Split-e-pool Sintesi e caratterizzazione di peptidi Terziario Ammide Biblioteca

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come sintetizzare librerie combinatorie contenenti unità di ammide terziario peptidico o unità PTA. Questo viene realizzato innanzitutto preparando un sub-monomero PTA a partire da aminoacidi naturali. Il secondo passaggio consiste nella sintesi di una regione di legame peptidica su un supporto solido.

Successivamente, viene sintetizzata una libreria combinatoria contenente subunità di PTA e peptidi. L'ultimo passaggio consiste nel caratterizzare la libreria sintetizzata per garantire la qualità della sintesi. In definitiva, viene ottenuta una libreria combinatoria contenente subunità di PTA con restrizione conformazionale, la quale può essere utilizzata per schermature ad alto rendimento al fine di ottenere ligandi proteici e favorire la scoperta di nuovi farmaci.

Pertanto, la chimica oggetto di questo articolo è stata sviluppata nel tentativo di individuare molecole molto più rigide rispetto ai peptidi e ad altri composti con cui avevamo precedentemente lavorato. L'idea è che, se si identificano librerie di molecole più rigide, queste si legheranno ai bersagli proteici con affinità molto più elevate, e ritenevamo che ciò fosse estremamente importante per lo sviluppo futuro di farmaci o anche di molecole sonda interessanti. La dimostrazione visiva di questa sintesi del sottogruppo PTA è fondamentale, poiché la sintesi è difficile da apprendere a causa della grande importanza del controllo della temperatura e dei tempi per ottenere una sintesi di successo.

Per prima cosa, aggiungere 8,9 grammi di dine e 11,9 grammi di bromuro di potassio in un pallone a fondo rotondo da 500 millilitri a tre collo con un agitatore magnetico. Quindi aggiungere 100 millilitri di una soluzione di bromuro di idrogeno al 30% precedentemente preparata nel pallone. Dopo aver posizionato il pallone in un bagno di glicole etilenico e ghiaccio secco a meno 10 gradi Celsius, far gorgogliare argon attraverso un ago lungo dal fondo del pallone per 10 minuti.

Agitare la soluzione con la barra magnetica a 300 giri/min. Successivamente, aggiungere una soluzione di nitrito di sodio precedentemente preparata in un imbuto gocciolatore a compensazione di pressione collegato al pallone a fondo rotondo tricollo e sigillarlo con un setto. Aprire lentamente la valvola dell'imbuto gocciolatore, permettendo alla soluzione di nitrito di sodio di gocciolare nel pallone.

Regolare la valvola per impostare la velocità di gocciolamento a circa due gocce al secondo. Al termine dell'aggiunta di nitrito di sodio, continuare a mescolare la soluzione per altre tre ore, permettendo alla temperatura di passare da meno 10 gradi Celsius a quella ambiente. Se il colore della soluzione è troppo scuro, applicare un vuoto per rimuovere gli eccessi di ossidi di azoto e il bromo eventualmente generato durante la reazione.

Una volta trasferita la soluzione nel imbuto di estrazione, estrarre il prodotto tre volte con 35 millilitri di etere diathilico. Dopo aver combinato la fase organica e averla lavata con soluzione salina satura, raccoglierla in un matraccio e asciugarla su solfato di sodio per sei ore. Dopo la filtrazione del solfato di sodio, evaporare il solvente sotto vuoto per ottenere un olio da incolore a giallo pallido.

Purificare il prodotto grezzo mediante cromatografia su colonna a gel di silice con un rapporto da tre a uno di esano e acetato di etile. Per la marcatura isotopica, sciogliere 300 milligrammi di L-alanina con 10 millilitri di acqua deuterata in un tubo di polietilene da 50 millilitri. Dopo aver aggiunto 10 milligrammi di alfa-chetoglutarato come co-substrato, riscaldare il tubo a 37 gradi Celsius. Al termine, regolare il pH a 8,5-8,7 utilizzando una soluzione di ossido di sodio 1 molare e strisce indicatrici di pH.

Successivamente, aggiungere 0,1 milligrammi di alanina transaminasi alla soluzione. Posizionare il tubo in un incubatore a 37 gradi Celsius e incubare tutta la notte con agitazione delicata a 10-30 giri al minuto. A questo punto, far gonfiare un grammo di microsfere da 90 micron, da 10 a gel con linker Ram, in 10 millilitri di dimetilformammide per tre ore in un reattore a siringa da 12 millilitri con agitazione delicata, quindi drenare la dimetilformammide dal reattore e aggiungere 10 millilitri di soluzione di perina al 20% in dimetilformammide per deproteggere il gruppo FOC dal linker rink ammidico.

Dopo aver agitato le perle con la soluzione al 20% di Pepperdine per 30 minuti, lavarle cinque volte con dimetilformammide per rimuovere completamente il Pepperdine. Successivamente, prelevare alcune perle dalla siringa e sottoporle a un test al cloro. Aggiungere due millilitri di una soluzione due molare di acido bromoacetico in dimetilformammide alle perle e agitare delicatamente.

Quindi aggiungere due millilitri di una soluzione di diop propilcarbodiammina dimetilformammide due molare alle perle. Dopo aver sigillato la siringa con un pistone, agitare le perle su un agitatore per 10 minuti. Una volta che le perle sono state lavate accuratamente con dimetilformammide, aggiungere loro due millilitri di una soluzione di metossietildimetilformammide uno molare precedentemente preparata.

Dopo aver agitato le perle e averle lavate cinque volte con dimetilformammide, verificare alcune delle perle mediante un test al cloralio. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di una soluzione uno a uno di cloralio metilenico e dimetilformammide alla siringa usata in precedenza. Suddividere tutte le perle da un grammo in parti uguali in tre reattori a siringa da cinque millilitri utilizzando una pipetta da 1000 microlitri con punta troncata.

Dopo aver lavato tre volte le tre siringhe con clorometano, lavare le siringhe etichettate con r e s tre volte con tetraidrofurano anidro e la siringa etichettata con B tre volte con dimetilformammide. Per l'accoppiamento della bromopropanoNOIC acido con tristina, aggiungere circa 200 milligrammi di tristina in una provetta sotto cappa. Una volta chiusa la provetta, pesare la quantità di tristina presente nella provetta.

Quindi aggiungere la quantità appropriata di tetraidroferrano anidro nel vial per ottenere una soluzione di tricloruro di fosforo e tetraidroferrano a 20 milligrammi per millilitro. Per preparare la miscela di acidi bromo e tricloruro di fosforo, aggiungere 89 microlitri di acido R-2-bromopropanoico e acido S-2-bromopropanoico-D4 in due vial piccoli separatamente; in ciascun vial aggiungere 5 millilitri della soluzione di tristina in tetraidrofurano. Dopo aver sigillato i vial, posizionarli in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti.

Nel frattempo, aggiungere 1.125 microlitri di una soluzione di tetraidrofurano e diisopropilammina in rapporto 2:1 nelle siringhe r e s. Separatamente, aggiungere 356 microlitri di 2,4,6-trimetilpurina in ciascuna delle provette contenenti le miscele di acidi bromurati e fosgene, ottenendo precipitati bianchi. Applicare immediatamente la corrispondente sospensione direttamente sulle perle attivate, quindi posizionarle su un agitatore e agitare a 120 giri al minuto per due ore.

Per il legame dell'acido bromoacetico con la diisopropilcarbodiammina, aggiungere cinque millilitri di una soluzione di acido bromoacetico due molare in dimetilformammide nella siringa B. Dopo aver agitato, aggiungere cinque millilitri di una soluzione di dipropilcarbodiammina due molare in dimetilformammide nella stessa siringa e agitare delicatamente; successivamente, posizionare la siringa B sullo stesso agitatore delle siringhe R e S. Agitare quindi le siringhe per due ore, dopo aver lavato accuratamente le siringhe con diclorometano e dimetilformammide. Riunire tutte le perle provenienti dalle siringhe R, S e B in un unico reattore a siringa da 12 millilitri.

Dopo aver lavato le perline cinque volte con dimetilformammide, aggiungere 10 millilitri di una soluzione uno a uno di diclorometano e dimetilformammide nella siringa. Suddividere tutte le perline in modo uniforme in sette siringhe individuali da due millilitri utilizzando una pipetta da 1000 microlitri con punta troncata per l'emissione, quindi aggiungere cinque millilitri delle sette soluzioni di ammina due molarità precedentemente preparate in ciascuna siringa corrispondente. Incubare tutte e sette le siringhe durante la notte in un incubatore a 60 gradi Celsius con agitazione. Dopo l'incubazione.

Lavare le perline che devono essere scisse cinque volte con diclorometano. Dopo aver agitato le perline per 15 minuti e averle lavate nuovamente con diclorometano, rimuovere il diclorometano dalla siringa. Successivamente, trasferire ogni perlina singolarmente in una piastra a 96 pozzetti.

Utilizzando un microscopio ottico e una pipetta con una punta troncata, coprire la piastra a 96 pozzetti con un vetrino e posizionarla nel congelatore a meno 20 gradi Celsius per 15 minuti. Una volta rimossa la piastra dal congelatore, aggiungere 20 microlitri di una soluzione fredda preparata in precedenza di TFA e cloro metano in rapporto uno a uno in ciascun pozzetto contenente una perla. Riposizionare il vetrino e collocare la piastra a 96 pozzetti su un agitatore, rimettendola quindi nel congelatore a meno 20 gradi Celsius.

Dopo aver agitato per 20 minuti, rimuovere la piastra a 96 pozzetti dal congelatore e staccare il coprivetro. Asciugare ogni pozzetto soffiando aria per eliminare il diclorometano. Quando il distacco avviene a temperatura ambiente utilizzando una soluzione di TFA al 50% in diclorometano, si osserva un degrado significativo.

I picchi a 593 e 484 corrispondono rispettivamente al linker e al trimero PTA, indicando che l'intera molecola è stata sintetizzata con successo sulla perla, ma si è degradata durante il distacco. Quando il distacco avviene in condizioni di bassa temperatura come descritto in precedenza, la degradazione indotta da TFA è fortemente soppressa. Il meccanismo di distacco è stato descritto nella letteratura precedente ed è ritenuto avvenire attraverso un intermedio olefinico; le molecole PTA possono essere sequenziate mediante Ms.MS e il loro schema di frammentazione è simile a quello dei peptidi.

Le molecole di PTA sintetizzate con S due bromo propolo acido D quattro generalmente producono picchi più larghi in spettrometria di massa (MS) e in msm. Gli spettri MS a causa della presenza di prodotti di durata incompleta, come S due bromo propano, acido NOIC D tre, che potrebbero essere utilizzati come indicazione della presenza del centro chirale R durante la procedura di sequenziamento. Le molecole di PTA tendono inoltre a formare addotti più idratati rispetto ai peptidi. Pertanto, si preferiscono acqua a basso contenuto di sodio e apparecchiature in plastica.

Un altro possibile sottoprodotto è l'acrilamide formata dall'eliminazione del bromo durante l'amminazione. Una volta formata l'acrilamide, la sequenza termina. Questo problema può essere risolto riducendo la concentrazione dell'ammina primaria a un molare, al fine di diluire la soluzione.

Basicità Una volta padroneggiata una libreria di buone dimensioni, può essere preparata in due giorni se eseguita correttamente. Ora che questa chimica è stata completamente sviluppata e la sintesi è risultata molto efficace, spero che altri ricercatori adottino questa potente tecnologia per produrre peptidomimetici a conformazione vincolata per lo sviluppo di farmaci e sonde.