Un'identificazione basato su rete neurale di ovociti adulto Mouse inerente allo sviluppo competente o incompetente

L'obiettivo generale di questa procedura è l'identificazione di ocitti con una capacità di sviluppo posteriore utilizzando uno strumento non invasivo. Il vantaggio principale di questo metodo è che semplicemente osservando i movimenti degli ovociti che si verificano durante la maturazione in vitro, si può valutare il potenziale di sviluppo dei gameti femminili. Questa tecnica si basa sull'imaging time-lapse accoppiato con la velocimetria dell'immagine delle particelle, un'analisi basata su reti neurali.

Qui, descriveremo i passaggi compiuti per dimostrare che gli ovociti di topo durante la transizione dalla fase vescicale germinale alla fase di metafase due, mostrano un profilo diverso di detti movimenti plasmatici significativamente correlati alla loro competenza o incompetenza nello sviluppo. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, l'infertilità è una patologia che colpisce circa il 20% delle coppie e, inoltre, un terzo delle donne sottoposte a trattamento oncologico è a rischio di insufficienza ovarica prematura. Ciò corrisponde a circa 300, 000 o 30.000 donne in paesi come gli Stati Uniti o l'Italia, rispettivamente.

La progettazione di procedure non invasive per l'identificazione della competenza di sviluppo degli ovociti aiuterebbe a migliorare il successo complessivo degli esiti della gravidanza. Qui, forniamo dettagli sulle fasi più critiche della procedura sviluppata per il topo, al fine di renderla prontamente disponibile per essere testata e utilizzata per altre specie di mammiferi come i bovini o gli esseri umani. Le ovaie vengono trasferite in una capsula di Petrie contenente un mezzo M2 preriscaldato ed equilibrato e 37 gradi centigradi e il cinque percento di CO2.

Se l'ovidotto e un po' di grasso sono ancora presenti intorno all'ovaio, dovrebbero essere rimossi. Quindi, tenendo l'ovaio con un paio di pinzette, la sua superficie viene perforata utilizzando un ago sterile da 1 G. Le ovaie perforate vengono rimosse dal terreno M2 e, utilizzando una micropipetta tirata a mano, si passa per la prima volta a un nuovo terreno M2 pulito, quindi pipettate dentro e fuori per alcuni secondi fino a quando le cellule del cumulo che circondano l'ovocita non sono completamente rimosse.

Successivamente, gli ovociti vengono trasferiti in gocce da 20 microlitri di terreno M2 e se alcune cellule del cumulo persistono, vengono accuratamente rimosse attraverso diversi passaggi da goccia a goccia fino a quando le cellule del cumulo non vengono completamente eliminate. Per preparare Hoechst 33342 a una concentrazione finale di 0,05 microgrammi per mil, iniziamo con una soluzione delicata di Hoechst alla concentrazione di cinque milligrammi per mil, preparata in una sola volta pbs e questa viene ulteriormente diluita fino ad ottenere la concentrazione richiesta. 3,5 microgocce da microlitro di soluzione di Hoechst vengono poste sul fondo di un coperchio per piastre di Petrie e ogni singolo ovocita diluito viene poi trasferito in una singola goccia di Hoechst, facendo attenzione a ridurre l'esposizione alla luce durante il processo di colorazione di Hoechst, coprendo la piastra con un coperchio scuro.

Dopo dieci minuti di colorazione, gli ovociti vengono osservati al microscopio a fluorescenza con luce UV. In base alla conformazione della cromatina, sono classificati come Nucleolo Circondato, SN, se presentano un anello di cromatina x-positivo attorno al nucleolo, o come Nucleolo Non Circondato, NSN, se il nucleolo manca di un anello di cromatina x-positivo e la cromatina complessiva appare dispersa nel nucleolo. Quattro gocce da due microlitri di terreno alfa mem vengono adagiate su una piastra di Petrie con fondo di vetro facendo attenzione a mantenere le gocce entro una distanza specifica, le gocce vengono ricoperte con olio minerale preriscaldato ed equalizzato e un totale di tre o quattro ovociti vengono trasferiti a ciascuna goccia.

La capsula di Petrie viene trasferita nella camera di incubazione di un microscopio time-lapse, che consente il mantenimento prolungato della temperatura della temperatura a 37 gradi centigradi e il cinque percento di CO2 e l'illuminazione con luce LED rossa. Prima dell'analisi time-lapse, utilizzando il software BioStation, vengono impostate le coordinate di ogni goccia in modo da automatizzare il passaggio da una goccia all'altra durante la routine time-lapse. I fotogrammi time-lapse vengono acquisiti a intervalli di otto minuti per un totale di 15 ore.

I filmati registrati vengono poi analizzati utilizzando il software CellPave, che consente la rilevazione dei movimenti citoplasmatici espressi in termini di vettori di velocità. Innanzitutto, con lo strumento CellPave, il perimetro di ogni ovocita viene delimitato manualmente. Quindi, il software calcola la velocità del movimento citoplasmatico che si verifica nel confronto tra due fotogrammi time-lapse consecutivi e la esprime posizionando una freccia colorata il cui colore, intensità e lunghezza definisce la velocità e la direzione dei movimenti.

L'istogramma sotto l'ovocita qui descritto descrive la velocità complessiva del movimento citoplasmatico durante il periodo di registrazione di 15 ore di un ovocita SN. Lo stesso tipo di analisi viene effettuato su un ovocita NSN. Si noti il picco di estrusione ritardato del globulo polare mostrato dall'ovocita NSN rispetto all'ovocita SN.

La parte inferiore dello schermo mostra il modello temporale della velocità di movimento citoplasmatico dell'ovocita. La velocità viene calcolata confrontando due fotogrammi consecutivi. I dati grezzi della velocità di movimento citoplasmatico vengono poi esportati in un foglio Excel che riporta, sulle righe, la sequenza di Frens, e sulle colonne, il singolo ovocita analizzato.

Sul lato sinistro, i dati di un ovocita SN, mentre sul lato destro, quelli degli ovociti NSN. I dati degli ovociti SN o NSN vengono quindi suddivisi in 10 sottogruppi. Nove sono usati per l'allenamento, colore verde.

E uno per il test alla cieca, colore rosso. Questa procedura viene ripetuta per un totale di 10 volte. Ogni volta che si cambia il campione di test alla cieca.

I dati vengono quindi esaminati attraverso una rete neurale artificiale feed-forward, o FANN. Il FANN è costruito per analizzare l'intero time-lapse frames, qui chiamato Input Neurons"Questi ultimi sono collegati a tre neuroni nascosti, a loro volta collegati a due neuroni di output. Un output dà la probabilità che l'input sia un ovocita competente.

L'altro, al contrario, che l'input sia un ovocita incompetente. Il confronto tra i due output prevede la competenza mentale dell'ovocita dula con una precisione del 91,03%. La tecnica è stata messa a punto per gli ovociti di topo, come mostrato qui.

Tuttavia, il richiamo futuro è di testarlo su ovociti umani. Infatti, le procedure non invasive dall'analisi della qualità degli ovociti sono particolarmente richieste nel campo delle tecnologie riproduttive artificiali.