Rilevazione multiplex di batteri in campioni clinici complessi ed Ambientali con oligonucleotidi accoppiati microsfere fluorescenti

Ciao, sono Tim Duso di Agriculture and AgriFood Canada. In questo video, dimostreremo un protocollo per determinare la presenza e l'abbondanza di microrganismi specifici in un campione clinico o ambientale complesso utilizzando uno strumento bio plex. Questo protocollo utilizza perle di polistirene fluorescenti accoppiate chimicamente a una sonda oligonucleotidica specifica per specie.

Un amplicone viene generato dal campione utilizzando primer PCR universali e l'amplicone viene ibridato alle perle accoppiate alla sonda. Con lo strumento bio plex vengono generati due segnali. Uno identifica il tallone e uno quantifica il segnale di ibridazione.

L'obiettivo generale della procedura è quello di determinare un profilo del microbiota di interesse in modo rapido e semi-quantitativo. Abbiamo applicato questa tecnica per determinare i profili batterici nei tamponi vaginali e utilizzare i dati generati per diagnosticare la vaginosi batterica, una condizione clinica caratterizzata da un cambiamento nel microbiota in cui gli organismi lactobacillus diventano meno prevalenti e altri organismi come Gardnerella, vais e apoian vae diventano rilevabili nei tamponi vaginali. È importante tenere presente, tuttavia, che questa tecnica può essere applicata a qualsiasi altro microbiota per il quale è auspicabile un test multiplex rapido.

Iniziamo descrivendo come funziona la procedura. Un profilo microbico viene generato amplificando una proteina e rivestendo un chaperone genico in 60 da tutti gli organismi presenti nell'estratto di DNA A del tampone. Uno dei primer di amplificazione universali viene modificato mediante l'aggiunta di biotina e l'inclusione di basi modificate fosfoate.

All'estremità a cinque primi, l'amplicone viene reso a singolo filamento utilizzando la nucleasi dell'esone T sette, che degrada solo il filamento antisenso. Poiché il filamento sensoriale è protetto da un primer PCR modificato con fosfoato, le sonde oligonucleotidiche complementari al filamento rimanente sono accoppiate in modo covalente a perle di polistirene fluorescenti. Con ogni colore unico di perlina contenente una sonda che rileva un organismo diverso, è possibile utilizzare fino a cento perle diverse per un singolo campione.

Il prodotto PCR a singolo filamento del tampone vaginale viene ibridato in una miscela di perle accoppiate a sonda contenente sonde per tutti gli organismi di interesse. Viene aggiunta una reporter fluorescente FICO etina che si lega alle sonde biotinilate attraverso un coniugato strep din. Infine, la miscela di ibridazione viene analizzata su uno strumento luminex o bio plex, che esamina ogni perlina individualmente per l'identità e il segnale di ibridazione.

I risultati di questa analisi indicano la presenza di microrganismi specifici e l'intensità del segnale di ibridazione è correlata all'abbondanza di tale organismo. Nel campione, la presenza di organismi correlati alla BV può essere utilizzata per diagnosticare la BV. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la grande colorazione, è che vengono generate informazioni sulla presenza di microrganismi specifici e sulla loro abbondanza.

A dimostrare la procedura sarà Jennifer Town, assistente di ricerca Nel nostro laboratorio, sospende nuovamente le microsfere vorticando per circa 20 secondi. Trasferire 400 microlitri di microsfere in una centrifuga a provetta einor a 14.000 volte G per un minuto, rimuovere e gettare la snat Resus. Sospendi le microsfere in 50 microlitri di MES 0,1 molare pH 4,5.

Aggiungere un animo di oligo di cattura alle microsfere e mescolare a vortici. Aggiungere 2,5 microlitri di soluzione EDC fresca alle microsfere. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.

Scartare la soluzione EDC preparata in precedenza e preparare un campione fresco di 10 milligrammi per millilitro EDC in acqua. Come sopra, aggiungere altri 2,5 microlitri di soluzione EDC fresca alle microsfere e agitare per cinque secondi. Incubare nuovamente a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.

Lavare le perle aggiungendo un millilitro di 0,02% di vortice tra 20 per risospendere la centrifuga delle perle a 14.000 volte G.Per un minuto, rimuovere e scartare il surnatante. Lavare nuovamente le perline aggiungendo un millilitro di SDS Resus. Sospendere le perle in 100 microlitri di tampone.

Enumerare le perle in un emocitometro Per determinare la concentrazione di stock. Preparare una miscela master di microsfere diluendo ciascuna perlina a una concentrazione finale di 100 perle per microlitro nel pool tampone delle microsfere accoppiate secondo il plesso desiderato del saggio Conservare la miscela master di microsfere a quattro gradi al buio. Questa miscela può essere conservata per mesi se conservata in queste condizioni, genera un prodotto PCR per ogni campione.

Includere il set di cinque primer primi modificati con fosfolato e biotina subito dopo il completamento della PCR. Aggiungere due microlitri di esonucleasi T sette a ciascuna provetta PCR, incubare a temperatura ambiente per 40 minuti. Al termine di questa incubazione, aggiungere 12,5 microlitri di 0,5 molari E-D-T-A-P-H 8.0 in miscela.

Ciò fornisce un totale di circa 64,5 microlitri di prodotto PCR a singolo filamento. Resus Bend Microsphere master mix con una pipetta. Erogare una quantità adeguata in un tubo di einor.

Tappare il tubo e sonicare a bagnomaria sonica per due minuti. Erogare 17 microlitri di prodotto PCR a filamento singolo negli appositi pozzetti di un 96 a basso profilo. La piastra a pozzetti aggiunge 33 microlitri di miscela di perle sonicate risospese a ciascuna.

Coprire bene la piastra con un coperchio in silicone e picchiettare. Mettere delicatamente la piastra nel termociclatore con un programma di 95 gradi per cinque minuti, 60 gradi per 10 minuti, 60 gradi di mantenimento o pausa di 60 gradi per cinque minuti. Fine, avvia il programma.

Prepara una soluzione fresca di etina Aden FICO per streptococco. Avrai bisogno di 25 microlitri per pozzetto. Prepara lo streptococco e l'etina FICO diluendo il gambo a un milligrammo per millilitro.

Uno su 50-20 microgrammi per millilitro con tampone tmac una volta. Quando il termociclatore raggiunge la fase di tenuta a 60 gradi, aprire il coperchio, rimuovere il coperchio in silicone e aggiungere la soluzione di etina FICO direttamente a ciascuno. Bene, riposizionare il coperchio in silicone, chiudere il coperchio del termociclatore e riprendere il programma.

Al termine del programma, estrarre la lastra e trasferirla rapidamente alla macchina bio plex per la lettura. La targa deve essere letta entro 10 minuti. Leggere la targhetta a 60 gradi.

Assicurarsi che il bio plex sia stato preriscaldato a questa temperatura. Questo mostra i risultati delle corrispondenti colorazioni di Gram e dei profili luminex di campioni longitudinali di un singolo individuo al tempo zero. La colorazione di Gram è coerente con una diagnosi clinica di bv, e ciò è corroborato da un test Fiveplex Luminex che mostra segnali di ibridazione positivi per gli organismi associati alla BV, tra cui Gardner Relic, vais e Apoian Vae.

Anche il Lactobacillus Iners viene rilevato a bassi livelli con il passare del tempo. Questo individuo passa da un microbiota BV a un microbiota normale, come mostrato dalle colorazioni di gram. L'analisi Luminex di questi stessi campioni mostra che l'abbondanza di Gardnerella Vaginalis raggiunge il picco e diminuisce, mentre i lactobacillus iners aumentano fino a diventare l'organismo dominante entro il punto temporale finale.

Utilizzando questo metodo per la profilazione del microbiota, vengono generate informazioni sulla presenza di organismi specifici e sulla loro abbondanza. Poiché il metodo è basato su sequenze, la progettazione della sonda può essere informata da un'analisi di sequenziamento profonda e i microrganismi identificati dai metodi di sequenziamento di nuova generazione possono essere tracciati nei campioni in modo rapido e relativamente economico. La visione di questo video dovrebbe aver fornito una buona comprensione di come generare un profilo microbico da un campione utilizzando lo strumento Luminex o Bio Plex.

Vi abbiamo mostrato come accoppiare le sonde oligonucleotidiche alle sfere fluorescenti, generare alicon a singolo filamento da un campione clinico o ambientale, eseguire l'ibridazione e determinare i risultati su uno strumento Luminex o Bio Plex. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.