Un metodo di quantificazione sensibile e specifico per la determinazione del siero miosina cardiaca Binding Protein-C da elettrochemiluminescenza immunoenzimatico

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare simultaneamente la proteina C legante la miosina cardiaca e la troponina I cardiaca in campioni di siero. Ciò si ottiene rivestendo prima una piastra a 96 pozzetti con l'anticorpo della proteina C legante la miosina cardiaca per un test plex o utilizzando un test a tre plex precodificato. Nella seconda fase, le piastre rivestite vengono incubate con calibratori e campioni di siero.

Successivamente, nella fase finale vengono aggiunti gli anticorpi di rilevamento marcati, viene prodotto un segnale di chemiluminescenza che viene rilevato dal lettore di piastre. In definitiva, i livelli delle proteine cardiache di interesse presenti nei campioni di siero possono essere determinati mediante immunodosaggi singoli o multipli. Il giorno prima dell'esperimento, pipettare 30 microlitri di anticorpo monoclonale di topo anti proteina legante la miosina cardiaca senza gelatina nell'angolo inferiore di ciascun pozzetto di una piastra standard nuda per la scoperta della scala di miso a 96 pozzetti.

Quindi picchiettare i lati della piastra per distribuire la soluzione anticorpale sul fondo di ciascun pozzetto. Dopo la sigillatura, incubare la piastra per una notte a quattro gradi Celsius senza agitare. La mattina dopo, picchietta la soluzione su un lavandino e poi su una pila di carta assorbente.

Quindi aggiungere 150 microlitri di bloccante A all'1% in PBS a ciascun pozzetto per bloccare il legame aspecifico. Incubare la piastra sigillata per un'ora a temperatura ambiente agitando a 700 giri/min durante la fase di blocco, diluire il frammento di proteina C legante la miosina cardiaca ricombinante a una concentrazione iniziale di 2000 nanogrammi per millilitro nell'1% di bloccante A in PBS. Quindi diluire in serie questa soluzione di un fattore cinque per un totale di sette standard.

Ora rimuovere la soluzione bloccante come appena dimostrato, quindi lavare la piastra tre volte con 150 microlitri allo 0,05% tra 20 in PBS. Dopo il terzo lavaggio, passo passo energico il piatto su un lavandino e poi tamponare saldamente il piatto su uno strato di carta assorbente fino a quando non è completamente asciutto. Quindi, pipettare 25 microlitri di ogni standard e campionare nei pozzetti appropriati.

Quindi, mentre la piastra sigillata è in incubazione sull'agitatore per un'ora a temperatura ambiente, diluire l'anticorpo di rilevamento della proteina C legante la miosina cardiaca su misura marcato con sul oag a un microgrammo per millilitro nell'1% di bloccante A in PBS. Dopo aver lavato accuratamente la piastra come appena dimostrato, aggiungere 25 microlitri di soluzione di anticorpi di rilevamento a ciascun pozzetto e quindi incubare la piastra sigillata per un'ora a temperatura ambiente agitandola durante il periodo di incubazione, far funzionare la piastra dimostrativa con luci LED per garantire il corretto funzionamento dell'imager settoriale e diluire il buffer Reid anche in questo momento. Dopo aver lavato accuratamente la piastra, come precedentemente dimostrato, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 150 microlitri di tampone Reid a ciascun pozzetto, facendo attenzione a evitare bolle d'aria, quindi scansionare immediatamente la piastra nell'imager settoriale prima di iniziare il test a tre plex.

Lasciare che la piastra a 96 pozzetti e le soluzioni di diluente si equilibrino a temperatura ambiente. Quindi aggiungere alla piastra 25 microlitri di bloccante A all'1% in PBS, assicurandosi che l'intero pozzetto sia coperto dalla soluzione e incubare la piastra sigillata a temperatura ambiente per 30 minuti agitando. Nel frattempo, diluire la proteina legante la miosina cardiaca ricombinante C-C-K-M-B e la troponina I cardiaca insieme nell'1% di bloccante A nella PBS per creare uno standard contenente 2000 nanogrammi per millilitro di proteina legante la miosina cardiaca C, 100 nanogrammi per millilitro di CKMB e 25 nanogrammi per millilitro di troponina cardiaca.

Quindi diluisco in serie questa miscela di un fattore cinque fino a un volume finale di almeno 100 microlitri per ogni campione standard diluito due volte con l'1% di bloccante A in PBS. Successivamente, aggiungere 2 repliche tecniche da 25 microlitri degli standard e i campioni ai 25 microlitri di tampone bloccante già presenti nei pozzetti della piastra a tre plex, includere un bianco di diluente solo dopo aver incubato la piastra sigillata durante l'agitazione, diluire i tre anticorpi di rilevamento SUL oag insieme a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro ciascuno nel bloccante della soluzione all'1% A e PBS dopo due ore. Lavare la piastra come appena dimostrato, quindi utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 25 microlitri di soluzione di anticorpi di rilevamento a ciascuna.

Incubare bene la piastra sigillata per un'ora agitandola a 700 giri/min durante il periodo di incubazione. Esegui la piastra demo e diluisci il buffer Reid come appena dimostrato. Quindi, dopo aver lavato la piastra con lo 0,05% di interpolazione 20 in PBS, utilizzare la pipetta multicanale per aggiungere 150 microlitri di Reid Buffer a ciascun pozzetto evitando bolle d'aria e scansionare immediatamente la piastra nell'imager di settore.

In questa figura, la curva standard della proteina legante la miosina cardiaca C nel saggio del plesso viene confrontata con quella della proteina legante la miosina cardiaca C nel saggio a tre plex. Entrambi i test mostrano una sensibilità molto elevata e un'elevata gamma dinamica. L'area di rilevamento del test viene visualizzata in grigio, sia plex che three plex.

Le curve standard della proteina C legante la miosina cardiaca sono simili. Il limite inferiore di rilevazione, il limite inferiore di quantificazione e il limite superiore di quantificazione sono comparabili sia nei saggi plex che in quelli threeplex. Questi grafici mostrano le curve standard della troponina cardiaca I e CKMB della piastra a tre plex.

Entrambi i calibratori hanno mostrato un'elevata sensibilità e un'ampia gamma dinamica. L'area di rilevamento del test viene visualizzata in grigio. La reattività crociata degli anticorpi di rilevazione con gli altri due calibratori è stata studiata incubando le singole curve standard di tutti e tre i calibratori con anticorpi a singola rilevazione. È stata osservata solo una bassa quantità di reattività crociata tra il calibratore CKMB e gli anticorpi di rilevazione della troponina I cardiaca e della proteina C legante la miosina cardiaca.

Sebbene non sia stata osservata alcuna reattività crociata tra gli altri calibratori e gli anticorpi di rilevazione come prova dell'applicabilità del test per il rilevamento del danno cardiaco, i livelli sierici di 16 soggetti con infarto del miocardio sono stati confrontati con un gruppo di controllo utilizzando i livelli sierici a tre piastre plex della proteina legante la miosina cardiaca C-C-K-M-B e la troponina cardiaca. Sono stato determinato che tutti e tre i biomarcatori erano aumentati nei pazienti con infarto del miocardio rispetto al gruppo di controllo.