Profili di espressione genica di microbi che infettano utilizzare una piattaforma digitale di codificazione

L'obiettivo generale di questo esperimento è misurare con precisione l'espressione genica del patogeno in vivo al fine di far luce su come un agente patogeno si adatta all'ambiente infettivo e provoca danni al suo ospite. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie infettive per esplorare le dinamiche di espressione genica dei patogeni durante un'infezione reale su vari tipi di tessuto e in più punti temporali. Il vantaggio principale di questo metodo è che è altamente sensibile ed estremamente riproducibile.

Questo metodo rende possibile quantificare l'espressione genica del patogeno da una piccola quantità di tessuti di un'infezione nella vita reale. Per iniziare a preparare i reagenti, aggiungere il 2-mercaptoetanolo al tampone RLT e mescolare bene. Preparare una miscela 25:24:1 di soluzione di alcol isoamilico fenolo-cloroformio.

Etichettare le provette di omogeneizzazione di tipo M e raffreddarle con ghiaccio. Etichettare due provette con tappo a vite da millilitri e aggiungere circa 300 microlitri di perle di zirconia a ciascuna provetta. Tenere a portata di mano i seguenti strumenti, tra cui un dissociatore tissutale, un battitore di microsfere, una centrifuga da tavolo con adattatori per provette da 50 millilitri e piastre da 96 pozzetti e un fotometro.

Rimuovere i reni precedentemente congelati isolati da topi infetti da C.albicans da un congelatore a 80 gradi Celsius e metterli sul ghiaccio. Aggiungere 1,2 millilitri di tampone RLT a ciascun rene. Quindi travasare ogni rene con il tampone in una provetta di omogeneizzazione di tipo M.

La quantità di RLT tampone utilizzata è determinata empiricamente. Troppo RLT tampone diluirà la concentrazione del campione, mentre troppo poco renderà l'omogenato molto viscoso ed estremamente difficile da maneggiare. Successivamente, utilizzando un dissociatore tissutale sull'RNA 2.01 precaricato, omogeneizzare i reni.

Quindi, centrifugare a 1000 x G per un minuto. Trasferire 600 microlitri di ciascun omogeneizzato in una provetta con tappo a vite contenente perle di zirconia e conservare l'omogeneizzato rimanente in ghiaccio. Aggiungere 600 microlitri di alcol isoamilico fenolo-cloroformio in ogni tubo, chiudere ermeticamente i coperchi e agitare la frusta per tre minuti a quattro gradi Celsius.

Centrifugare a 15.000 g per cinque minuti a quattro gradi centigradi. Trasferire con cura la fase acquosa in una nuova provetta per microfughe da 1,5 millilitri, aggiungendo un volume uguale di etanolo al 70%. Quindi caricare sulla colonna di centrifuga e centrifugare a 8.000 x G. Con 700 microlitri di tampone RW, lavare una volta ogni colonna di centrifuga, seguita da due lavaggi con 500 microlitri di tampone RPE.

Trasferire le colonne in provette di raccolta asciutte e centrifugare un minuto in più per rimuovere il liquido residuo. Infine, utilizzare 50 microlitri di acqua per eluire l'RNA. Quindi utilizzare uno spettrofotometro a 216 animetri OD per misurare la concentrazione di RNA.

Per eseguire la profilazione dell'espressione genica utilizzando il codice a barre digitale, iniziare scongelando il set di codici reporter e il set di codici di cattura su ghiaccio. Aggiungere 130 microlitri di tampone di ibridazione al set di codici del reporter. Capovolgi per mescolare e gira verso il basso.

Quindi aggiungere 20 microlitri di miscela a ciascuna delle 12 provette di reazione. Quindi aggiungere 10 microgrammi di RNA tissutale totale a ciascuna provetta e mescolare mediante pipettaggio. A seconda del modello di infezione, delle dimensioni dell'inoculo e del ceppo patogeno utilizzato, la percentuale di RNA patogeno all'interno dell'RNA totale varia dallo 0 al 2%Pertanto, la quantità totale di RNA che deve essere aggiunta per ciascuno dovrebbe essere ottimizzata empiricamente.

Ora aggiungi cinque microlitri di codice di acquisizione impostato su ciascuna provetta. Mescolare capovolgendo i tubi e girare rapidamente verso il basso. Quindi incubare le reazioni in un termociclatore a 65 gradi Celsius con un coperchio riscaldato per circa 18 ore.

Rimuovere un sample cartuccia da 20 gradi Celsius e lasciarlo scaldare a temperatura ambiente. Rimuovere due piastre di reagenti da quattro gradi Celsius e centrifugarle in una centrifuga da tavolo a 670 x G per due minuti. Quindi, configurare la stazione di preparazione seguendo le istruzioni dettagliate sullo schermo, selezionando l'opzione ad alta sensibilità.

Quindi rimuovere le reazioni dal termociclatore e caricare immediatamente sulla stazione di preparazione. Dopo aver eseguito il programma ad alta sensibilità della durata di tre ore, rimuovere la cartuccia e utilizzare del nastro adesivo trasparente per sigillare le corsie. Se necessario, applicare olio minerale sul fondo della cartuccia.

Quindi caricare la cartuccia sull'analizzatore digitale. Configurare l'analizzatore digitale seguendo le istruzioni dettagliate sullo schermo, selezionando l'opzione di scansione ad alta risoluzione. Dopo aver eseguito il programma di scansione, scarica i risultati o scegli di riceverli via e-mail e importa i dati grezzi nel software del produttore.

Analizza i dati secondo il protocollo di testo. Il protocollo dimostrato in questo video ha il vantaggio unico di utilizzare sia una sonda di cattura che una sonda di rapporto per aumentare la specificità e ridurre il rumore dell'RNA ospite. Come mostrato qui, i conteggi grezzi di fondo di un campione di tessuto non infetto erano tutti inferiori a 10, mentre i conteggi grezzi di due campioni di tessuto infetto erano tutti superiori a 10.

I conteggi grezzi di due campioni biologici avevano un'ottima correlazione con un valore R al quadrato di 0,945. La piattaforma fornisce anche una gamma dinamica sufficiente per comprendere i livelli di espressione biologica naturale. Utilizzando un set di sonde che specifica 248 geni di risposta ambientale, sono state determinate due fasi dell'espressione genica del patogeno.

Una risposta precoce all'espressione genica comprende geni con livelli di RNA significativamente diversi tra l'inoculo e i campioni post-infezione di 12 ore. È stata scoperta anche una risposta tardiva all'espressione genica che comprende geni con livelli di RNA significativamente diversi tra i campioni post-infezione a 12 ore e quelli a 48 ore. Questi risultati indicano che l'espressione genica di C. albicans è regolata dinamicamente durante l'infezione invasiva di un ospite mammifero.

Questo metodo è facile e veloce. L'intera procedura, dalla raccolta dei tessuti all'estrazione dei dati, richiede meno di 48 ore. Il tempo di hands-on è di circa quattro ore per 12 campioni.

Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per catturare l'espressione genica del patogeno in vivo, lo stesso può essere utilizzato anche per rispondere all'espressione genica dell'ospite. Pertanto, i ricercatori possono ottenere informazioni utili da entrambi i lati di un'infezione contemporaneamente.