Generazione di un "umanizzato" Drosophila S2 Cell Line Sensibile alla farmacologica L'inibizione di Kinesin-5

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di generare una linea cellulare Drosophila S2 sensibile agli inibitori di piccole molecole del motore Kinesin-5, in modo che possano essere utilizzati per studiare la correzione degli errori. La correzione degli errori durante la divisione cellulare è un processo in cui le interazioni errate tra cinetocore e microtubuli vengono destabilizzate, per dare alla cellula una seconda possibilità, o un'altra opportunità, di formare attacchi appropriati in modo che il genoma possa essere correttamente segregato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare, relative al processo di correzione degli errori.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo utilizzare una linea cellulare di Drosophila S2 che ha meno cromosomi e sono sensibili a un inibitore della chinesina-5, entrambi i quali facilitano la visualizzazione dei singoli eventi di correzione degli errori. Iniziando con un pallone quadrato di 25 centimetri precedentemente coltivato di cellule GFP-alfa tubulina confluenti al 100% che esprimono cellule S2, trasferire due millilitri di coltura in un piatto da 35 millimetri. Quindi, incubare le cellule a temperatura ambiente per circa un'ora per farle semi-aderire.

Rimuovere il terreno dal piatto e aggiungere un millilitro di terreno di Schneider, integrato con FBS, in due microgrammi del costrutto Eg5-mCherry e del reagente di trasfezione per trasfettare le cellule seguendo il protocollo del produttore. Utilizzare il Parafilm per sigillare la capsula e incubare le cellule a 25 gradi Celsius per 16-18 ore. Quindi aggiungere un millilitro di terreno di Schneider e rimettere le cellule nell'incubatore.

Il terzo giorno dopo la trasfezione, trasferire 500 microlitri di cellule trasfettate in una nuova piastra di coltura tissutale da 35 millimetri contenente 1,5 millilitri di terreno di Schneider per l'induzione del test. Per indurre l'espressione di Eg5-mCherry, aggiungere solfato di rame a una concentrazione finale di 500 micromolari. Sigillare la capsula in Parafilm e incubare a 25 gradi Celsius per una notte.

Posizionare un vetrino coprioggetto rivestito di Concanavalin A da 22 millimetri per 22 millimetri precedentemente preparato in una piastra di coltura tissutale pulita da 35 millimetri. Quindi seminare 500 microlitri di cellule indotte al 100% confluenti sul vetrino coprioggetti e lasciare che le cellule aderiscano a temperatura ambiente. Per verificare l'espressione di Eg5-mCherry, assemblare il vetrino coprioggetto in una camera di rose con terreno e visualizzare a temperatura ambiente utilizzando un microscopio a fluorescenza, secondo le linee guida del protocollo di testo.

Dopo esservi assicurati che le cellule esprimano sia Eg5-mCherry che GFP alfa tubulina, trasferire il resto delle cellule trasfettate e non indotte in un pallone di coltura tissutale quadrato di 25 centimetri, contenente quattro millilitri di terreno di Schneider. Aggiungere la blasticidina S HCL alla concentrazione finale di 25 microgrammi per millilitro nel pallone e continuare a dividere le cellule in presenza di blasticidina S HCL fino alla cessazione della morte cellulare. Dopo aver preparato l'RNA a doppio filamento KLP61F secondo il protocollo di testo, seminare le cellule S2 che esprimono Eg5-mCherry in una piastra di coltura da 35 millimetri al 25% di confluenza e lasciarle aderire per un'ora.

Rimuovere il terreno dai piatti e aggiungere un millilitro di terreno di Schneider senza siero a cinque microgrammi di RNA KLP61F a doppio filamento. Dopo l'incubazione a temperatura ambiente per un'ora, aggiungere un millilitro di terreno di Schneider con il 10% di FBS. Incubare le cellule a 25 gradi Celsius.

24 ore dopo il trattamento con dsRNA, indurre l'espressione di Eg5-mCherry aggiungendo solfato di rame a una concentrazione finale di 500 micromolari. Incubare le cellule a 25 gradi Celsius per altre 24 ore. Per eseguire l'imaging di cellule vive, posizionare un vetrino coprioggetto rivestito con Concanavalin A da 22 millimetri per 22 millimetri in un piatto di coltura tissutale pulito da 35 millimetri.

Seminare 500 microlitri di cellule trattate con dsRNA che sono state indotte durante la notte sul vetrino coprioggetti e lasciarle aderire per circa un'ora. Dopo aver raccolto le immagini time-lapse dei fusi bipolari secondo il protocollo di testo, rimuovere il terreno dalla camera della rosa e aggiungere il terreno di Schneider contenente un STLC micromolare e sostituire il mezzo STLC altre due volte, scartando il mezzo dopo ogni lavaggio per visualizzare il collasso del fuso. Per lavare via il farmaco e invertire il collasso del fuso, rimuovere con cura il terreno contenente STLC dalla camera della rosa e gettarlo in un contenitore per rifiuti, quindi utilizzare da 6 a 8 millimetri in totale del terreno di Schneider per lavare le cellule quattro volte, scartando il terreno dopo ogni lavaggio.

Quindi, dopo aver aggiunto un terreno fresco per riempire la camera, continuare l'imaging. Per accedere al mezzo per il lavaggio e il lavaggio dei farmaci, rimuovere con cautela il vetrino coprioggetto superiore dalla camera della rosa mentre è fissato al microscopio. In alternativa, per l'imaging di cellule vive può essere utilizzata una piastra di Petri con fondo di vetro trattata con Concanavalin A in modo simile ai vetrini coprioggetti.

Dopo aver seminato 500 microlitri di cellule S2 trattate con KLP61F dsRNA su un vetrino coprioggetti Concanavalin A e aver lasciato aderire le cellule, aggiungere 1,5 millilitri di terreno di Schneider per portare il volume finale a due millilitri. Una volta che le cellule sono state arrestate in mitosi secondo il protocollo di testo, aggiungere un STLC micromolare e incubare per un'ora per consentire la formazione dei monopoli. Lavare l'STLC utilizzando due millilitri di terreno Schneider's fresco per risciacquare i vetrini coprioggetto tre volte.

Per fissare le cellule in diversi punti temporali della formazione del fuso bipolare e per valutare i siti di attacco del cinetocore, iniziare utilizzando due millilitri di 1X BRB80 per risciacquare rapidamente i vetrini. In una cappa chimica, aggiungere due millilitri di PFA al 10% in 1X BRB80 e incubare per 10 minuti. Successivamente, per permeabilizzare le cellule, aggiungere l'1% di Tritone X in 1X PBS e incubare per 10 minuti.

Quindi utilizzare due millilitri di Triton X allo 0,1% in 1X PBS per lavare le celle tre volte. Quindi, trasferire il vetrino di copertura, con il lato della cella rivolto verso l'alto, su un foglio di Parafilm in una capsula di Petri da 150 millimetri. Aggiungere 150 microlitri di siero d'asino bollito, o BDS, ai vetrini coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per un'ora per bloccare il legame degli anticorpi non specifici.

Dopo l'incubazione, rimuovere il blocco e aggiungere 150 microlitri di anticorpi primari preparati secondo il protocollo di testo prima di incubare a temperatura ambiente per un'ora. Dopo aver lavato tre volte i vetrini di copertura, aggiungere gli anticorpi secondari coniugati con fluoro-4 diluiti in BDS e incubare a temperatura ambiente per 30-60 minuti. Una volta che i vetrini coprioggetto sono stati lavati tre volte, incubarli con 150 microlitri di BDS, contenente un microgrammo per millilitro di DAPI per cinque minuti.

Quindi, dopo che i vetrini coprioggetto sono stati lavati due volte, utilizzare otto microlitri di terreno di montaggio per montare il campione, con la cella rivolta verso il basso, su un vetrino da tre pollici per uno. Usa lo smalto per dipingere gli angoli. Infine, utilizzare un obiettivo 100X per visualizzare le cellule con fusi bipolari che esprimono Eg5-mCherry.

Prendiamo una serie Z, composta da 30 piani a intervalli di 0,2 micrometri in tutti i canali. Analizza attentamente il cinetocore e i microtubuli per determinare lo stato di attaccamento. KLP61F è necessario per formare fusi bipolari nelle cellule S2 di Drosophila; tuttavia, gli inibitori della chinesina-5 a piccole molecole sono inefficaci contro di essa.

Queste immagini mostrano che la chinesina-5 umana Eg5 può salvare la funzione di KLP61F nelle cellule S2 di Drosophila. Quando viene aggiunto l'inibitore della chinesina-5, STLC, i livelli associati ai microtubuli del motore diminuiscono e il fuso collassa, provocando un monopolio nelle cellule prive di KLP61F endogeno come risultato del successo dell'RNA I. Dopo la rimozione dell'inibitore, Eg5-mCherry si riassocia ai microtubuli e le cellule possono progredire in un'anafase bipolare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare una linea cellulare di Drosophila S2 sensibile a una piccola molecola inibitrice della chinesina-5. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa sei ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante pianificare in anticipo, perché questo metodo richiede una preparazione con alcuni giorni di anticipo.

Non dimenticare che lavorare con inibitori di piccole molecole può essere pericoloso, quindi indossa sempre i guanti. La costruzione di cellule umanizzate di moscerino della frutta può essere dimostrata attraverso l'applicazione delle tecnologie Crispr-Cas 9 e la sostituzione della Drosophila Kinesin-5 con la sua controparte umana. Lo sviluppo di cellule umanizzate di Drosophila dovrebbe far progredire la nostra comprensione della correzione degli errori e di altri processi cellulari essenziali in futuro.