Split-e-pool Sintesi e caratterizzazione di peptidi Terziario Ammide Biblioteca

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come sintetizzare librerie combinatorie contenenti unità peptidiche terziarie o PTA. Ciò si ottiene preparando prima un sub monomero PTA da amminoacidi naturali. Il secondo passo consiste nel sintetizzare una regione linker peptidica su un supporto solido.

Successivamente, viene sintetizzata una libreria combinatoria contenente PTA e subunità peptidiche. Il passaggio finale consiste nel caratterizzare la libreria sintetizzata per garantire la qualità della sintesi. In definitiva, viene sintetizzata una libreria combinatoria contenente subunità confermative di PTA ristrette e tale libreria può essere utilizzata per lo screening ad alto rendimento per fornire ligandi proteici e portare alla scoperta di nuovi farmaci.

Quindi la chimica che è l'argomento di questo articolo è stata sviluppata nel tentativo di cercare di trovare molecole che fossero molto più rigide di alcuni dei peptidi e di altre cose con cui avevamo lavorato in precedenza. L'idea è che se si identificano librerie di molecole più rigide e queste si legheranno a bersagli proteici con affinità molto più elevate, e abbiamo pensato che questo fosse molto, molto importante nel tentativo di sviluppare farmaci in futuro o, o anche molecole di sonda interessanti. La dimostrazione visiva di questa sintesi di sottordine PTA è davvero fondamentale in quanto la sintesi è difficile da imparare perché la temperatura e il controllo dei tempi sono davvero fondamentali per una sintesi di successo.

Per prima cosa, aggiungi 8,9 grammi di dine e 11,9 grammi di bromuro di potassio a un pallone a fondo tondo a tre colli da 500 millilitri con un'ancoretta magnetica. Quindi aggiungere 100 millilitri di una soluzione di bromuro di idrogeno al 30% precedentemente preparata nel pallone. Dopo aver posizionato il pallone in una temperatura negativa di 10 gradi Celsius, bagnare il bagno di ghiaccio secco con una bolla di argon attraverso un ago lungo dal fondo del pallone per 10 minuti.

Agitare la soluzione con l'ancoretta magnetica a 300 giri/min. Successivamente, aggiungere una soluzione di nitrito di sodio precedentemente preparata a un imbuto di goccia equalizzante della pressione collegato al pallone a fondo rotondo a tre colli e sigillarlo con un setto. Aprire lentamente la valvola dell'imbuto a goccia, lasciando che la soluzione di nitrito di sodio goccioli nel pallone.

Controllare la valvola per regolare la velocità di gocciolamento a circa due gocce al secondo. Dopo che l'aggiunta di nitrito di sodio è completa, continua a mescolare la soluzione per altre tre ore, lasciando che la temperatura si scaldi da meno 10 gradi Celsius a temperatura ambiente. Se il colore della soluzione è troppo scuro, applicare un vuoto per rimuovere gli ossidi di azoto in eccesso e l'eventuale bromo generato durante la reazione.

Una volta che la soluzione è stata trasferita in un imbuto estraente, estrarre il prodotto tre volte con 35 millilitri di etere datilico. Dopo aver combinato la fase organica e lavato con salamoia satura, raccoglierlo in un pallone e asciugarlo su solfato di sodio per sei ore. Dopo la filtrazione del solfato di sodio, far evaporare il solvente sotto vuoto per ottenere un olio da limpido a giallo pallido.

Purificare il prodotto grezzo mediante cromatografia su colonna su gel di silice con acetato di etile esano tre a uno per la marcatura isotopica, sciogliere 300 milligrammi di L-alanina con 10 millilitri di acqua deuterata in una provetta di polietilene da 50 millilitri. Dopo aver aggiunto 10 milligrammi di alfa chetoglutarato come substrato cos, riscaldare il tubo a 37 gradi Celsius. Al termine, regolare il pH da 8,5 a 8,7 utilizzando una soluzione di ossido di sodio dute molare e strisce reattive per il pH.

Successivamente, aggiungere 0,1 milligrammi di alanina transaminasi alla soluzione. Posizionare la provetta in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e incubarla per una notte agitando leggermente a 10-30 giri/min. A questo punto, gonfiare un grammo di 90 micron, 10 per gelificare le perle con il linker Ram in 10 millilitri di dimetilformammide per tre ore in un reattore a siringa da 12 millilitri con un leggero agitamento, drenare la dimetilformammide dal reattore e aggiungere 10 millilitri di soluzione di dimetilformammide perinica al 20% pi per proteggere il gruppo FOC dalla pista di pattinaggio in mezzo al linker.

Dopo aver agitato le perle con la soluzione 20%Pepperdine per 30 minuti, lavatele cinque volte con carne dimetilforma per rimuovere tutto il Pepperdine. Quindi, rimuovi alcune perline dalla siringa e testarle con un test del cloralio. Aggiungere due millilitri di una soluzione di acido bromoacetico dimetilformammide a due molari alle perle e agitare delicatamente.

Quindi aggiungere due millilitri di una soluzione di diabolico carbo diammina dimetilformammide a due molari alle perle. Dopo aver sigillato la siringa con uno stantuffo, agitare le perle su uno shaker per 10 minuti. Una volta che le perle sono state lavate accuratamente con dimetilformammide, aggiungere due millilitri di una soluzione di metossi etildimetilformammide precedentemente preparata.

Dopo aver agitato le perle e averle lavate cinque volte con dimetilformammide, controllare alcune perle con un test del cloralio. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di una soluzione one-to-one di cloralio metano dimetilformammide alla siringa precedentemente utilizzata. Dividere uniformemente tutte le perle da un grammo in tre reattori a siringa da cinque millilitri utilizzando una pipetta da 1000 microlitri con punta tronca.

Dopo aver lavato le tre siringhe tre volte con clorometano, lavare tre volte le siringhe marcate r e s con tet idrofurina anidra e tre volte la siringa marcata B con dimetilformammide. Per l'accoppiamento tristina dell'acido bromo propan NOIC, aggiungere circa 200 milligrammi di tristina a un flaconcino in una cappa aspirante. Una volta tappato il flaconcino, pesare la quantità di tristina in essa contenuta.

Quindi aggiungere la quantità appropriata di tetra idro ferrano anidro alla fiala per ottenere una soluzione di 20 milligrammi per millilitro di Tri fosgene tetra idro ferrano. Per preparare la miscela di tri fosgene di bromoacidi, aggiungere 89 microlitri di acido R due Bromo propan NOIC e S due di acido Bromo propan NOIC D quattro in due piccole fiale separatamente a ciascuna fiala, aggiungere cinque millilitri della soluzione tristina tetra idro furano. Dopo aver sigillato le fiale, metterle in un congelatore a 20 gradi Celsius negativi per 20 minuti.

Nel frattempo, aggiungere 1.125 microlitri di una soluzione di tetra idrofurano di isopropilammina due a uno alla siringa r e s. Separatamente, aggiungere 356 microlitri di 2-4-6 trimetil-purina a ciascuna delle fiale contenenti le miscele di fosgene di bromoacidi raffreddate che producono precipitati bianchi. Applicare immediatamente la sospensione corrispondente direttamente sulle perle ificate, quindi posizionarle su uno shaker per agitare sotto i 120 giri/min per due ore.

Per l'accoppiamento dell'acido bromoacetico con di isopropil carbo dimetildiammina, aggiungere cinque millilitri di una soluzione di dimetilformammide di acido bromo acetico a due molari alla siringa B.Dopo aver agitato, aggiungere cinque millilitri di una soluzione di due molari di propil carbo diammina dimetilformammide alla stessa siringa e agitare delicatamente dopo aver posizionato la siringa B sullo stesso agitatore della siringa r e s. Quindi agitare le siringhe per due ore dopo aver lavato accuratamente le siringhe con clorometano e dimetilformammide. Raggruppare tutte le perle delle siringhe R, S e B in un reattore a siringa da 12 millilitri.

Una volta che le perle sono state lavate cinque volte con dimetilformammide, aggiungere 10 millilitri di una soluzione monouso di clorometano dimetilformammide alla siringa. Dividere tutte le perle in modo uniforme in sette siringhe individuali da due millilitri utilizzando una pipetta da 1000 microlitri con una punta di pipetta tronca per l'emanazione, aggiungere cinque millilitri di sette soluzioni di ammina molare precedentemente preparate alla siringa corrispondente. Incubare tutte e sette le siringhe in un incubatore a 60 gradi Celsius agitando durante la notte Dopo l'incubazione.

Lavare le perle che devono essere tagliate cinque volte con di cloralio metano. Dopo aver agitato le perle per 15 minuti e averle nuovamente lavate con di clorometano, scolare il clorometano dalla siringa. Quindi trasferire ogni singola perlina in una piastra a 96 pozzetti.

Utilizzando un microscopio ottico e una pipetta con punta tronca, coprire la piastra a 96 pozzetti con un vetrino coprioggetti e metterla nel congelatore a 20 gradi Celsius negativi per 15 minuti. Una volta tolta la piastra dal congelatore, aggiungere 20 microlitri di una soluzione di clorometano TFA DI raffreddata uno a uno precedentemente preparata in ciascuno dei pozzetti che contiene una perla. Riposizionare il vetrino coprinte e posizionare la piastra a muro 96 su uno shaker nel congelatore a 20 gradi Celsius negativi.

Dopo aver agitato per 20 minuti, rimuovere la piastra a muro 96 dal congelatore e staccare il vetrino coprioggetti. Asciugare il clorometano da ciascun pozzetto soffiandoci sopra dell'aria. Se scisso a temperatura ambiente utilizzando una soluzione di clorometano al 50% di TFA, si osserva una degradazione significativa.

I picchi 593 e 484 corrispondono rispettivamente al linker e al trimero PTA, dimostrando che l'intera molecola è stata sintetizzata con successo sulla perlina ma degradata durante la scissione. Quando viene scisso in condizioni di bassa temperatura come descritto sopra, la quantità di degradazione indotta dal TFA viene notevolmente soppressa. Il meccanismo di scissione è stato descritto in letteratura precedente e si ritiene che passi attraverso un intermedio olaine Le molecole di PTA possono essere sequenziate da Ms.MS e il modello di frammentazione è simile a peptidi e peptidi.

Le molecole di PTA sintetizzate con S due acido propolo bromo D quattro generalmente danno picchi più ampi in MS e msm. Ms.Spectra a causa della presenza di prodotti di durata incompleta come S due bromo propan, acido NOIC D tre, questo potrebbe essere utilizzato come indicazione della presenza del centro chirale R durante la procedura di sequenziamento, le molecole di PTA tendono anche a formare più addotti ated rispetto al peptide peptidico. Pertanto, sono preferiti acqua a basso contenuto di sodio e apparecchi in plastica.

Un altro potenziale sottoprodotto è l'acrilammide formata dall'eliminazione del bromo durante l'amminazione. Una volta che l'acrilammide si è formata, la sequenza è terminata. Questo può essere risolto abbassando la concentrazione di ammina primaria a un molare per ridurre la soluzione.

Una volta padroneggiata una libreria di buone dimensioni, può essere preparata in due giorni se eseguita correttamente. Ora che questa chimica è stata completamente sviluppata e la sintesi è abbastanza efficace, spero che altri ricercatori adotteranno questa potente tecnologia per realizzare mimetici peptidici conformazionalmente vincolati per lo sviluppo di farmaci e sonda.