Profili di espressione genica di microbi che infettano utilizzare una piattaforma digitale di codificazione

L'obiettivo generale di questo esperimento è misurare con precisione l'espressione genica del patogeno in vivo, al fine di chiarire come il patogeno si adatta all'ambiente infettivo e causa danni all'ospite. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie infettive per esplorare la dinamica dell'espressione genica dei patogeni durante un'infezione reale su diversi tipi di tessuto e in diversi punti temporali. Il principale vantaggio di questo metodo è l'elevata sensibilità e la notevole riproducibilità.

Questo metodo rende possibile quantificare l'espressione genica del patogeno da piccole quantità di tessuto proveniente da un'infezione reale. Per iniziare la preparazione dei reagenti, aggiungere 2-mercaptoetanolo al buffer RLT e mescolare accuratamente. Preparare una miscela 25:24:1 di fenolo-cloroformio-alcol isoamilico.

Etichettare provette di omogeneizzazione di tipo M e raffreddarle sul ghiaccio. Etichettare provette con tappo a vite da due millilitri e aggiungere circa 300 microlitri di perle di zirconia in ciascuna provetta. Tenere pronti i seguenti strumenti per l'uso: un dissociatore di tessuti, un agitatore a perle, una centrifuga da banco con adattatori per provette da 50 millilitri e piastre a 96 pozzetti, e un fotometro.

Rimuovere i reni precedentemente congelati isolati da topi infettati da C.albicans da un congelatore a -80 °C e porli sul ghiaccio. Aggiungere 1,2 millilitri di buffer RLT a ciascun rene. Quindi versare con cautela ciascun rene con il buffer in un tubo di omogeneizzazione di tipo M.

La quantità di tampone RLT utilizzata è determinata empiricamente. Un eccesso di tampone RLT diluirà la concentrazione del campione, mentre una quantità insufficiente renderà l'omogenato molto viscoso e difficilissimo da manipolare. Successivamente, utilizzando un dissociatore tessutale impostato sul programma predefinito RNA 2.01, omogeneizzare i reni.

Quindi, centrifugare a 1000 x G per un minuto. Trasferire 600 microlitri di ciascun omogenato in una provetta con tappo a vite contenente perle di zirconia e conservare l'omogenato rimanente sul ghiaccio. Aggiungere 600 microlitri di fenolo-cloroformio alcol isoamilo a ciascuna provetta, chiudere bene i tappi ed eseguire il vortex sul bead beater per tre minuti a quattro gradi Celsius.

Centrifugare a 15.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire con attenzione la fase acquosa in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri, aggiungendo un volume uguale di etanolo al 70%. Quindi caricare sulla colonna da centrifuga e centrifugare a 8.000 x G. Lavare ogni colonna con 700 microlitri di buffer RW, seguito da due lavaggi con 500 microlitri di buffer RPE.

Trasferire le colonne in provette di raccolta asciutte e centrifugare per un minuto aggiuntivo per rimuovere qualsiasi liquido residuo. Infine, utilizzare 50 microlitri di acqua per eluire l'RNA. Successivamente, utilizzare uno spettrofotometro a OD 216 nm per misurare la concentrazione di RNA.

Per eseguire il profiling dell'espressione genica mediante digital bar-coding, iniziare scongelando il set di codici reporter e il set di codici di cattura in ghiaccio. Aggiungere 130 microlitri di buffer di ibridazione al set di codici reporter. Invertire per mescolare e centrifugare brevemente.

Successivamente aggiungere 20 microlitri della miscela a ciascuna delle 12 provette per reazione. Quindi aggiungere 10 microgrammi di RNA totale del tessuto a ciascuna provetta e mescolare mediante pipettaggio. A seconda del modello di infezione, della dimensione dell'inoculo e del ceppo del patogeno utilizzato, la percentuale di RNA del patogeno all'interno dell'RNA totale varia dallo 0 al 2%. Pertanto, la quantità totale di RNA da aggiungere per ciascuna provetta deve essere ottimizzata empiricamente.

Aggiungere ora cinque microlitri di set di codici di cattura a ciascuna provetta. Mescolare capovolgendo delicatamente le provette e centrifugare brevemente. Incubare quindi le reazioni in un termociclatore a 65 gradi Celsius con coperchio riscaldato per circa 18 ore.

Rimuovere un cartuccia campione da 20 gradi celsius e lasciarla riscaldare a temperatura ambiente. Rimuovere due piastre di reagenti da quattro gradi celsius e centrifugare in una centrifuga da banco a 670 x G per due minuti. Successivamente, configurare la stazione di preparazione seguendo le istruzioni passo dopo passo sullo schermo, selezionando l'opzione ad alta sensibilità.

Quindi rimuovere le reazioni dal termociclatore e caricarle immediatamente sulla stazione di preparazione. Dopo aver eseguito il programma ad alta sensibilità della durata di tre ore, rimuovere la cartuccia e sigillare le corsie con del nastro trasparente. Applicare olio minerale sulla parte inferiore della cartuccia, se necessario.

Quindi caricare la cartuccia sull'analizzatore digitale. Configurare l'analizzatore digitale seguendo le istruzioni passo-passo visualizzate sullo schermo, selezionando l'opzione di scansione ad alta risoluzione. Dopo aver eseguito il programma di scansione, scaricare i risultati o scegliere di riceverli via posta elettronica e importare i dati grezzi nel software del produttore.

Analizzare i dati secondo il protocollo descritto nel testo. Il protocollo illustrato in questo video presenta il vantaggio unico di utilizzare sia una sonda di cattura che una sonda di rilevamento per aumentare la specificità e ridurre il rumore proveniente dall'RNA dell'ospite. Come mostrato qui, i conteggi grezzi di fondo provenienti da un campione di tessuto non infetto erano tutti inferiori a 10, mentre i conteggi grezzi provenienti da due campioni di tessuto infetti erano tutti superiori a 10.

I conteggi grezzi di due campioni biologici hanno mostrato un'ottima correlazione con un valore di R quadrato pari a 0,945. La piattaforma fornisce inoltre un'ampia gamma dinamica sufficiente a comprendere i livelli naturali di espressione biologica. Utilizzando un set di sonde specifico per 248 geni della risposta ambientale, sono state identificate due fasi dell'espressione genica del patogeno.

Una risposta precoce nell'espressione genica comprende geni i cui livelli di RNA differiscono significativamente tra il campione iniziale (inoculo) e quelli a 12 ore dal contagio. È stata inoltre identificata una risposta tardiva nell'espressione genica, costituita da geni con livelli di RNA significativamente diversi tra il tempo di 12 ore e quello di 48 ore dopo l'infezione. Questi risultati indicano che l'espressione genica di C.albicans è regolata in modo dinamico durante l'infezione invasiva in un ospite mammifero.

Questo metodo è semplice e rapido. L'intero procedimento, dalla raccolta del tessuto all'analisi dei dati, richiede meno di 48 ore. Il tempo effettivo di lavoro è di circa quattro ore per 12 campioni.

Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per catturare l'espressione genica del patogeno in vivo, lo stesso può essere utilizzato anche per analizzare l'espressione genica dell'ospite. Pertanto, i ricercatori possono ottenere informazioni utili da entrambi i lati di un'infezione contemporaneamente.