Fago-mediata consegna di mirata sRNA Costruisce per abbattere l'espressione genica in E. coli

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di abbattere i geni di interesse in una popolazione crescente di E.coli. I knockdown genici sono spesso utilizzati per esplorare questioni di base sulla funzione genica. Questi metodi possono anche avere applicazione nella biologia sintetica.

Ad esempio, nel silenziamento di geni indesiderati come i fattori di virulenza. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere eseguita in colture batch di E.coli senza previa modificazione genetica, con risultati osservabili solo dopo poche ore. Per iniziare, utilizzando un plasmide contenente una cassetta di espressione di sRNA progettata secondo il protocollo di testo, eseguire la mutagenesi sito-specifica sulla sequenza identificando prima la sequenza guida di 24 coppie di basi nella cassetta di espressione.

Progettare e sintetizzare primer diretti e inversi con brevi regioni di omologia con la cassetta di sRNA esistente, affiancando la nuova sequenza guida a 24 coppie di basi. Preparare una coltura da cinque millilitri di E.coli in LB e antibiotici che trasportano il fagemide di espressione dell'sRNA stampo. Far crescere le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione.

Dopo aver estratto e purificato il fagemide sRNA stampo dalla coltura, preparare due reazioni PCR, utilizzando da 10 a 50 volte la quantità raccomandata di DNA stampo per il fagemide sRNA e la polimerasi ad alta fedeltà. Preparare una reazione con l'innesco in avanti e una con l'innesco inverso. Dopo aver utilizzato le condizioni standard di PCR per eseguire le reazioni, combinare le due reazioni in una provetta da microcentrifuga.

Quindi ricuocere i prodotti riscaldandoli a 98 gradi Celsius in un bagnomaria bollente. Spegnere immediatamente la fonte di calore e lasciare che il bagno torni lentamente a temperatura ambiente nelle successive una o due ore. Per eliminare l'sRNA stampo non mutato, aggiungere un microlitro di enzima di restrizione DpnI alla miscela e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora, o per il tempo raccomandato dal produttore per la completa digestione.

Successivamente, trasformare le cellule di E.coli chimicamente competenti con uno o cinque microlitri del prodotto PCR ricotto. Quindi isolare le singole colonie mediante placcatura selettiva su piastre LB con antibiotici. Verificare l'incorporazione della corretta sequenza guida con la PCR delle colonie.

Utilizzare un puntale di pipetta da 200 microlitri per raccogliere una piccola quantità di cellule da una singola colonia trasformata. Aggiungere le cellule raccolte a 50 microlitri di acqua priva di nucleasi in una provetta da microcentrifuga e mescolare mediante pipettaggio. Quindi, con un termociclatore da banco o un bagnomaria bollente, lisare le celle riscaldandole a 95 gradi Celsius per due minuti.

Utilizzando un microlitro di cellule lisate come stampo del DNA, eseguire la PCR secondo le condizioni mostrate qui. Dopo aver verificato la corretta sequenza guida, inoculare una coltura da cinque millilitri con il clone di sRNA corretto e far crescere le cellule durante la notte. Il giorno seguente, preparare un brodo di glicerolo combinando 750 microlitri di coltura notturna con 250 microlitri di glicerolo al 60% in una crioprovetta con tappo a vite.

Per preparare le scorte di fagemidi confezionate con M13, preparare una coltura notturna di cinque millilitri di E.coli, contenente il fagemide di espressione dell'sRNA. Inoltre, preparare una coltura notturna di cinque millilitri di E.coli, contenente il plasmide helper M13KO7. Il giorno seguente, dopo aver purificato il DNA, co-trasformare E.coli chimicamente competente con un microlitro ciascuno del fagemide di espressione dell'sRNA e del plasmide helper.

Piastra su LB-agar con antibiotici per selezionare entrambi i costrutti. L'espressione dei fagemidi è un grande carico di fitness per le cellule e può comportare una riduzione dell'efficienza di trasformazione. Potrebbe essere necessario introdurre il plasmide in due fasi di trasformazione sequenziali.

Dopo aver incubato le cellule trasformate per una notte a 37 gradi Celsius, preparare una coltura da 10 millilitri da una singola colonia del ceppo co-trasformato. La mattina seguente, centrifugare la coltura a 3300 x g per 10 minuti. Raccogliere il surnatante e filtrare attraverso un filtro da 0,2 micron.

Conservare il filtrato di fagemide confezionato a quattro gradi Celsius. Dopo aver preparato le cellule bersaglio F+, secondo il protocollo di testo, inoculare una singola colonia in una coltura da cinque millilitri di terreno LB con antibiotici e crescere durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione. Il giorno seguente, utilizzare cinque millilitri di terreno LB selettivo per diluire le cellule bersaglio F+ da una a cento e continuare l'incubazione.

Coltivare le cellule per circa due ore fino ad ottenere un OD600 di 0,3, che indica una crescita in fase logaritmica. Le cellule bersaglio per il silenziamento dovrebbero essere in fase esponenziale quando l'espressione del F pilus silenzia per un'efficace infezione da fagemide. Aggiungi un rapporto da 1 a 100 di fagemmidi confezionati con M13 alle cellule bersaglio per ottenere un'infezione di quasi il 99% della popolazione bersaglio.

Lasciare che l'infezione proceda a 37 gradi Celsius agitando per 30-60 minuti. Quindi saggiare il fenotipo di silenziamento dell'sRNA come desiderato. Seguendo il protocollo dimostrato in questo video, la cassetta di silenziamento dell'sRNA del plasmide pAB.

001 è stato modificato in target in mKate2. Questa figura dimostra che il ceppo di E.coli infettato con il fagemide anti-mKate2 non ha mostrato alcuna fluorescenza mKate2 rilevabile sullo sfondo. Questo ceppo, tuttavia, esprimeva GFP, indicando un assorbimento riuscito del fagemide.

In questo esperimento, un ceppo di E.coli con un gene cromosomicamente integrato della cloramfenicolo acetiltransferasi, o CAT, è stato infettato con un fagemide che ha come bersaglio la CAT ed è stato testato il silenziamento dell'sRNA della resistenza al cloramfenicolo. Le cellule in cui il fagemide ha preso di mira la CAT hanno mostrato una sopravvivenza ridotta a basse concentrazioni di cloramfenicolo e quasi il 99% di uccisione a concentrazioni più elevate. D'altra parte, le cellule non infette, o le cellule infettate con sRNA che silenziano mKate2, erano resistenti al cloramfenicolo a tutte le concentrazioni testate.

Come mostrato qui, l'aggiunta di ampicillina, utilizzata per selezionare solo i batteri che trasportano il fagemide, ha ridotto la sopravvivenza del cloramfenicolo a livelli non rilevabili. La modifica del gene bersaglio dell'sRNA e la produzione di fagemide infetto possono essere eseguite in cinque giorni. Non dimenticare che lavorare con i fagi può essere estremamente pericoloso per altri esperimenti in laboratorio e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come l'uso di materiale da laboratorio dedicato, per evitare contaminazioni indesiderate.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare, clonare e produrre fagemdi infetti, portatori di un sRNA per abbattere qualsiasi gene di interesse in una popolazione di E.coli in crescita attiva.