Name: Profili di espressione genica di microbi che infettano utilizzare una piattaforma digitale di codificazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Scopri il profilo dell'espressione genica di C. albicans durante le infezioni utilizzando una piattaforma di codifica digitale. Questo metodo sensibile e riproducibile consente di quantificare la dinamica dell'espressione genica in vivo.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM &amp; SGF), R01 AI054928 (SGF) e R01 DE017088 (SGF).

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso il Los Angeles Biomedical Research Institute (protocollo 011.000) e svolte secondo il National Institutes of Health (NIH) linee guida per il trattamento etico degli animali. I topi sono stati ingabbiati in una struttura AAALAC accreditati situato nel campus di Harbor-UCLA Ricerca e Formazione dell&#39;Istituto. Un veterinario a tempo pieno che si specializza in medicina degli animali da laboratorio ha supervisionato la loro cura. Ingabbiamento e l&#39;allevamento è stato fornito secondo le linee guida nella pubblicazione &quot;Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio&quot; US Public Health Service. Ogni tentativo è stato fatto per trattare i topi con umanità. La sopravvivenza e la salute dei topi è stato monitorato tre volte al giorno. Ovviamente malati, i topi sono stati letargici segregati dal gruppo e sacrificati per ridurre al minimo le sofferenze. I topi sono stati sacrificati per overdose pentobarbital (210 mg / kg), come raccomandato dal gruppo di esperti sul Euthanasia della American Veterinary Medical Association. 1. Preparazione di tessuti, reagenti e strumenti <ol><li> Utilizzare topi maschi Balb / c ponderazione 20-22 g per tutti gli studi. Seminare tre topi per gruppo sperimentale per via endovenosa con 1 x 10 6 lievito fasi C. cellule albicans. Sacrificare animali e reni raccolto in punti temporali specifici dopo l&#39;infezione. Mettere ciascun rene in una provetta tappo a vite, scatto congelare in azoto liquido, e conservare a -80 ° C per l&#39;estrazione di RNA più tardi 6. Nota: Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti come descritto in dettaglio nel Xu et al 6.. </li><li> Preparare i seguenti reagenti e strumenti prima di rimuovere i reni da -80 ° C freezer: <ol><li> Aprire un kit di estrazione di RNA totale. Aggiungere 2-mercaptoetanolo (1% v / v) al buffer RLT e mescolare bene (preparare 2 ml per ciascun campione). </li><li> Preparare fenolo: cloroformio: alcool isoamilico 25: 24: 1 (600 microlitri necessità per ogni campione). </li><li> Etichettare le provette tipo M omogeneizzazione (M-tubo) e freddo su ghiaccio. </li><li> Etichetta 2 ml a vite tubi tappo, e aggiungere circa 300 perline Zirconia microlitri per ogni provetta. </li><li> Controllare gli strumenti sono disponibili: dissociatore di tessuto, beadbeater, tavolo centrifuga con adattatori per tubi da 50 ml e 96 pozzetti, fotometro. </li></ol></li></ol> 2. RNA Estrazione da tessuti infetti <ol><li> Rimuovere le provette contenenti reni da -80 ° C freezer e messo in ghiaccio. Aggiungere 1.2 ml di tampone RLT con 2-mercaptoetanolo per ogni rene. Decantare rene con tampone in un M-tipo tubi di omogeneizzazione. </li><li> Omogeneizzare il rene con un dissociatore tessuto sulla pre-caricato impostazione RNA_02.01. </li><li> Centrifugare a 1000 xg per 1 minuto in una centrifuga da tavolo a RT. </li><li> Trasferire 600 microlitri omogeneizzato alla provetta tappo a vite contenente Zirconia perline. Salvare il omogenato rimanente sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 600 microlitri fenolo: cloroformio: alcool isoamilico 25: 24: 1 ai tubi di passaggio precedente. </li><li> Chiudere i coperchi strettamente e vortex su beadbeater per 3 minuti in un 4 ° C cella. </li><li> Centrifugare le provette a 15.000 xg per 5 minuti a 4 ° C in camera fredda. </li><li> Trasferire accuratamente la fase acquosa in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml, mescolare bene con uguale volume di etanolo al 70%, quindi caricare sulla colonna di spin (carico due volte). </li><li> Lavare la colonna rotazione una volta con 700 microlitri di buffer RW, seguito da due volte con 500 microlitri di buffer RPE. Centrifugare uno minuto supplementare in un tubo di raccolta asciutto per rimuovere liquido residuo nella colonna di spin. Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 8.000 x g. </li><li> Eluire RNA con 50 microlitri H 2 O. Misurare la concentrazione di RNA a OD 260 utilizzando uno spettrofotometro. </li></ol> 3. profilo di espressione genica Utilizzo di Digital di codificazione <ol><li> Thaw codeset giornalista (provetta con tappo verde) e la cattura codeset (provetta con tappo grigio) sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 130 microlitri tampone di ibridazione per la riporter set di codici, capovolgere per mescolare e spin down. </li><li> Aggiungere 20 ml di miscela per ciascuna delle provette di reazione 12. </li><li> Aggiungere 10 mg di RNA totale del tessuto (in un volume di 5 ml) ad ogni provetta. Mescolare pipettando. </li><li> Aggiungere 5 ml di cattura set di codici per ogni provetta. Mescolare girando il tubo seguito da una rapida rotazione verso il basso. </li><li> Incubare le reazioni a 65 ° C in un termociclatore con coperchio riscaldato O / N (~ 18 ore). </li><li> Rimuovere una cartuccia campione da -20 ° C e farlo riscaldare a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere due piastre dei reagenti da 4 ° C e centrifugare a 670 xg per 2 minuti in una centrifuga da tavolo. </li><li> Impostare la stazione della preparazione seguendo le istruzioni passo-passo sullo schermo, selezionare l&#39;opzione alta sensibilità. </li><li> Rimuovere le reazioni dal termociclatore e caricare immediatamente sulla stazione di preparazione. Selezionare per eseguire il programma elevata sensibilità (3 ore). </li><li> Quando il programma stazione della preparazione, rimuovere la cartuccia e sigillare le corsie con un nastro adesivo trasparente. Apply olio minerale per il fondo della cartuccia (per la generazione di una nCounter solo, le generazioni successive non richiedono questo passaggio), quindi caricare la cartuccia sull&#39;analizzatore digitale. </li><li> Impostare l&#39;analizzatore digitale seguendo le istruzioni passo-passo sullo schermo, selezionare l&#39;opzione di scansione ad alta risoluzione. </li><li> Selezionare l&#39;opzione (600 campi) alta risoluzione, eseguire il programma di scansione (~ 4.5 ore). </li><li> Quando il programma scansione, scaricare i risultati (o scegliere di ricevere i risultati via e-mail), e importare i dati grezzi nel software del produttore. Il software controlla automaticamente la qualità dei dati e alzare le bandiere se la qualità dei dati cade fuori del range di normalità. Eseguire la regolazione tecnica usando la funzione built-in (opzionale, seguire le istruzioni del software), quindi esportare i dati in un file excel. </li><li> Normalizzare i dati utilizzando uno dei seguenti metodi: conteggi totali di tutti i geni nel codeset; uno o pochi geni di controllo interno; media geometricageni altamente espressi (vedi la discussione). </li><li> Calcolare i valori di espressione medi per ciascun gene (se l&#39;esperimento è stato fatto in replicati o triplicato), quindi calcolare il rapporto dei livelli di espressione tra i diversi gruppi sperimentali. </li><li> (opzionale) Analizzare e visualizzare i risultati di profilazione di funzioni incorporate nel software nSolver o un programma di clustering quali MultiExperiment Viewer 10. </li></ol>

<ol><li>Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host-infecting+fungal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">The host-infecting fungal transcriptome.</a> FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).</li>
<li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).</li>
<li>Creecy, J. P., Conway, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bacterial+transcriptomics+with+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq.</a> Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).</li>
<li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).</li>
<li>Malkov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Res Notes. 2, 80(2009).</li>
<li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+Alliance+of+Regulatory+Pathways+in+C.+albicans+during+Mammalian+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection.</a> PLoS Biology. 13, e1002076(2015).</li>
<li>O'Meara, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cryptococcus+neoformans+Rim101+Transcription+Factor+Directly+Regulates+Genes+Required+for+Adaptation+to+the+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host.</a> Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).</li>
<li>Cheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+Candida+albicans+Gene+Expression+During+Intra-Abdominal+Candidiasis+Identifies+Biologic+Processes+Involved+in+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis.</a> J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).</li>
<li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Targets+of+Candida+albicans+Biofilm+Regulator+Bcr1+in+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo.</a> Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).</li>
<li>Saeed, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TM4%3A+a+free%2C+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).</li>
</ol>

Questo protocollo è stato sviluppato nel laboratorio del Dr. Aaron P. Mitchell presso la Carnegie Mellon University. La pubblicazione di questo manoscritto è sponsorizzata da NanoString Technologies.

Questo protocollo è stato sviluppato per ottimizzare il profilo trascrizionale di infettare microbi utilizzando una piattaforma nanoString nCounter. L&#39;intera procedura, dalla raccolta di tessuto a dati di espressione, richiede meno di 48 ore. I hands-on tempo è di circa 4 h per 12 campioni. Una variabile fondamentale in questo protocollo è la quantità di tampone RLT aggiunto al tessuto al primo passo. Troppo buffer diluire l&#39;omogeneizzato e portare ad abbassare la concentrazione di RNA, mentre troppo poco buffer può portare alla formazione di gel viscoso dopo la fase di estrazione del fenolo cloroformio e non lasciano fase acquosa per il recupero dell&#39;RNA. I volumi ottimali empiricamente determinato di tampone RLT per tessuti di topo (assumendo dimensioni tipiche) sono: rene (1,2 ml), lingua (1,0 ml) e del polmone (2,0 ml). Per patogeni microbici, particolarmente questi coltivate in forma filamentosa, il passo tallone battendo aiuta a rompere parete cellulare spessa per far uscire completamente contenuto cellulare. Nella fase di eluizione, al fine di aumentare l&#39;RNA finalela concentrazione, il primo eluato turno può essere aggiunto di nuovo alla colonna, ed eluire una seconda volta. Circa 100 mg di RNA totale del tessuto possono essere recuperati da una colonna RNeasy rotazione (~ 2 mg / mL x 50 ml). Se è necessaria maggiore quantità di RNA, un secondo preparazione può essere effettuata dal restante omogenato tissutale. Non smaltire dell&#39;omogenato rimanente fino è stata misurata la concentrazione di RNA, per ogni evenienza. A seconda del modello di infezione, le dimensioni dell&#39;inoculo e il ceppo patogeno, la percentuale di patogeno RNA in RNA totale del tessuto varia da 0% -2%, e tipicamente rientra nella gamma 0,05% -0,5%. Ad esempio, 10 mg di RNA totale da tessuti C. albicans infettato rene potrebbe generare conteggi pari a quello di 10 ng di puro C. albicans RNA da una coltura in vitro (10 ng / mg 10 = 0,1%). Poiché la percentuale di patogeno RNA in RNA tissutale totale varia in un ampio intervallo, è difficile conoscere la quantità di pathogen RNA in una data quantità di RNA totale. Per evitare sprechi codeset (per 250 geni x 192 reazioni, il costo per reazione è di circa $ 200) su campioni con patogeno RNA al di sotto del livello di rilevamento, un passo di controllo di qualità dell&#39;RNA può essere eseguita per determinare il livello patogeno RNA in ciascun campione. Questo può essere fatto o Q-rtPCR o un piccolo codeset contenente alcuni geni housekeeping. Normalizzazione usando geni patogeni è un passaggio fondamentale prima che i profili di espressione può essere paragonato tra diversi campioni. Ci sono tre metodi comunemente usati per la normalizzazione. 1. Utilizzare i conteggi totali di tutti i geni nel codeset. 2. Utilizzare uno o pochi geni &quot;housekeeping&quot;. 3. Utilizzare la media geometrica (N esima del prodotto di N numeri) di geni altamente espressi. Per una grande codeset (&gt; 100 geni) contenente sonde selezionati casualmente, utilizzando conteggi totali per la normalizzazione può essere una buona scelta, perché i conteggi totali di un gran numero di geni indipendenti possono fedecorrispondere alla quantità di input RNA. Per un piccolo set di codici (geni) &lt;100 contenenti sonde focalizzate su uno specifico processo (come la crescita ifale, dato che i geni di crescita ifale tendono ad essere co-regolata), la scelta di uno o pochi geni housekeeping come controllo per la normalizzazione è essenziale. TDH3, un gene metabolico robusta espresso, ha servito bene come controllo per molti esperimenti. Il terzo metodo è un ibrido del metodo 1 e 2, con particolare attenzione per la parità contributo geni altamente espressi. Anche se la piattaforma non è nCounter genome wide-, permette la quantificazione del livello di espressione per un massimo di 800 geni in un singolo test. Pertanto, scegliendo i geni più informativi da analizzare è fondamentale per il successo della profilatura. Sono stati utilizzati due approcci per selezionare per le sonde. Il primo approccio è &quot;basata sulla conoscenza&quot;. Informazioni dall&#39;espressione pubblicata e sui dati funzionale è compilato allo schermo per i geni che sono di potenziale interesse per la correntestudiare, come i geni di risposta ambientali 6-9. Questo approccio consente un facile confronto di dati in vivo profilatura a molti set di dati già esistenti, fornendo in tal modo contesto l&#39;interpretazione dei dati. Il secondo approccio è &quot;esplorazione based&quot;. Una categoria di geni in un genoma microbo, come tutti i geni che specificano i fattori di trascrizione, chinasi o proteine ​​della parete cellulare sono scelti per le sonde. Questo approccio permette di identificare nuovi fattori di virulenza e di scoperta di nuovi rapporti normativi basati sulla profilazione dei dati in vivo 6.

Le dinamiche di espressione genica detiene informazioni vitali su come una cellula risponde ai cambiamenti ambientali. Nel caso di un microrganismo infettante, dati di espressione genica potrebbero fornire approfondimenti clinicamente rilevanti su come un agente patogeno si adatta all&#39;ambiente infezione e provoca danni all&#39;ospite. Negli ultimi due decenni, gli studi di espressione genica sia in vitro che in vivo hanno generato grande quantità di dati e gettato le basi per la comprensione della biologia infezione 1-3. Tuttavia, le tecnologie di profilazione attuali, compresa microarray e RNAseq, non sono ottimali per la profilazione dell&#39;espressione genica patogeno durante l&#39;infezione. Host RNA costituisce una porzione schiacciante (di solito&gt; 99%) del RNA totale isolato da campioni di tessuto infetto. L&#39;RNA ospite contribuisce ad alto background su microarray, e domina la sequenza legge da RNAseq. Isolamento cellulare patogeno dal tessuto infetto, in teoria, può contribuire ad arricchire per l&#39;RNA patogeni, ma pone aggiuntaAl problemi: richiede grandi quantità di tessuti infetti; la procedura può essere noioso; e, soprattutto, è difficile conservare allo stato nativo o integrità dell&#39;RNA durante il processo lungo. Al fine di generare dati più completi e precisi sull&#39;espressione genica patogeni durante le infezioni reali, abbiamo deciso di sviluppare un protocollo che consente una quantificazione affidabile e conveniente delle specie di RNA di minoranza in una popolazione mista di RNA. NanoString nCounter è una piattaforma recentemente sviluppato che rende la misurazione diretta multiplexed dell&#39;espressione genica mediante coppie di sonde con codici a barre digitali 4, 5. Questa piattaforma ha un livello di sensibilità paragonabile a quella di QRT-PCR, ma non necessita di amplificazione enzimatica. La tecnologia non è Genome-wide, permette il rilevamento di fino a 800 geni differenti in ogni test. Pertanto, è fondamentale per selezionare geni informativi come sonde per profilatura. Qui usiamo profilo di espressione genica studio di un grande ronzioun patogeno, Candida albicans, durante un&#39;infezione invasiva come esempio, per dimostrare: 1) dettagli tecnici delle procedure sperimentali (protocollo), 2) La sensibilità, riproducibilità e la gamma dinamica di questo metodo (risultati rappresentativi), e 3) Importante Considerazioni per la progettazione e l&#39;esecuzione di esperimenti basati su questo protocollo (discussione). Questo protocollo può essere facilmente adattato per vari patogeni ed è stato applicato con successo in un certo numero di modelli di infezione 6-9.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS Dissociatore</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentelMACS M tubo</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo: CHCl3: IAA</td><td>Sigma</td><td>P-2069</td><td></td></tr><tr><td>Perline di zirconia</td><td>Biospec Products</td><td>11079110zx</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec Products</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>nCounter Sistema di analisi</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCounter Gene Expression Codesets</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSolver Strumento di analisi</td><td>nanoString Technologies nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

profili di espressione genica di microbi che infettano utilizzare una piattaforma digitale di codificazione

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Per la maggior parte dei patogeni mammiferi, profili di espressione genica studi sono stati limitati da difficoltà tecniche per quantificare con precisione trascrizioni gene patogeno da tessuti infetti. Patogeni RNA costituisce una piccola parte del RNA totale isolato da campioni di tessuto infetto. Sia microarray e tecnologie RNAseq hanno difficoltà nel generare affidabile legge per i geni patogeni debolmente espressi. Ceppi patogeni mutanti con ridotta proliferazione in vivo rappresentano una sfida ancora più grande. Qui si descrive un vivo dell&#39;espressione genica protocollo profiling in quanto è molto veloce, estremamente sensibile e altamente riproducibile. Abbiamo sviluppato questo protocollo durante la nostra indagine sui funghi patogeni albicans Candida in un modello murino di candidosi disseminata ematogena. Usando questo protocollo, abbiamo documentato andamento nel tempo della C. regolata dinamicamente espressione genica albicans durante l&#39;infezione ai reni, e caratteristiche inaspettate scoperte dirisposte di espressione genica per antimicotico trattamento farmacologico in vivo.

Una sfida principale per l&#39;espressione genica patogeno profiling in vivo è quello di ottenere abbastanza legge da patogeno RNA. Data la bassa percentuale di trascritti patogeni in RNA totale, grandi quantità di RNA totale (&gt; 10 mg) deve essere usato per ogni reazione. La piattaforma ha un vantaggio unico in questa prospettiva: si utilizza sia una sonda di cattura ed una sonda relazione aumentare la specificità, in modo che la quantità enorme di RNA ospitante non causa un notevole livello di rumore. Come mostrato in Figura 1 (adattato da Rif. ​​6), il conteggio di prime da un campione di tessuto infetto (punti rossi) sono tutti inferiori 10, mentre conteggi di due campioni di tessuti infetti (punti blu) sono tutti superiori 10. Dati di espressione generati utilizzando questo protocollo sono altamente riproducibili. Come mostrato in figura 1 (adattato da Rif. ​​6), la conta prime da due repliche biologiche (puntini blu, campioni dopo l&#39;infezione ai reni 48 hr) aveva molto good correlazione con il valore R-quadrato è uguale a 0,945. La piattaforma fornisce anche gamma dinamica sufficiente a comprendere i livelli di espressione biologici naturali (Fig 1, conteggi compresi tra 1 e 10 10 6). Utilizzando un set di sonde che specifica 248 geni di risposta ambientali, siamo stati in grado di distinguere due fasi di espressione genica patogeno (Figura 2, adattato da Rif. ​​6): un gene risposta precoce espressione comprende geni con livelli di RNA molto diversi tra inoculo e 12 ore campioni post-infezione (p &lt;0,05 e&gt; cambia 2 volte in espressione), e una risposta di espressione genica in ritardo comprende geni con livelli di RNA che sono significativamente diversi tra il punto di tempo di 12 ore a campioni post-infezione 48 hr (P &lt;0.05 e&gt; cambiamento nell&#39;espressione 2 volte). Questi risultati indicano che C. espressione genica albicans è regolata dinamicamente durante infectio invasivan di un ospite mammifero. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig1.jpg" /> Figura 1. Raw conta da tessuti renali infetti e non infetti (adattato da Rif. ​​6). Sonda conta per due infetti (48 ore dopo l&#39;infezione, i punti dati blu) e uno (punti dati rossi) non infetti campioni renali sono presentate come una dispersione trama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53460/53460fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig2.jpg" /> Figura 2. Espressione di C. albicans geni sensibili all&#39;ambiente durante l&#39;infezione invasiva (adattati da Rif. ​​6). Le variazioni di livelli di espressione durante l&#39;invasione del rene del mouse per 248 C. geni albicans sono presentati in un calore mFormato ap. Valori medi di triplicato biologici sono mostrati fino-regolazione (giallo) e down-regolazione (blu) di geni a 12, 24, e 48 ore dopo l&#39;infezione rispetto a livelli medi di inoculo (0 ore). La saturazione del colore rappresenta la portata del cambiamento dell&#39;espressione, con la piena saturazione a 10 volte up- o down-regulation. Porzioni della mappa di calore sono espanse per illustrare rappresentante precoce up-regolate geni (in alto), i geni in ritardo (al centro), e geni primi down-regolati (in basso). In queste parti, singoli campioni sono presentate separatamente per illustrare la riproducibilità. Definiamo espressione cambia presto differenze significative tra l&#39;inoculo e 12 campioni hr. Definiamo modifiche in fase avanzata di espressione come differenze significative tra i campioni 12 e 48 hr. Significato si riferisce ai cambiamenti di&gt; 2 volte e un valore p &lt;0,05. I dati per ciascun campione sono stati normalizzati a livelli di RNA dal gene di controllo TDH3 prima sono stati calcolati i valori medi. I nostri criteri di assegnazione permettono qualche Dynamicageni lly regolati a cadere in entrambe le classi di espressione precoce e tardiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53460/53460fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Abbiamo sviluppato un protocollo veloce, sensibile e riproducibile per la profilazione dell'espressione genica dei patogeni durante un'infezione.

Profili di espressione genica di microbi che infettano utilizzare una piattaforma digitale di codificazione

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è misurare con precisione l'espressione genica del patogeno in vivo, al fine di chiarire come il patogeno si adatta all'ambiente infettivo e causa danni all'ospite. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie infettive per esplorare la dinamica dell'espressione genica dei patogeni durante un'infezione reale su diversi tipi di tessuto e in diversi punti temporali. Il principale vantaggio di questo metodo è l'elevata sensibilità e la notevole riproducibilità.Questo metodo rende possibile quantificare l'espressione genica del patogeno da piccole quantità di tessuto proveniente da un'infezione reale. Per iniziare la preparazione dei reagenti, aggiungere 2-mercaptoetanolo al buffer RLT e mescolare accuratamente. Preparare una miscela 25:24:1 di fenolo-cloroformio-alcol isoamilico.Etichettare provette di omogeneizzazione di tipo M e raffreddarle sul ghiaccio. Etichettare provette con tappo a vite da due millilitri e aggiungere circa 300 microlitri di perle di zirconia in ciascuna provetta. Tenere pronti i seguenti strumenti per l'uso: un dissociatore di tessuti, un agitatore a perle, una centrifuga da banco con adattatori per provette da 50 millilitri e piastre a 96 pozzetti, e un fotometro.Rimuovere i reni precedentemente congelati isolati da topi infettati da C.albicans da un congelatore a -80 °C e porli sul ghiaccio. Aggiungere 1,2 millilitri di buffer RLT a ciascun rene. Quindi versare con cautela ciascun rene con il buffer in un tubo di omogeneizzazione di tipo M.La quantità di tampone RLT utilizzata è determinata empiricamente. Un eccesso di tampone RLT diluirà la concentrazione del campione, mentre una quantità insufficiente renderà l'omogenato molto viscoso e difficilissimo da manipolare. Successivamente, utilizzando un dissociatore tessutale impostato sul programma predefinito RNA 2.01, omogeneizzare i reni.Quindi, centrifugare a 1000 x G per un minuto. Trasferire 600 microlitri di ciascun omogenato in una provetta con tappo a vite contenente perle di zirconia e conservare l'omogenato rimanente sul ghiaccio. Aggiungere 600 microlitri di fenolo-cloroformio alcol isoamilo a ciascuna provetta, chiudere bene i tappi ed eseguire il vortex sul bead beater per tre minuti a quattro gradi Celsius.Centrifugare a 15.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire con attenzione la fase acquosa in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri, aggiungendo un volume uguale di etanolo al 70%. Quindi caricare sulla colonna da centrifuga e centrifugare a 8.000 x G. Lavare ogni colonna con 700 microlitri di buffer RW, seguito da due lavaggi con 500 microlitri di buffer RPE.Trasferire le colonne in provette di raccolta asciutte e centrifugare per un minuto aggiuntivo per rimuovere qualsiasi liquido residuo. Infine, utilizzare 50 microlitri di acqua per eluire l'RNA. Successivamente, utilizzare uno spettrofotometro a OD 216 nm per misurare la concentrazione di RNA.Per eseguire il profiling dell'espressione genica mediante digital bar-coding, iniziare scongelando il set di codici reporter e il set di codici di cattura in ghiaccio. Aggiungere 130 microlitri di buffer di ibridazione al set di codici reporter. Invertire per mescolare e centrifugare brevemente.Successivamente aggiungere 20 microlitri della miscela a ciascuna delle 12 provette per reazione. Quindi aggiungere 10 microgrammi di RNA totale del tessuto a ciascuna provetta e mescolare mediante pipettaggio. A seconda del modello di infezione, della dimensione dell'inoculo e del ceppo del patogeno utilizzato, la percentuale di RNA del patogeno all'interno dell'RNA totale varia dallo 0 al 2%. Pertanto, la quantità totale di RNA da aggiungere per ciascuna provetta deve essere ottimizzata empiricamente.Aggiungere ora cinque microlitri di set di codici di cattura a ciascuna provetta. Mescolare capovolgendo delicatamente le provette e centrifugare brevemente. Incubare quindi le reazioni in un termociclatore a 65 gradi Celsius con coperchio riscaldato per circa 18 ore.Rimuovere un cartuccia campione da 20 gradi celsius e lasciarla riscaldare a temperatura ambiente. Rimuovere due piastre di reagenti da quattro gradi celsius e centrifugare in una centrifuga da banco a 670 x G per due minuti. Successivamente, configurare la stazione di preparazione seguendo le istruzioni passo dopo passo sullo schermo, selezionando l'opzione ad alta sensibilità.Quindi rimuovere le reazioni dal termociclatore e caricarle immediatamente sulla stazione di preparazione. Dopo aver eseguito il programma ad alta sensibilità della durata di tre ore, rimuovere la cartuccia e sigillare le corsie con del nastro trasparente. Applicare olio minerale sulla parte inferiore della cartuccia, se necessario.Quindi caricare la cartuccia sull'analizzatore digitale. Configurare l'analizzatore digitale seguendo le istruzioni passo-passo visualizzate sullo schermo, selezionando l'opzione di scansione ad alta risoluzione. Dopo aver eseguito il programma di scansione, scaricare i risultati o scegliere di riceverli via posta elettronica e importare i dati grezzi nel software del produttore.Analizzare i dati secondo il protocollo descritto nel testo. Il protocollo illustrato in questo video presenta il vantaggio unico di utilizzare sia una sonda di cattura che una sonda di rilevamento per aumentare la specificità e ridurre il rumore proveniente dall'RNA dell'ospite. Come mostrato qui, i conteggi grezzi di fondo provenienti da un campione di tessuto non infetto erano tutti inferiori a 10, mentre i conteggi grezzi provenienti da due campioni di tessuto infetti erano tutti superiori a 10.I conteggi grezzi di due campioni biologici hanno mostrato un'ottima correlazione con un valore di R quadrato pari a 0,945. La piattaforma fornisce inoltre un'ampia gamma dinamica sufficiente a comprendere i livelli naturali di espressione biologica. Utilizzando un set di sonde specifico per 248 geni della risposta ambientale, sono state identificate due fasi dell'espressione genica del patogeno.Una risposta precoce nell'espressione genica comprende geni i cui livelli di RNA differiscono significativamente tra il campione iniziale (inoculo) e quelli a 12 ore dal contagio. È stata inoltre identificata una risposta tardiva nell'espressione genica, costituita da geni con livelli di RNA significativamente diversi tra il tempo di 12 ore e quello di 48 ore dopo l'infezione. Questi risultati indicano che l'espressione genica di C.albicans è regolata in modo dinamico durante l'infezione invasiva in un ospite mammifero.Questo metodo è semplice e rapido. L'intero procedimento, dalla raccolta del tessuto all'analisi dei dati, richiede meno di 48 ore. Il tempo effettivo di lavoro è di circa quattro ore per 12 campioni.Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per catturare l'espressione genica del patogeno in vivo, lo stesso può essere utilizzato anche per analizzare l'espressione genica dell'ospite. Pertanto, i ricercatori possono ottenere informazioni utili da entrambi i lati di un'infezione contemporaneamente.

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