Barcoding genetica con proteine ​​fluorescenti per applicazioni multiplexati

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di codificare a barre le cellule di mammifero in fluorescenza per migliorare i saggi biologici multiplex ad alto rendimento che si basano su letture fluorescenti distinte. Per fare ciò, le particelle retrovirali vengono utilizzate per esprimere stabilmente le proteine fluorescenti nelle cellule dei mammiferi, codificandole così a barre. Successivamente, viene eseguita la selezione cellulare attivata fluorescente per ottenere popolazioni clonali con codice a barre.

Le popolazioni clonali vengono quindi amplificate, combinate e analizzate mediante citometria a flusso per confermare che possono essere distinte l'una dall'altra e quindi utilizzate contemporaneamente. Infine, le linee cellulari con codice a barre vengono trasdotte con saggio marcato. Le proteine e l'attività biologica sono monitorate utilizzando canali fluorescenti distinti dai canali con codice a barre.

I risultati dimostrano l'utilità del rivestimento a barre fluorescenti di cellule di mammifero per applicazioni multiplex in un ambiente ad alto rendimento. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti che richiedono un'attenta calibrazione dell'anticorpo o del colorante è che una volta stabilite le linee cellulari geneticamente codificate a barre, non richiedono ulteriori manipolazioni e, poiché la proteina di interesse viene espressa per lunghi periodi di tempo, vengono utilizzate ulteriormente per gli adattamenti biologici. L'accoppiamento di linee cellulari fluorescenti geneticamente codificate a barre con saggi di superficie ci consente di studiare le funzioni o gli effetti biologici in modo indipendente in un formato di idro throughput.

Nel nostro esempio, utilizziamo il rivestimento a barre genetiche fluorescenti per monitorare la scissione di diversi substrati virali che multiplexing. Il test può essere ulteriormente sfruttato per studiare i macchinari coinvolti nella scissione e per la scoperta di farmaci ad alto rendimento. Il giorno prima della trasfezione seminare una piastra di 10 centimetri con 2,5 volte 10 alla sesta cella Phoenix GP in DMEM con il 10% di FBS.

Questa linea cellulare di imballaggio esprime stabilmente le proteine gag e pole per la formazione di particelle retrovirali in trance. Il giorno della trasfezione, utilizzare un microscopio a campo chiaro per esaminare le cellule. Le cellule devono essere sane e aderire alla piastra in un monostrato da utilizzare per la trasfezione.

Quindi, preparare la miscela di trasfezione del DNA a 125 microlitri di siero libero. DMEM. Aggiungere tre microgrammi di vettore glicoproteico dell'involucro dell'involucro della stomatite vescicolare, P-C-I-V-V-G, e tre microgrammi di vettore di trasferimento che trasporta il gene della proteina fluorescente di interesse, aggiungere 15 microlitri di reagente di trasfezione della polieterammina e mescolare per ottenere particelle virali che trasportano diversi marcatori proteici fluorescenti. Esegui ogni trasfezione in modo indipendente con il marcatore che preferisci.

Incubare ogni miscela a temperatura ambiente per 15 minuti dopo il trasfetto di incubazione aggiungendo la miscela alle cellule. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius. Facoltativamente, dopo 24 ore, sostituire il terreno con sette millilitri di terreno fresco.

Sebbene ciò possa migliorare la salute delle cellule, può ridurre la carica virale nel surnatante. 48 ore dopo la trasfezione, utilizzare un pipettatore per trasferire il surnatante, che contiene le particelle virali in una siringa da 10 millilitri. Dotato di un filtro in politetrafluoroetilene da 0,20 micromolari per premere lo stantuffo per erogare il filtrato in provette da microcentrifuga da due millilitri.

Mettere da parte un'aliquota di due millilitri per l'uso immediato. Mettere il residuo del virus e le aliquote sul ghiaccio e trasferirli a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino a quando non vengono utilizzati 24 ore prima della trasduzione in ciascun pozzetto di un seme di una piastra a sei pozzetti da 2,0 a 3,0 volte 10 alla quinta cellula aderente qui 2 9 3 cellule T vengono utilizzate il giorno successivo. Per trasdurre le cellule aderenti, rimuovere il terreno esistente dalla piastra.

Aggiungere cinque microgrammi per millilitro di poly brain ai due millilitri del seno virale precedentemente raccolto e aggiungere la miscela con attenzione alle cellule. Sigillare le piastre con il profumo. Quindi posizionare i piatti in un secchio sospeso.

Centrifugare centrifugare a 1500 volte G per 120 minuti a 32 gradi Celsius. Dopo la centrifuga, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore, sostituire il terreno di coltura delle celle almeno 72 ore.

Post trasduzione. Prepararsi ad analizzare le cellule trasdotte mediante citometria a flusso per quantificare il tasso percentuale di trasduzione. Innanzitutto, utilizzando una linea cellulare non trasdotta comparabile come controllo negativo, assicurarsi che i gate siano impostati correttamente nei canali giusti.

Impostare il parametro tensione del canale in modo che la popolazione negativa sia inferiore al valore di 10 al terzo su ciascun asse fluorescente di interesse. Quindi, imposta i cancelli per la fluorescenza positiva come eventi che appaiono oltre quello del controllo negativo. Quindi, utilizzando le cellule trasdotte, determinare la percentuale positiva per lo specifico canale fluorescente.

Smistare le cellule in provette coniche da 15 millilitri contenenti un millilitro di FBS al 100%. Quindi centrifuga le popolazioni ordinate in un secchio sospeso. Centrifuga a rotore a 524 volte G a 32 gradi Celsius per cinque minuti.

Dopo la centrifuga, risospendere le cellule in un millilitro di terreno fresco, quindi seminare due volte 10 alle sei cellule in due millilitri di DMEM su una piastra di sei centimetri. A questa concentrazione, la confluenza è inferiore al 60% e consentirà la crescita e la divisione per almeno due giorni. Posizionare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius per diversi giorni per consentire il tempo per l'amplificazione.

Le popolazioni clonali possono essere generate sia dalle cellule originariamente trasdotte che da quelle selezionate. In questa fase, l'ordinamento di popolazioni ristrette in base alla fluorescenza scelta piuttosto che ai singoli cloni garantisce una popolazione di riserva per la selezione futura. Se necessario, impostare i cancelli per lo smistamento in base alle popolazioni di interesse, assicurarsi che i cancelli siano posizionati ad almeno una scala di log l'uno dall'altro Per ottenere popolazioni distinguibili utilizzando un'unità di deposizione cellulare automatizzata, ordinare le singole celle in piastre da 96 pozzetti, tenere presente che ci sarà una media di una cella per pozzetto.

Alcuni pozzetti potrebbero non avere celle e altri potrebbero avere più di un seguito. Smistamento, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per almeno due settimane Per amplificare i singoli cloni. Esaminare regolarmente le cellule al microscopio per assicurarsi che le popolazioni in crescita derivino da singole cellule e non da più di una.

Assicurati anche che le cellule non diventino troppo cresciute dopo che sono trascorse due settimane. Esaminare le popolazioni clonali putative mediante citometria a flusso e confrontarle con una popolazione di controllo negativa. Le vere popolazioni clonali dovrebbero avere modelli di fluorescenza molto stretti.

Scegli le popolazioni più nettamente separate in base all'intensità media e alla tenuta della popolazione. Amplificarli secondo necessità o conservare le scorte in un mezzo di congelamento con il 10% di DMSO a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per brevi periodi di tempo o azoto liquido più a lungo. Successivamente, per verificare se le popolazioni clonali possono essere utilizzate con successo in un sistema di screening multiplex ad alto rendimento.

Scegli un set di cloni con assorbimento, spettri di emissione e/o intensità diverse distinguibili e combinali in un unico seme in provetta. 50.000 delle cellule combinate in 200 microlitri di DMEM integrato in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti in provette separate. Preparare i controlli negativi e a colore singolo da utilizzare per l'impostazione dei parametri e dei valori di compensazione sul citometro a flusso.

Impostare i valori di compensazione. Quindi analizzare il campione per assicurarsi che ciascuna delle linee cellulari fluorescenti indipendenti possa essere distinta. Per adattare le linee cellulari con codice a barre a un'applicazione biologica, selezionare innanzitutto gli elementi del saggio che sono stati ingegnerizzati in modo tale da essere accoppiati a un tag o a una proteina fluorescente come fusione o attraverso un sito di ingresso interno del ribosoma.

Ires, che consente il rilevamento diretto attraverso la citometria a flusso con western blotting o una microscopia. Il sistema qui utilizzato consiste in un saggio biologico in cui una proteina dell'involucro dell'HIV viene espressa sulla superficie della cellula, esponendo il suo HA e le etichette flag. La proteina del saggio è espressa in una cellula con codice a barre che esprime il pomodoro TD.

La scissione della proteina può essere monitorata mediante colorazione con un anticorpo Anti-Flag marcato con FSE. Quando la proteina non è scissa, si vede la colorazione, ma quando la proteina è scissa, l'etichettatura a fluorescenza verde non è più evidente. Per stabilire il saggio biologico nelle cellule con codice a barre, trasdurle con particelle virali che contengono gli elementi del saggio di scelta.

Aggiungere la natina virale di SUP alle cellule di scelta e centrifugare. Successivamente, incubare le cellule con anticorpi anti HA marcati in fluorescenza. Quindi ordinare le cellule con codice a barre per isolare quelle che contengono elementi del saggio positivi per l'ha.

Infine, sono state combinate linee cellulari con codice a barre distinte. Ciascuno contiene un saggio con un substrato diverso. Incubare la miscela di cellule con anticorpi coniugati Anti-Flag e ZI e analizzarle mediante citometria a flusso per determinare se si è verificata una scissione della proteina per risalire al saggio, analizzare o decodificare le popolazioni nel canale appropriato in cui è possibile distinguere le linee cellulari geneticamente distinte con codice a barre

Il canale PE per il pomodoro TD decodifica quindi la natura del substrato analizzando nel canale fite per rivelare la popolazione positiva al test per la scissione delle proteine espresse in superficie nella via secretoria. Sub T una cellula per il codice a barre fluorescente per esprimere il pomodoro TD e ordinate in tre popolazioni a diverse intensità. Ciascuna delle popolazioni è stata quindi trasdotta con un retrovirus diverso per indurre l'espressione della proteina dell'involucro dell'HIV di tipo selvaggio, della proteina dell'involucro dell'HIV mutante o del virus della dengue.

Proteina di confine PRM, ciascuna affiancata da flag e tag HA. Le cellule trasdotte sono state incubate con anticorpi anti HA e Anti-Flag. La colorazione anti HA è stata eseguita per confermare la presenza della proteina del saggio ingegnerizzata, mentre la colorazione anti-flag è stata eseguita per determinare se era stata tagliata.

Quando le popolazioni combinate non colorate sono state analizzate mediante citometria a flusso, le popolazioni clonali erano distinguibili in base al codice a barre del pomodoro TD, ma indistinguibili dal canale fite. Al contrario, quando le stesse popolazioni sono state colorate con l'anticorpo flag fite, una popolazione era positiva per flagg. Sulla base del codice a barre, questa popolazione può essere facilmente identificata come la popolazione che porta il substrato dell'involucro dell'HIV mutante.

Ora, dovresti avere un'ottima comprensione di come utilizzare la tecnologia della valvola retrò insieme alla citometria a flusso. Al fine di stabilire linee cellulari con codice a barre geneticamente fluorescenti, quattro applicazioni biologiche in un formato multiplex, La capacità di accoppiare cellule geneticamente con codice a barre fluorescenti con saggi basati su cellule in un formato multiplex migliora notevolmente le capacità di produzione elevata. Dopo che le linee cellulari sono state generate, è importante congelarle.

Quindi scongelali periodicamente, rianalizzali e li libera di nuovo. Sebbene la generazione di linee cellulari con codice a barre genetiche fluorescenti possa richiedere molto tempo all'inizio, una volta stabilite, migliorano notevolmente la ripetibilità e la robustezza delle applicazioni future.