Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere tutti i passaggi necessari per caratterizzare gli ovociti antrali di topo in base all'organizzazione della cromatina, secondo la loro capacità di sostenere pienamente uno sviluppo embrionale potenziale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, come distinguere e isolare due tipi diversi di ovociti antrali, SN (nucleolo circondato) e NSN (nucleolo non circondato), presenti nel compartimento antrale dell'ovaio dei mammiferi. Per prelevare gli ovari, iniettare inizialmente nei topi femmina di età compresa tra tre e sei settimane 2,5 unità internazionali di gonadotropina sierica di puledra gravida per via intraperitoneale.

Dopo due giorni, circa un'ora prima del prelievo, riempire una piastra di Petri sterile con mezzo M2 ed aggiungere diverse gocce di 20 microlitri di mezzo M2 ad una seconda piastra di Petri, coprendo ogni goccia con 1,5 millilitri di olio minerale. Successivamente, trasferire tutte le piastre di Petri in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per permettere al mezzo di equilibrarsi. Poi, utilizzare forbici da dissezione sterili per praticare un'incisione nella cute che ricopre la parete addominale, seguita da un'incisione nel peritoneo del primo topo trattato con ormoni.

Utilizzare pinzette sterili per spostare l'intestino e individuare le tube uterine, che formano una struttura a V a partire dalla vescica. Dopo aver localizzato le ovaie al di sotto dei reni, afferrare una tuba uterina ed estrarre l'ovaia corrispondente praticando un piccolo taglio nella parte inferiore del tessuto. Ripetere la procedura per prelevare l'altra ovaia, quindi posizionare entrambe le ovaie nella piastra di Petri contenente mezzo M2 pre-equilibrato.

Prima di isolare l'ovocita antrale, preparare pipette di vetro per bocca afferrando entrambe le estremità di una pipetta di Pasteur di vetro e tenendola orizzontalmente sopra la fiamma di un becco Bunsen. Quando il vetro inizia a fondere, rimuovere la pipetta dalla fiamma e tirare rapidamente lo strumento in due parti. Utilizzando un'unghia, tagliare con decisione il vetro in eccesso vicino al punto più stretto della pipetta per accorciare la punta e ottenere un diametro interno del capillare di circa 100 micrometri.

È importante utilizzare una pipetta con il diametro corretto. Se è troppo stretta, gli ovociti rimarranno bloccati, si frammenteranno e moriranno. Successivamente, collegare l'estremità non modificata della pipetta a un tubo di aspirazione.

Successivamente, trasferire le ovaie nella piastra di Petri contenente un millilitro di mezzo M2 pre-equilibrato ed utilizzare un ago sterile per siringa da insulina per forare delicatamente i follicoli antrali delle ovaie. Mentre gli ovociti vengono rilasciati, raccoglierli delicatamente mediante pipetta a bocca, avendo cura di non aspirare cellule follicolari o altri detriti tissutali. Quindi, pipettare rapidamente ciascun ovocita attraverso diverse gocce di mezzo M2 pre-equilibrato per rimuovere tutte le cellule del cumulo aderenti alla zona pellucida degli ovociti.

Dopo aver rimosso le cellule del cumulo, posizionare con attenzione gli oociti sul fondo di gocce individuali di mezzo M2 fresco ed equilibrato. Per colorare gli oociti, utilizzare una pipetta a bocca per trasferire le cellule in gocce da 20 microlitri di Hoechst 33342 diluito nel mezzo M2. Successivamente, trasferire gli oociti in una nuova piastra di Petri contenente gocce da cinque microlitri di mezzo M2 ricoperte con olio minerale, avendo cura di posizionare ogni oocita singolarmente sul fondo di ciascuna goccia.

Dopo aver trasferito tutti gli oociti, posizionare la piastra sotto il microscopio a fluorescenza e illuminare le cellule solo per il tempo necessario a visualizzare la presenza o l'assenza di un anello attorno al nucleolo. Prestare attenzione a non sovraesporre gli oociti, poiché la cromatina potrebbe subire danni e gli oociti potrebbero morire se esposti troppo a lungo. Dopo aver identificato gli oociti SN e NSN, separare le cellule nelle rispettive piastre di Petri contenenti il reagente appropriato per l'analisi successiva desiderata, in base all'organizzazione della cromatina.

La colorazione con Hoechst 33342 per l'organizzazione della cromatina è probabilmente il passaggio più critico della procedura. Da 5 a 10 secondi di eccitazione dovrebbero essere sufficienti per ordinare gli ovociti in base alla presenza o assenza di cromatina intorno al nucleolo di ciascun ovocita. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in meno di tre ore se eseguita correttamente.

Nel corso di questa procedura, è importante lavorare a temperatura ambiente e ricordarsi di manipolare con delicatezza sia le ovaie che gli ovociti. Al termine della procedura, gli ovociti possono essere utilizzati per la maturazione in vitro e la fecondazione in vitro. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo per rispondere a una domanda ancora aperta: come riconoscere e distinguere tra i due tipi di ovociti antrali presenti nelle ovaie dei mammiferi.

Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione su come realizzare e utilizzare un pipetto orale, nonché su come isolare e selezionare gli ovociti antrali mediante colorazione con Hoechst 33342. Non dimenticare che lavorare con animali e cellule richiede precauzioni particolari, come indossare dispositivi di protezione individuale e utilizzare strumenti sterilizzati.