Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dettagliare tutti i passaggi necessari per caratterizzare gli ovociti antrali di topo in base alla loro organizzazione della cromatina, in base alla loro capacità di sostenere pienamente un futuro sviluppo embrionale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, come ad esempio come distinguere e isolare due diversi tipi di ooyctes antrali, SN, nucleolo circondato, e NSN, nucleolo non circondato, che risiedono nel compartimento antrale dell'ovaio dei mammiferi. Per raccogliere le ovaie, iniziare iniettando topi femmina IP di età compresa tra tre e sei settimane con 2,5 unità internazionali di gonadotropina sierica di cavalla gravida.

Due giorni dopo, circa un'ora prima del raccolto, riempire una capsula di Petri sterile con terreno M2 e aggiungere diverse gocce da 20 micrilitri di terreno M2 a una seconda piastra di Petri, coprendo ogni goccia con 1,5 millilitri di olio minerale. Quindi trasferire tutte le piastre di Petri in un incubatore a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica per consentire al mezzo di equilibrarsi. Successivamente, utilizzare le forbici da dissezione sterili per praticare un'incisione nella pelle che copre la parete addominale, seguita da un'incisione nel peritoneo del primo topo iniettato con ormoni.

Usa una pinzetta sterile per spostare l'intestino da parte per localizzare le tube uterine, che formano una forma a V a partire dalla vescica. Dopo aver localizzato le ovaie sotto i reni, afferrare una tuba uterina e rilasciare l'ovaio corrispondente con una piccola incisione nella parte inferiore del tessuto. Ripetere il processo per raccogliere l'altra ovaia, quindi posizionare entrambe le ovaie nella capsula di Petri riempita con terreno M2 pre-bilanciato.

Prima di isolare l'ovocita antrale, realizzare delle pipette di vetro afferrando entrambe le estremità di una pipetta di vetro Pasteur e tenendo la pipetta orizzontalmente sulla fiamma di un bruciatore Bunsen. Quando il vetro inizia a sciogliersi, rimuovere la pipetta dalla fiamma e separare rapidamente lo strumento. Usando un'unghia, tagliare con decisione il bicchiere in eccesso vicino alla punta stretta della pipetta per accorciare la punta e ottenere un diametro interno del capillare di circa 100 micron.

È importante avere il diametro corretto della pipetta. Se è troppo stretto, gli ooyctes saranno bloccati, frammentati e moriranno. Quindi collegare l'estremità non modificata della pipetta a un tubo di aspirazione.

Successivamente, trasferisci le ovaie nella capsula di Petri contenente un millilitro di terreno M2 pre-bilanciato e usa un ago sterile per siringa da insulina per perforare delicatamente i follicoli antrali delle ovaie. Man mano che gli ovociti vengono rilasciati, raccoglierli delicatamente con la pipetta orale, facendo attenzione a non aspirare cellule follicolari o altri detriti tissutali. Quindi pipettare rapidamente ogni ovocita attraverso più gocce di terreno M2 pre-bilanciate per rimuovere tutte le cellule del cumulo attaccate alla zona pellucida degli ovociti.

Una volta che gli ovociti sono stati denudati, sistemare con cura gli ovociti sul fondo di singole gocce di terreno M2 fresco ed equilibrato. Per colorare gli ovociti, utilizzare una pipetta orale per trasferire le cellule in gocce da 20 microlitri di Hoechst 33342, diluite in terreno M2. Quindi trasferire gli ovociti in una nuova capsula di Petri contenente cinque microlitri di terreno M2 ricoperti di olio minerale, avendo cura di depositare gli ovociti singolarmente sul fondo di ogni goccia.

Quando tutti gli ovociti sono stati trasferiti, posizionare la capsula sotto il microscopio a fluorescenza ed eccitare le cellule quel tanto che basta per visualizzare la presenza o l'assenza di un anello attorno al nucleolo. Fare attenzione a non sovraesporre gli ovociti, poiché la cromatina può essere danneggiata e gli ovociti possono morire se esposti troppo a lungo. Dopo aver identificato gli ovociti SN e NSN, smistare le cellule nella piastra di Petri corrispondente appropriata nel reagente pertinente per l'analisi a valle desiderata, in base alla loro organizzazione cromatinica.

La colorazione Hoechst 33342 per l'organizzazione della cromatina è probabilmente la fase più critica della procedura. Da cinque a 10 secondi di eccitazione dovrebbero essere sufficienti per ordinare gli ovociti in base alla presenza o all'assenza di cromatina che circonda il nucleolo di ciascun ovocita. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in meno di tre ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante lavorare a temperatura ambiente e ricordarsi di trattare delicatamente sia le ovaie che gli ovociti. Seguendo questa procedura, gli ovociti possono essere utilizzati per la maturazione e la fecondazione in vitro. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo per rispondere a una domanda ancora aperta, come riconoscere e distinguere tra due tipi di ovociti antrali che risiedono nelle ovaie dei mammiferi.

Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione di come preparare e utilizzare la tua pipetta orale, come isolare e selezionare gli ovociti antrali mediante la colorazione Hoechst 33342. Non dimenticare che lavorare con animali e cellule richiede precauzioni speciali, come indossare i dispositivi di protezione individuale e utilizzare strumenti sterilizzati.