;-Acido amminolevulinico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5451-09-2</td><td></td></tr><tr><td>N-Metil-N-(Trimetilsilil)trifluoro acetammide (MSTFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>24589-78-4</td><td></td></tr><tr><td>Acido miristico >99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208-875-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Acido stearico >99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57-11-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60-54-8&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD01779855&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)-amminometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>G-25CK</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ecotron</td><td>Infors HT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation</td><td>Labofuge 400R</td><td>Heraeus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RC 5B Plus</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fresco 17</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Rotori per centrifugazione</td><td>SS34</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SLA</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td>Banco pulito</td><td>Envirco</td><td>Ceag Schirp Reinraum technik</td><td></td></tr><tr><td>Colonna GC-FID&nbsp;</td><td>CP-Sil 5CB (30 m x 0,25&nbsp; mm x 0,25 &micro; m)&nbsp;</td><td>Colonna GC-MS Factor Agilent Technologies</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Colonna a quattro colonne capillari (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&nbsp;</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>GC-FID</td><td>GC-2010 plus</td><td>Shimadzu</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>IST-40</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico</td><td>RCT classic</td><td>IKA</td><td></td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>SevenEasy</td><td>Mettler toledo</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Branson Sonifier 250</td><td>Fotometro</td> spettrale Branson <td></td></tr><tr><td></td><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna per cromatografia di affinità</td><td>His Pur Ni-NTA</td><td>spin column Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centricon</td><td>Vivaspin turbo 15</td><td>VWR International</td> Piastre per microtitolazione a <td></td></tr><tr><td></td><td>96 pozzetti&reg; Piastre per PCR</td><td>Sarstedt</td><td></td></tr></tbody></table>

enzimatica decarbossilazione luce-driven

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Ossidoriduttasi appartengono agli enzimi industriali più-applicate. Tuttavia, hanno bisogno di elettroni esterni la cui fornitura è spesso costoso e impegnativo. Riciclaggio del NADH o NADPH donatori di elettroni richiede l&#39;uso di altri enzimi e substrati sacrificali. È interessante notare che diversi ossidoreduttasi accettano perossido di idrogeno come donatore di elettroni. Pur essendo poco costoso, questo reagente spesso riduce la stabilità degli enzimi. Una soluzione a questo problema è la generazione in situ del cofattore. L&#39;alimentazione continua del cofattore a bassa concentrazione guida la reazione senza compromettere la stabilità dell&#39;enzima. Questo documento illustra un metodo per la luce catalizzata generazione in situ di perossido di idrogeno con l&#39;esempio della decarbossilasi acido grasso eme-dipendente Olet JE. Il decarbossilasi acido grasso Olet JE stato scoperto grazie alla sua capacità unica di produrre catena lunga 1-alcheni da acidi grassi, un enzimatica finora sconosciutoreazione. 1-alcheni sono ampiamente utilizzati additivi plastificanti e lubrificanti. Olet JE ha dimostrato di accettare elettroni da perossido di idrogeno per la decarbossilazione ossidativa. Mentre aggiunta di idrogeno perossido danneggia l&#39;enzima e si traduce in basse rese, generazione in situ del cofattore aggira questo problema. Il sistema photobiocatalytic mostra evidenti vantaggi per quanto riguarda l&#39;attività enzimatica e la resa, risultando in un sistema semplice ed efficiente per decarbossilazione di acido grasso.

Mentre l&#39;aggiunta di perossido di idrogeno alla miscela di reazione ha determinato bassa a moderata conversioni (&lt;10%), generazione in situ di perossido di idrogeno aumentato la conversione fino al 80% di conversione. Analisi mediante GC / MS mostra la formazione di olefine da acidi grassi (Figura 2). <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> Figura 2. (A) Profilo di temperatura per misure GC / MS. (B) impronte digitali del eluizione 1-eptadecene dopo 11.4 min. (C) caratteristica secondaria ioni C n H 2n-1 frammento di olefine terminali esemplare mostrato per 1-eptadecene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> E. coli. Una soluzione enzimatica purificata ha mostrato una chiara correlazione tra la concentrazione di enzima e la conversione. Aumentando la concentrazione del piombo molecola di FMN luce raccolta a conversioni più elevate. Tuttavia, aumentando la concentrazione oltre 10 mM non accelerare ulteriormente le reazioni, indicando che la quantità di perossido di idrogeno è sufficientemente disponibili e non più il fattore limitante. Oltre alla decarbossilazione degli acidi grassi, Olet JE catalizza anche una idrossilazione nel β-posizione. Nella conversione di acido stearico, la decarbossilazione è circa tre volte più veloce della idrossilazione. In un tipico esperimento utilizzando una soluzione di 0,5 mM di acido stearico e 10 pM FMN, 99% del substrato sono stati convertiti ad una miscela di 1-eptadecene e acido 2-idrossistearico con un rapporto di3.3: 1 (Figura 3) 8. Un&#39;indagine dello spettro substrato della biocatalisi light-driven mostrato che per acidi grassi con catene più lunghe acilici, Olet JE catalizza preferenzialmente la decarbossilazione, mentre la quantità relativa di acidi idrossile-grassi nella miscela di prodotto aumenta con breve lunghezza della catena. Acidi grassi più brevi di acido miristico (C14) non hanno subito decarbossilazione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> Figura 3. L&#39;analisi gas cromatografica Olet JE mediata decarbossilazione di acido stearico (11.15 min) in 1-eptadecene (8.4 min), acido stearico (12.04 min) β-idrossi acido stearico α-idrossi (12,1 min). Viene mostrato il cambiamento delle aree di picco di campioni prelevati nel corso di un tempo-corso di 2 ore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vie</a>wa più grande versione di questa figura. Sorprendentemente, il acidi insaturi acido oleico (C18: 1D9 cis) e acido linoleico (C18: 2d9d12) non sono stati accettati come substrati, che indica che la configurazione ritorta di doppi legami cis non può essere accolto in una modalità produttiva legame dell&#39;enzima. Aggiunta di acido oleico (10%) anche impedito la conversione di acido stearico. È interessante notare che, acido stearico (C18: 1D9 trans) è stato convertito da Olet JE, ma con l&#39;attività leggermente inferiore quindi acido stearico.

Descriviamo un protocollo per la generazione di luce-catalizzata di perossido di idrogeno - cofattore per trasformazioni ossidative.

Enzimatica decarbossilazione Luce-driven

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di promuovere reazioni enzimatiche utilizzando luce visibile. In questo approccio, la luce viene utilizzata per convertire acidi grassi in alchini terminali in condizioni di reazione blande. La decarbossilazione richiede la rottura di legami CC.E questo legame è molto stabile, il che rende questa una reazione molto difficile. L'uso della luce rappresenta un approccio sostenibile per realizzare una reazione così difficoltosa. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo tentato di aggiungere direttamente il perossido di idrogeno alla reazione, il che ha portato all'inattivazione degli enzimi.Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una quantità costante di perossido di idrogeno. Inizialmente abbiamo utilizzato OleT purificata per la biocatalisi indotta dalla luce al fine di caratterizzare il nostro enzima. Successivamente abbiamo testato anche estratti grezzi, aspetto importante per lo sviluppo di applicazioni industriali.Dopo aver clonato il gene sintetico OleT nel vettore di espressione e trasformato il plasmide in E. coli come descritto nel protocollo testuale, inoculare le cellule in due provette contenenti tre millilitri di mezzo LB con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Incubare le precolture in un agitatore per 15 ore. Diluire due millilitri della coltura in 200 millilitri di LB con ampicillina in due fiasche da un litro.Incubare i flaconi in un agitatore a 37 gradi Celsius e 180 giri al minuto fino a quando le colture raggiungono una densità ottica a 600 nanometri compresa tra 0,6 e 0,8. Successivamente, aggiungere 0,5 millimoli di acido delta-aminolevulinico alle colture. Quindi indurre le cellule aggiungendo tetraciclina a 0,2 microgrammi per millilitro nei flaconi.Incubare le colture per 15 ore a 20 gradi Celsius e 180 giri al minuto. Dopo l'induzione, versare le colture in provette da centrifuga e centrifugare le provette a 12000 ×g e 4 gradi Celsius per 20 minuti. Scartare il soprannatante.Risospendere i pellet pipettando 50 millilitri di tampone Tris freddo su ghiaccio e trasferire la sospensione in un tubo conico da centrifuga. Procedere centrifugando a 4000 ×g e 4 °C per 15 minuti. Eliminare il soprannatante e risospendere ogni pellet in 3 millilitri di tampone mediante ripetute pipettature.Lisare le cellule mediante sonicazione con tre cicli di 30 secondi, con una pausa di un minuto tra un ciclo e l'altro. Successivamente, centrifugare il lisato a 15000 ×g e 4 °C per 20 minuti, quindi prelevare con attenzione l'estratto privo di cellule e trasferirlo in provette coniche per centrifuga. Per la preparazione dell'estratto grezzo destinato alla biocatalisi indotta dalla luce, trasferire tre millilitri di estratto privo di cellule in un filtro per centrifuga da 10 kDa e centrifugare a 4000 ×g e 4 °C per rimuovere le molecole di piccole dimensioni.Risospendere la proteina in tre millilitri di Tris. Per caratterizzare l'attività di OleT nella biocatalisi indotta dalla luce, la proteina deve essere purificata. Per iniziare la purificazione della proteina, caricare tre millilitri dell'estratto privo di cellule su colonne spin al nitrilotriacetato di nichel equilibrate.Sigillare le colonne con tappi inferiori e cappucci a vite. Agitare delicatamente fino a quando la resina risulta uniformemente distribuita. Procedere incubando le colonne in uno shaker orbitale.Quindi centrifugare la colonna. Successivamente lavare le colonne aggiungendo un millilitro di tampone di lavaggio e centrifugandole a 700 ×g per due minuti. Ripetere il lavaggio altre due volte.Dopo il lavaggio, posizionare le colonne in provette coniche da centrifuga e aggiungere un millilitro di tampone di eluizione a ciascuna colonna. Centrifugare le provette a 700 ×g per due minuti e ripetere l'eluizione altre due volte. Aggiungere gli estratti combinati delle colonne a un filtro per centrifuga da 10 kDa e centrifugare a 4000 ×g e 4 °C per separare l'imidazolo utilizzato per l'eluizione dall'enzima.Infine, determinare la purezza e la concentrazione delle proteine come indicato nel protocollo del testo. Per iniziare la procedura di bioconversione, aggiungere prima il 10% di un tensioattivo come il tergitol e 28,4 milligrammi di acido stearico all'acqua distillata per ottenere 10 millilitri di una soluzione madre 10 millimolare. Riscaldare la soluzione in una camera di riscaldamento a 60 gradi Celsius finché l'acido stearico non sia completamente disciolto.Utilizzare questa soluzione per preparare una miscela di reazione seguendo il protocollo successivo. Aggiungere FMN, EDTA, buffer e acido stearico a due provette di vetro trasparenti e mescolare in un bagno termico a 25 gradi Celsius. Procedere aggiungendo 200 microgrammi per millilitro dell'enzima purificato o dell'estratto grezzo alle provette.E illuminarli con una lampadina LED chiara a una distanza di due centimetri. Successivamente, prelevare campioni da 200 microlitri in punti temporali specifici in provette precedentemente riempite con 20 microlitri di acido cloridrico al 37% per arrestare le reazioni. Quindi aggiungere cinque microlitri di una soluzione di acido miristico 10 millimolare a ciascun campione come standard interno.Per analizzare i prodotti della reazione, aggiungere due volte 500 microlitri di acetato di etile nei tubi. Capovolgere i tubi per mescolare e centrifugare per un minuto a 13.000 × g. Successivamente, trasferire 400 microlitri dei soprannatanti in tubi da microcentrifuga ed evaporarli completamente soffiando delicatamente sui tubi con aria compressa. Aggiungere 200 microlitri di MSTFA nei tubi.E incubare la miscela a 60 gradi Celsius per 30 minuti per derivatizzare i campioni prima dell'analisi. Analizzare i prodotti della reazione iniettando un campione di quattro microlitri in un cromatografo a gas dotato di un rivelatore a ionizzazione di fiamma, utilizzando il profilo di temperatura descritto nel protocollo testuale. Successivamente, determinare il rapporto tra eptadecano e acido beta-idrossi formato in ciascun campione di reazione mediante un cromatografo a gas accoppiato a uno spettrometro di massa.Utilizzare la temperatura del forno e le impostazioni dello spettrometro di massa come descritto nel protocollo testuale. Iniettare un microlitro di ogni campione nel cromatografo a gas e registrare il cromatogramma. Infine, monitorare i cromatogrammi GCMS di ciascun campione e analizzarli secondo il protocollo del produttore.I pesi molecolari dei prodotti delle reazioni enzimatiche sono stati determinati mediante un cromatografo a gas abbinato a uno spettrometro di massa. Per acidi grassi con catene aciliche più lunghe, l'enzima OleT catalizza preferenzialmente la loro decarbossilazione a olefine di diverse lunghezze. I campioni della reazione di biotrasformazione sono stati analizzati mediante un cromatografo a gas dotato di un rivelatore a ionizzazione di fiamma.È stato dimostrato che la decarbossilazione dell'acido stearico avviene tre volte più velocemente della reazione di idrossilazione, con il 99% dell'acido stearico convertito in una miscela 3,3:1 di eptadecano e acido 2-idrossistearico. Una volta padroneggiata, la biocatalisi indotta dalla luce può essere completata in poche ore, purché venga eseguita correttamente. Nella catalisi fotodriven, la sfida consiste nel collegare reazioni utili al sfruttamento della luce.Nel nostro caso, abbiamo la luce all'interno della molecola FMN come fotosensibilizzatore e la colleghiamo al nostro enzima tramite una molecola di trasferimento che è il perossido di idrogeno.

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Chimica

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Enzimatica decarbossilazione Luce-driven

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