Name: Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T12:00:01.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Scopri come isolare e caratterizzare ovociti antrali di topo basandoti sull'organizzazione della cromatina nucleolare. Questo metodo distingue ovociti SN da NSN per studi di biologia riproduttiva.

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M.M. e C.A.R. riconoscono il sostegno finanziario del Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 della Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M e C.A.R. ringraziano Marianna Longo per l'aiuto nella preparazione delle immagini.

Questo protocollo è condotto in conformità con i principi ispiratori del Europea (UE 63/2010) e Italiano (26/2014) leggi che proteggono gli animali utilizzati per la ricerca scientifica. Cervicale dislocazione l&#39;eutanasia viene utilizzato per l&#39;isolamento ovaie ed è eseguita da esperti e soggetti elencati nel protocollo approvato che copre questo studio addestrato. 1. Gli animali <ol><li> Mantenere adulti da 3 a 6 settimane di età topi femmina in una stanza a temperatura e umidità controllate (con fasi di 12L: 12D e alimentati ad libitum). </li><li> Iniettare topi per via intraperitoneale con 2.5 UI di gonadotropina del siero di cavalla incinta (PMSG) per stimolare la crescita follicolare imitando gli effetti dell&#39;ormone follicolo-stimolante (FSH). Isolare le ovaie di ovociti antrali di raccolta 48 ore successive. Euthanize il mouse femminile precedentemente iniettato con PMSG, in base alle proprie linee guida istituzionali. </li><li> Rimuovere rapidamente le ovaie dalla cavità del corpo e metterli nel piatto cont Petriaining M2 mezzo per successivo isolamento ovociti (vedi sezione 3). <ol><li> Effettuare un&#39;incisione sulla pelle che copre la parete addominale seguita da un&#39;incisione nel peritoneo utilizzando forbici dissezione sterili. Aprire l&#39;incisione per esporre l&#39;addome, spostare le viscere da una parte con una pinzetta sterile e localizzare i tubi uterine, formando una forma a V a partire dalla vescica. </li><li> Osservare le ovaie si trovano al di sotto dei reni. Tenere ogni tubo con pinzetta sterile e fare una piccola incisione nella parte inferiore delle ovaie a rilasciarli. Trasferire entrambe le ovaie nella parte inferiore di una piastra di Petri contenenti terreno pre-equilibrata. </li></ol></li></ol> 2. Ormone Preparazione <ol><li> Diluire PMSG (disponibile in diverse concentrazioni archivi) con soluzione salina isotonica sterile per ottenere una concentrazione di lavoro di 2,5 UI di ormone per 0,1 ml di un volume di iniezione appropriata. NOTA: Le soluzioni di ormoni devono essere aliquotati in provette da 0,5 ml e conservati a -20 ° C fino al giorno di utilizzo. Non tenere aliquote diluito superiori a tre mesi a -20 ° C. Una volta scongelato, se si eseguono iniezioni seriali, memorizzare le aliquote delle soluzioni ormonali a +4 ° C e utilizzare entro 4 giorni. </li></ol> Isolamento 3. Antral Ovociti Per un corretto isolamento ovociti: <ol><li> Equilibrare M2 medio 13 (M2) al 5% di CO 2 e 37 ° C per almeno 1 ora prima di avviare la procedura di isolamento oociti. Preparare due piastre di Petri (35 mm x 10 mm), una con 1 ml di m2 per punzonamento ovaie e la seconda con piccole gocce (20 ml) di M2 coperto con olio minerale (~ 1,5 ml) per il trasferimento ovociti dopo isolamento dal ovaia (vedi 3,4-3,6). Tenere entrambe le capsule di Petri in incubatore al 5% di CO 2 e 37 ° C fino al momento di essere utilizzati. </li><li> Utilizzare uno stereomicroscopio durante le procedure di isolamento ovociti. </li><li> Preparare sottili pipette di vetro bocca per raccogliere gli ovociti stetchhing pipette Pasteur in vetro tenute orizzontalmente (tenendo le estremità della pipetta con entrambe le mani), a fiamma verticale proveniente dal bruciatore Bunsen (Figura 1). <ol><li> Una volta che il vetro inizia a fondere, prendere la pipetta della fiamma ed eseguire un movimento di trazione rapido avere la pipetta desiderata. Saldamente tagliare il vetro in eccesso vicino al punto stretto della pipetta con unghie per regolare la lunghezza e il diametro interno del capillare. Assicurarsi che il sottile capillare ha un diametro interno di ~ 100 micron, leggermente maggiore del diametro del ovocita (~ 80 micron). </li><li> Per bocca pipetta, collegare un&#39;estremità del tubo di aspirazione alla pipetta tirato utilizzando una punta appropriata e posizionare l&#39;altra estremità in bocca, fissandolo con i denti. </li></ol></li><li> Raccogliere ovaie usando pinzette sterili e depositarli sul fondo di un piatto di coltura cellulare di Petri (35 mm x 10 mm). Coprire con 1 ml di M2 precedentemente equilibrata a 37 ° Ce 5% CO 2 (Figura 2). </li><li> Forare delicatamente i follicoli antrali delle ovaie con un ago sterile siringa da insulina per liberare oociti antrali a M2 (Figura 3). </li><li> Delicatamente bocca pipettare gli ovociti attraverso uno stretto pipetta Pasteur per rimuovere le cellule follicolari e qualsiasi altri detriti tessuto possibile (Figura 4A) e poi depositarsi sul fondo di piccole gocce (20 mL) di M2 coperti con olio minerale adatto a cultura dell&#39;embrione (precedentemente preparati; Figura 4B). NOTA: E &#39;importante rimuovere tutte le cellule del cumulo collegati alla zona pellucida degli ovociti pipettando continuo attraverso diversi e diverse gocce di M2. Eseguire questo passaggio il più velocemente possibile per evitare alterazioni del pH del mezzo. </li></ol> 4. Antral ovociti colorazione con Hoechst33342 NOTA: ovociti Antral può essere distinta in SN (Circondato Nucleolo), NSN (Non Circondato Nucleolo) oin qualsiasi altra forma intermedia, in base alla loro organizzazione della cromatina dopo colorazione con concentrazione sopravitale di Hoechst33342 (o qualsiasi altro marker specifici per le basi AT) 14. In effetti, gli ovociti SN mostrano un anello Hoechst-positivo attorno al nucleolo mentre la NSN non lo fanno, da qui il suo nome. Per una corretta colorazione ovociti: <ol><li> Trasferire gli ovociti usando una pipetta bocca in gocce di Hoechst33342 (20 ml) diluito in M2 alla concentrazione sopravitale di 50 ng / ml per 10 min in scuro. </li><li> Dopo l&#39;incubazione con Hoechst33342, trasferire ogni singolo ovocita con una pipetta a bocca in fondo piccole gocce (5 mL) di M2 coperti con olio minerale, per l&#39;ordinamento basato su organizzazione della cromatina (SN o NSN). Utilizzare qualsiasi microscopio a fluorescenza dotato di filtro Hoechst33342 (lunghezza d&#39;onda di emissione 486 nm) per visualizzare la configurazione della cromatina degli ovociti. NOTA: A seconda del tipo di microscopio a fluorescenza utilizzato, it può diventare indispensabile utilizzare vetro Petri fondo per l&#39;acquisizione delle immagini. La microscopia confocale Olympus Fluoview Fv10i quando dotata di supporto del campione per 35 millimetri piatto richiede solo vetro bottom-piatti per l&#39;acquisizione di immagini, con spessore standard 0,17 millimetri e un range da 0,13 a 0,21 millimetri accettabili. </li><li> Eccitare gli ovociti per non più di 5-10 sec, probabilmente abbastanza tempo per visualizzare la presenza o l&#39;assenza di un anello attorno al nucleolo (Figura 5). </li><li> Dopo la cernita, la cultura SN antrale e ovociti NSN in M2 al 5% di CO 2 e 37 ° C per indurre la maturazione in vitro o tenerli in buffer appropriate per analisi molecolari e cellulari. </li></ol>

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<li>Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biopolitics+of+frozen+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The biopolitics of frozen embryos.</a> Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Questo protocollo descrive il metodo utilizzato per isolare e classificare il mouse antrali GV ovociti. Non vi sono particolari passaggi critici per sottolineare, con poche eccezioni. Primo: questa procedura deve essere eseguita il più rapidamente possibile: a) mantenere la vitalità degli ovociti e b) evitare variazioni di pH del mezzo utilizzato. Secondo: gli ovociti devono essere brevemente eccitato (5-10 sec) per Hoechst33342 per evitare danni cromatina e la successiva morte degli ovociti, soprattutto se IVM e IVF so...

Antrale ovociti completamente sviluppati (GV, vescicola germinale) isolati dal vano antrale dell&#39;ovario sono abitualmente utilizzati per scopi diversi, come, per esempio, lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari alla base maturazione in vitro fino metafase II. Nonostante le loro bella apparenza oociti antrali più, ma non tutti, sono in grado di completare la meiosi e raggiungere lo stadio di blastocisti; infatti, in molte specie di mammiferi, compreso l&#39;uomo 1,2, circa il 30% del loro arresto loro sviluppo nella fase 2 cellule, se avviene la fecondazione 3-5. Ad oggi, alcuni parametri sono utilizzati per distinguere tra gli ovociti in grado di sostenere lo sviluppo embrionale da quelli in grado di farlo. Ad esempio, cresolo colorazione blu (BCB) è un valido metodo per ordinare gli ovociti basati sull&#39;attività di glucosio-6-fosfato deidrogenasi, sebbene l&#39;utilità di questo metodo di ordinamento correlate a BCB + o colorazione è BCB-ancora dipendente 6-8 laboratorio. Un altro metodo consolidato risiede nella loro organizzazione della cromatina: se macchiata di eventuali coloranti intercalanti del DNA (come Hoechst33342), il 70% degli ovociti antrali mostrano un anello colorante positivo attorno al nucleolo e sono chiamati Circondato Nucleolo (SN), mentre il restante 30% mostrare un segnali positivi più maculati e sono chiamate Non Circondato Nucleolo (NSN) 3-5. Recentemente abbiamo dimostrato che l&#39;assenza di reticoli citoplasmatici 9 (CPL, siti di stoccaggio importanti per mRNA di origine materna e ribosomi sia in ovociti di mammiferi ed embrioni) 10 e la down-regolazione di MATER (essenziale per CPL formazione 11), unitamente alla presenza di gocce lipidiche nei loro cytoplasms 9,12, possono essere altre cause legate alla ovociti incapacità NSN a procedere oltre la fase 2 cellule. Purtroppo, poche tecniche possono essere applicate per ordinare SN antrale e oociti NSN e,per questa ragione, lo sviluppo di un metodo meno invasivo (senza colorazione nucleare, le procedure di fissaggio o di manipolazione con pipette bocca) potrebbe diventare molto importante aumentare i tassi di entrambi sviluppo embrionale umano e animale. In questo lavoro, abbiamo dettaglio il protocollo semplice e veloce utilizzato per isolare annuncio sorta SN e NSN oociti antrali di topi di sesso femminile e si rivolge a tutti gli scienziati interessati allo studio della gametogenesi femminile, la maturazione degli ovociti e sviluppo embrionale.

<table><tbody><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>EmbrioMax M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-PD</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari 35mmx10mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Piatto 35mm, fondo di vetro alto</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur Borosilicato</td><td>Corning</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>Tubi aspiratori per pipette micropillari calibrate</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caratterizzazione di mouse antral ovociti sulla base nucleolare cromatina organizzazione

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Questo protocollo descrive un metodo semplice e veloce per isolare e caratterizzare gli ovociti di topo antrale GV (Germinal Vesicle) come in grado (SN, Nucleolus Circondato) o incapace (NSN, Not Surrounded Nucleolus) di svilupparsi allo stadio di blastocisti dopo la maturazione in vitro (IVM) e la fecondazione in vitro (IVF). Si avvale di Hoeschst33342 (o di qualsiasi altro colorante intercalante del DNA) in grado di legarsi all'eterocromatina del nucleolo mostrando o meno un anello negli ovociti SN, come negli ovociti NSN. Questo rappresenta il modo più semplice e veloce per selezionare entrambi gli ovociti antrali che possono essere eventualmente utilizzati per le procedure IVM o IVF. 
In sintesi, il protocollo consiste nelle seguenti fasi: iniezione di ormoni per stimolare la crescita follicolare; isolamento degli ovociti allo stadio GV dal compartimento antrale mediante puntura dell'ovaio con un ago sterile; preparazione di sottili pipette di vetro per il pipettaggio orale degli ovociti; selezione degli ovociti con Hoechst33342 preparato a concentrazione sopravitale; IVM, FIV o qualsiasi altra analisi molecolare/cellulare.
Purtroppo ci sono ancora poche prove per selezionare gli ovociti SN e NSN utilizzando tecniche meno invasive. Se e una volta identificati, potrebbero essere potenzialmente applicati alle tecnologie di riproduzione assistita umana, anche se con diversi aspetti che dovrebbero essere modificati. Ad oggi, questa tecnica ha potenziali implicazioni per aumentare notevolmente il successo delle procedure IVM e IVF sia nelle specie in via di estinzione che in quelle di interesse economico.

Le seguenti immagini mostrano il metodo utilizzato per isolare oociti antrali da ovaie di topo, a partire dalle pipette preparazione alla selezione degli ovociti &#39;per mezzo di Hoechst33342. Questo metodo è molto semplice e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio dotato di CO 2 incubatore, uno stereomicroscopio e un microscopio a fluorescenza equipaggiato con il filtro corretto per l&#39;osservazione del Hoechst33342 Figura 1 mostra la fase iniziale di...

Qui vi presentiamo un protocollo per la caratterizzazione di oociti antrali di topo sulla base di organizzazione nucleolare.

Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere tutti i passaggi necessari per caratterizzare gli ovociti antrali di topo in base all'organizzazione della cromatina, secondo la loro capacità di sostenere pienamente uno sviluppo embrionale potenziale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, come distinguere e isolare due tipi diversi di ovociti antrali, SN (nucleolo circondato) e NSN (nucleolo non circondato), presenti nel compartimento antrale dell'ovaio dei mammiferi. Per prelevare gli ovari, iniettare inizialmente nei topi femmina di età compresa tra tre e sei settimane 2,5 unità internazionali di gonadotropina sierica di puledra gravida per via intraperitoneale.Dopo due giorni, circa un'ora prima del prelievo, riempire una piastra di Petri sterile con mezzo M2 ed aggiungere diverse gocce di 20 microlitri di mezzo M2 ad una seconda piastra di Petri, coprendo ogni goccia con 1,5 millilitri di olio minerale. Successivamente, trasferire tutte le piastre di Petri in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per permettere al mezzo di equilibrarsi. Poi, utilizzare forbici da dissezione sterili per praticare un'incisione nella cute che ricopre la parete addominale, seguita da un'incisione nel peritoneo del primo topo trattato con ormoni.Utilizzare pinzette sterili per spostare l'intestino e individuare le tube uterine, che formano una struttura a V a partire dalla vescica. Dopo aver localizzato le ovaie al di sotto dei reni, afferrare una tuba uterina ed estrarre l'ovaia corrispondente praticando un piccolo taglio nella parte inferiore del tessuto. Ripetere la procedura per prelevare l'altra ovaia, quindi posizionare entrambe le ovaie nella piastra di Petri contenente mezzo M2 pre-equilibrato.Prima di isolare l'ovocita antrale, preparare pipette di vetro per bocca afferrando entrambe le estremità di una pipetta di Pasteur di vetro e tenendola orizzontalmente sopra la fiamma di un becco Bunsen. Quando il vetro inizia a fondere, rimuovere la pipetta dalla fiamma e tirare rapidamente lo strumento in due parti. Utilizzando un'unghia, tagliare con decisione il vetro in eccesso vicino al punto più stretto della pipetta per accorciare la punta e ottenere un diametro interno del capillare di circa 100 micrometri.È importante utilizzare una pipetta con il diametro corretto. Se è troppo stretta, gli ovociti rimarranno bloccati, si frammenteranno e moriranno. Successivamente, collegare l'estremità non modificata della pipetta a un tubo di aspirazione.Successivamente, trasferire le ovaie nella piastra di Petri contenente un millilitro di mezzo M2 pre-equilibrato ed utilizzare un ago sterile per siringa da insulina per forare delicatamente i follicoli antrali delle ovaie. Mentre gli ovociti vengono rilasciati, raccoglierli delicatamente mediante pipetta a bocca, avendo cura di non aspirare cellule follicolari o altri detriti tissutali. Quindi, pipettare rapidamente ciascun ovocita attraverso diverse gocce di mezzo M2 pre-equilibrato per rimuovere tutte le cellule del cumulo aderenti alla zona pellucida degli ovociti.Dopo aver rimosso le cellule del cumulo, posizionare con attenzione gli oociti sul fondo di gocce individuali di mezzo M2 fresco ed equilibrato. Per colorare gli oociti, utilizzare una pipetta a bocca per trasferire le cellule in gocce da 20 microlitri di Hoechst 33342 diluito nel mezzo M2. Successivamente, trasferire gli oociti in una nuova piastra di Petri contenente gocce da cinque microlitri di mezzo M2 ricoperte con olio minerale, avendo cura di posizionare ogni oocita singolarmente sul fondo di ciascuna goccia.Dopo aver trasferito tutti gli oociti, posizionare la piastra sotto il microscopio a fluorescenza e illuminare le cellule solo per il tempo necessario a visualizzare la presenza o l'assenza di un anello attorno al nucleolo. Prestare attenzione a non sovraesporre gli oociti, poiché la cromatina potrebbe subire danni e gli oociti potrebbero morire se esposti troppo a lungo. Dopo aver identificato gli oociti SN e NSN, separare le cellule nelle rispettive piastre di Petri contenenti il reagente appropriato per l'analisi successiva desiderata, in base all'organizzazione della cromatina.La colorazione con Hoechst 33342 per l'organizzazione della cromatina è probabilmente il passaggio più critico della procedura. Da 5 a 10 secondi di eccitazione dovrebbero essere sufficienti per ordinare gli ovociti in base alla presenza o assenza di cromatina intorno al nucleolo di ciascun ovocita. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in meno di tre ore se eseguita correttamente.Nel corso di questa procedura, è importante lavorare a temperatura ambiente e ricordarsi di manipolare con delicatezza sia le ovaie che gli ovociti. Al termine della procedura, gli ovociti possono essere utilizzati per la maturazione in vitro e la fecondazione in vitro. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo per rispondere a una domanda ancora aperta: come riconoscere e distinguere tra i due tipi di ovociti antrali presenti nelle ovaie dei mammiferi.Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione su come realizzare e utilizzare un pipetto orale, nonché su come isolare e selezionare gli ovociti antrali mediante colorazione con Hoechst 33342. Non dimenticare che lavorare con animali e cellule richiede precauzioni particolari, come indossare dispositivi di protezione individuale e utilizzare strumenti sterilizzati.

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Biologia dello sviluppo

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Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

Questo video descrive l'isolamento di ovociti antrali da ovaie di topo appena raccolte. Questi ovociti antrali possono essere utilizzati per ulteriori studi di caratterizzazione e sviluppo.

Isolamento degli ovociti antrali di topo: un metodo per isolare gli ovociti antrali dalle ovaie di topo appena raccolte

Qui, vi presentiamo un protocollo per le specifiche esaurimento mRNA siRNA-mediata seguita da analisi di immunofluorescenza per valutare il montaggio fuso meiotico e l'organizzazione in ovociti di topo. Questo protocollo è adatto a deplezione di trascritti in vitro e valutazione funzionale diverso mandrino e / o fattori MTOC associati in oociti.

Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata

Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione non invasiva della competenza di sviluppo dell'oocita eseguita durante la loro maturazione in vitro dalla vescicola germinale per la fase di metafase II. Questo metodo combina immagini time-lapse con particle image velocimetry (PIV) e analisi di rete neurale.

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Come le varianti genetiche associate con la malattia umana cominciano a diventare scoperto, sta diventando sempre più importante sviluppare sistemi con cui valutare rapidamente il significato biologico di quelle varianti identificate. Questo protocollo descrive i metodi per valutare la funzione del gene umano durante la meiosi femminile che usando i oocytes del mouse.

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

Colture del tessuto ovarici possono essere utilizzati come modelli di atresia di sviluppo, l'ovulazione e follicolo pilifero e indicare i meccanismi regolatori dei processi dinamici ovarici.

Coltura del tessuto ovarico per visualizzare fenomeni nell'ovaia di Mouse

Viene presentato un protocollo ottimizzato che consente l'esaurimento dei centri di organizzazione dei microtubuli citoplasmatici negli ovociti di topo durante la metafase I utilizzando un laser a femtosecondi nel vicino infrarosso.

Ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione di microtubuli citoplasmatici in ovociti di topo

Questo protocollo fornisce un quadro sperimentale per documentare l'impatto fisico del citoscheletro sulla forma nucleare e sugli organelli interni privi di membrana nel sistema ovocitario di topo. Il framework può essere adattato per l'uso in altri tipi di cellule e contesti.

Cattura dell'agitazione basata sul citoscheletro del nucleo dell'ovocita di topo su scale spaziali

Gli errori meiotici nelle sinapsi e nella ricombinazione sono comuni agli ovociti dei mammiferi. Un'analisi rigorosa delle proteine coinvolte in questi processi è essenziale per capire come e perché l'oogenesi spesso va male. Le tecniche qui presentate consentono un monitoraggio completo della ricombinazione e delle sinapsi per valutare la qualità degli ovociti nei topi.

Preparazione di diffusioni cromosomiche meiotiche da ovociti di topo per la valutazione della sinapsi e della ricombinazione

Scopri come isolare e caratterizzare ovociti antrali di topo basandoti sull'organizzazione della cromatina nucleolare. Questo metodo distingue ovociti SN da NSN per studi di biologia riproduttiva.

Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione

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