Alternando microgel ibrida Gelatina di campo magnetico-Responsive per Controlled Drug uscita

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di presentare un metodo semplice per la fabbricazione di ibridi di microgel di nanoparticelle magnetotermali e di dimostrare un proof of concept sull'uso degli ibridi di microgel per il rilascio controllabile di farmaci. I principali vantaggi di questo protocollo sono che il processo è relativamente semplice e conferisce al microgel di esibire la caratteristica di reattività magnetotermica semplicemente intrappolando nanoparticelle magnetiche e copolimeri PNIPAM termoresponsivi all'interno della matrice di gelatina. Ciò consente il rilascio di farmaci in risposta a un campo magnetico alternato, indotto dal rigonfiamento del copolimero PNIPAM associato all'aumento della temperatura delle nanoparticelle quando le nanoparticelle rispondono alle onde magnetiche.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di un sistema di somministrazione di farmaci su richiesta perché questa piattaforma di rilascio di farmaci controllabile risponde a più cicli di accensione e spegnimento indotti da stimoli esterni non invasivi. Il processo di fabbricazione di microgel di gelatina sensibili ai campi magnetici inizia con la preparazione delle soluzioni in sospensione. La preparazione di base della soluzione è descritta nel protocollo di testo.

Quando si prepara la soluzione di gelatina, tenerla a bagnomaria fino a raggiungere la fase fluidica. Quindi omogeneizzarlo con un vortice. Con tutte le soluzioni preparate, mescolare volumi uguali di soluzione di gelatina e il copolimero PNIPAM contenente nonparticelle magnetiche e agitare accuratamente la miscela.

Il passo successivo consiste nell'emulsionare la miscela acquosa in olio di silicone e quindi applicare uno strato di tensioattivo. Versare 15 ml di olio di silicone in un becher sterile e aggiungere immediatamente 0,86 ml della miscela preparata. Quindi mescolare il composto a 900 giri/min a 30 gradi Celsius per mezz'ora.

Dopo aver prodotto l'emulsione, trasferirla in un tubo da 50 ml e raffreddarla a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Si formeranno ora delle microgoccioline nell'olio. Quindi, riempire principalmente il tubo con la soluzione di tensioattivo Pluronic L-64, raffreddare a quattro gradi Celsius e agitare vigorosamente il tubo in modo che le molecole di L-64 vengano adsorbite nella superficie del gel e stabilizzino la sospensione del microgel.

Quindi centrifugare la provetta per 20 minuti a 2300 g e a quattro gradi Celsius. Dopo 20 minuti, esaminare la provetta per verificare la presenza di un pellet di particelle di gel. Ripetere il ciclo di centrifugazione fino a quando non si vede uno.

Quindi rimuovere con cautela il surnatante e riempire il tubo fino a 45 ml con una soluzione fredda di L-64. Agitare forte il tubo per mescolare i microgel pellettati nel tensioattivo. E trasferire la sospensione in un nuovo tubo da 50 ml.

Quindi ripetere il processo di centrifugazione e raccogliere nuovamente il pellet di microgel. Ora, per assicurarsi che non rimangano tensioattivi o goccioline d'olio nella sospensione del campione, aspirare accuratamente il surnatante. Il passo successivo per preparare i microgel è reticolare la loro matrice di gelatina.

Per iniziare, sospendere il pellet in 2 ml della soluzione di Genipin preparata. Usa un vortice. Quindi trasferire rapidamente la sospensione in un bagno d'acqua a 23 gradi Celsius per avviare la reazione di reticolazione covalente.

La reazione può essere eseguita da cinque minuti a due ore. Una volta completato, rimuovere i reticolanti in eccesso. Centrifugare il campione per 20 minuti a 2300 Gs e a quattro gradi Celsius come prima.

Quindi, aspirare e scartare il surnatante. Ripetere la fase di lavaggio in PBS per un totale di tre volte, rompendo meccanicamente il pellet con una punta per pipetta, se necessario. La rimozione completa dei reticolanti in eccesso non reagiti è fondamentale.

Dopo l'ultimo lavaggio, portare i microgel in PBS alla densità desiderata. Misurare la loro densità utilizzando un emocitometro. I microgel fabbricati sono stabili fino a quattro settimane se conservati a quattro gradi Celsius, a condizione che non vi siano agenti degradanti, come la collagenasi.

Per caratterizzare i microgel al microscopio, caricarli su un vetrino e sigillarli sotto un vetrino coprioggetti con resina epossidica. La fase finale della procedura consiste nel misurare il rilascio di farmaco dai microgel. Posizionare il tubo con la concentrazione desiderata di microgel nella camera delle bobine magnetiche.

Quindi, inserire una sonda di temperatura in fibra ottica per monitorare la variazione di temperatura durante l'applicazione del campo magnetico alternato. Ora, applicare il campo magnetico alternato ad alta frequenza a un'intensità di campo definita e per una durata specificata. Dopo il trattamento, centrifugare la provetta per 20 minuti a 2300 Gs e a quattro gradi Celsius.

Raccogliere il surnatante per quantificare la quantità di farmaco rilasciata dai microgel. In questo caso, utilizzare la spettrofotometria per rilevare il texas red. I microgel fabbricati dovrebbero presentare una morfologia sferica ben caratterizzata e una disperdibilità colloidale con diametri compresi tra cinque e 20 micron.

Per confermare il corretto incapsulamento all'interno del microgel è possibile utilizzare nanoparticelle superparamagnetiche fluorescenti o BSA marcate in fluorescenza. L'intrappolamento del copolimero PNIPAM nella matrice di microgel di gelatina gli consente di mostrare una variazione di volume dipendente dalla temperatura. L'aumento della temperatura del mezzo da 22 a 42 gradi Celsius ha provocato un rigonfiamento dei microgel di gelatina di circa il 40%Al contrario, solo il rigonfiamento del 10% è stato osservato nel microgel di gelatina senza copolimero PNIPAM.

Quando le nanoparticelle superparamagnetiche sono state incorporate nel microgel di copolimero di gelatina PNIPAM, il microgel è aumentato di temperatura quando esposto al campo magnetico alternato appropriato. Il rilascio misurato di TRBSA da questi microgel era di circa il 35%Senza incorporare il copolimero nei microgel, il rilascio di TRBSA era significativamente inferiore. Pertanto, il rilascio di BSA in risposta al campo magnetico alternato era probabilmente dovuto al rigonfiamento associato al restringimento delle catene di copolimeri PNIPAM all'interno del microgel.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare ibridi di microgel di nanoparticelle biodegradabili che rispondono al campo magnetico che consentono il rilascio controllabile di farmaci utilizzando un semplice metodo di emulsione acqua in olio. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se eseguita correttamente. Questo protocollo può anche essere modificato per fabbricare ibridi di microgel che rispondono ad altri stimoli, come la luce del vicino infrarosso.

Incorporando semplicemente nanoparticelle d'oro sensibili al vicino infrarosso con matrice di gelatina.