Name: Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Scopri come isolare e coltivare osteoclasti dal midollo osseo di topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella differenziazione cellulare. Questo metodo genera un gran numero di osteoclasti giganti in una settimana.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano il Dr. Minghan Tong e S. Kato per topi e gentilmente fornendo reagenti. Ringraziamo i membri del laboratorio Zou per utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni da 973 programma dal Ministero cinese della scienza e tecnologia (MOST) [2014CB964704 e 2015CB964503], programma di ricerca clinica dell'ospedale di 9 persone, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Grazie per l'aiuto della funzione di memoria per biologia cellulare e funzione di memoria per biologia chimica, CAS Center for Excellence in molecolare di Cell Science, Shanghai Institute di biochimica e biologia cellulare, Accademia cinese delle scienze.

Tutte le procedure relative agli animali sono state eseguite secondo il protocollo approvato dal pannello amministrativo, Stanford su cura degli animali di laboratorio (APLAC) e sono state approvate dal comitato di uso della Shanghai Istituto di biochimica e cellulare e cura degli animali Biologia.
1. preparazione
<ol><li>Generare degli osteoclasti specifico Raptor eliminazione topi (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, aldilà RapCtsk) dall'accoppiamento Raptorfl/fl topi con Ctsk-cre topi. Utilizzare i mouse Raptorfl/fl come controllo WT in questo studio.</li>
	<li>Dispone di un contenitore con ghiaccio per mantenere isolato dell'osso.</li>
	<li>
Preparare il terreno di coltura.
	<ol>
<li>Preparare il terreno di coltura α-MEM completando il minimo essenziale alfa medio (α-MEM) 1 x glutammina, penicillina-streptomicina e 10% di siero fetale di vitello.</li>
		<li>Preparare il supporto di induzione di macrofago del midollo osseo costituito da 50 mL di medium di α-MEM e M-CSF a 20 ng/mL.</li>
		<li>Preparare il supporto di induzione di osteoclasto consistente di M-CSF e RANKL a 20 ng/mL, rispettivamente, in 50 mL di terreno di α-MEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare i buffer seguenti prima della colorazione della trappola.
	<ol>
<li>Preparare la soluzione di fix composto da 6,5 mL di acetone, 2,5 mL di soluzione di citrato e 0,8 mL di soluzione (vol/vol) formaldeide al 37%.</li>
		<li>Preparare la trappola soluzione di colorazione.<ol>
<li>Preriscaldare la acqua deionizzata a 37 ° C.</li>
			<li>Aggiungere 100 µ l di soluzione di base fast garnet GBC e 100 µ l di soluzione di nitrito di sodio in una microprovetta 1,5 mL e mescolare capovolgendo delicatamente per 30 s. lasciate il composto riposare per 2 min.</li>
			<li>Preriscaldare la 9 mL di acqua deionizzata a 37 ° C. Aggiungere 200 µ l di soluzione di diazotized fast garnet GBC base dal punto 1.4.2.2, 100 µ l di soluzione di fosfato del naftolo AS-BI, 400 µ l di soluzione di acetato e 200 µ l di soluzione di tartrato.</li>
			<li>Mantenere la trappola macchiatura soluzione di miscela in un bagno di acqua a 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare il tampone di seguenti prima di quantificazione di attività di trappola del terreno di coltura.
	<ol>
<li>Preparare il tampone di tartrato (50 mL): 2 mL di acido L-tartarico 0,33 M, 48 mL di 0,33 M tartrato di sodio bibasico disidratare. Regolare il pH a 4.9.</li>
		<li>Preparare 4-nitrofenil fosfato disodico (pNPP) tampone (200 mL): 1,502 g di glicina, 41 mg di MgCl2, 27,2 mg di ZnCl2e 180 mL di acqua deionizzata. Regolare il pH a 10.4 con 3 M NaOH e il volume di 200 mL con acqua deionizzata.</li>
		<li>Preparare il tampone di pNPP con substrato fosfatasi (per una piastra a 96 pozzetti): 49,37 mg di substrato fosfatasi e 175 µ l di tampone di pNPP di passaggio 1.5.2.</li>
		<li>Preparare il tampone substrato (9 mL/96 pozzetti): 6,24 mL di acqua deionizzata, 360 μL di soluzione di acetato e 2,4 mL di tampone tartrato. Mescolare Vortex e preriscaldate a 37 ° C prima dell'uso.</li>
		<li>Aggiungere 90 μL di tampone di pNPP con fosfatasi substrate(1.5.3) a 9ml di substrato preriscaldato buffer(1.5.4) per fare una miscela di substrato e vortexare per 10 s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dissezione (giorno -1)
<ol><li>Eutanasia 3 topi femminili della WT e RapCtsk del one-month-old di CO2 separatamente. Eseguire l'inalazione di CO2 con attrezzature adeguate da personale addestrato.</li>
	<li>Immergere 6 topi in un becher con 100 mL di etanolo al 75% (vol/vol) per 5 min prevenire la contaminazione batterica e poi posto su una tavola di dissezione in posizione supina. Fare un'incisione presso il distale della tibia verticalmente e sezionare la pelle lungo l'arto con forbici oftalmiche.</li>
	<li>Tagliare il legamento articolare dell'articolazione dell'anca con le forbici e dislocare le zampe dal tronco.</li>
	<li>Tagliare il legamento articolare dell'articolazione del ginocchio e attentamente dissociare la tibia e femore al giunto di ginocchio. Rimuovere delicatamente il tessuto molle con le forbici.</li>
	<li>Posizionare tutte le ossa di un genotipo in un mouse a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 2 mL di α-MEM sul ghiaccio. Nota: Per mantenere la vitalità cellulare, l'osso dovrebbe essere mantenuto in queste condizioni per meno di 1 h.</li>
</ol>3. isolamento (giorno -1)
<ol><li>Riempire un pozzetto di una piastra di sei pozzetti con etanolo di 75% (3 mL) e le altre 5 pozzi con mezzo di α-MEM (3 mL).</li>
	<li>Mettere tutte le ossa di un genotipo nel lavaggio di etanolo per 15 ossa s e lavare 5 volte con mezzo di α-MEM per 10 s ogni volta.</li>
	<li>Tagliare delle epifisi con la forbice e inserire un ago di siringa di 0,45 mm la cavità e a filo del midollo osseo fuori con il mezzo di α-MEM in una provetta da centrifuga da 50 mL.</li>
	<li>Sciacquare la cavità dell'osso usando lo stesso metodo da altra estremità dell'osso. Ripetere almeno due volte per lavare accuratamente la cavità dell'osso fino a quando l'osso è pallido.</li>
	<li>Centrifugare il midollo osseo per ottenere un pellet cellulare a 800 x g e a 4 ° C per 5 min, aspirare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 3 mL di tampone di lisi delle cellule di anima rosse nella provetta da centrifuga e pipetta dolcemente per risospendere il midollo osseo. Tenere la provetta da centrifuga sul ghiaccio per 8 min a lisare cellule rosse del sangue.</li>
	<li>Aggiungere 6 mL di terreno di α-MEM nella provetta da centrifuga per interrompere lisi cellulare. Centrifugare a 500 x g e a 4 ° C per 10 min e aspirare il supernatante.</li>
	<li>Risospendere in 3 mL di terreno di coltura di α-MEM e inserire le celle in una piastra a 6 pozzetti (generalmente un mouse per pozzetto).</li>
	<li>Incubare a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% durante la notte.</li>
</ol>4. placcatura (giorno 0)
<ol><li>Trasferire il surnatante in una provetta per centrifuga 15 mL per raccogliere le cellule non attaccate la mattina successiva.</li>
	<li>Centrifugare a 800 x g e a 4 ° C per 5 min e aspirare il supernatante.</li>
	<li>Risospendere in 4 mL di terreno di coltura di α-MEM.</li>
	<li>Prendere 20 µ l della soluzione cella e mescolare con 20 µ l di Trypan Blue. Aggiungere 10 µ l della miscela nella camera di conteggio e ottenere il conteggio delle cellule per mL di soluzione.</li>
	<li>Aggiungere un volume adeguato di α-MEM di coltura per ottenere una soluzione di cella di 500.000 cellule/mL.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l e 50 µ l di terreno di induzione di midollo osseo del macrofago in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e piastra a 96 pozzetti, rispettivamente.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l e 50 µ l di soluzione di cella in ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e piastra a 96 pozzetti, rispettivamente.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per 3 giorni.</li>
</ol>5. differenziazione (giorni 3-7)
<ol><li>Tre giorni dopo il placcaggio, raccogliere medio di 50 µ l di ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e congelare a-20 ° C e quindi aspirare il mezzo residuo.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL e 100 µ l degli osteoclasti induzione media in tutti i pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e una piastra a 96 pozzetti, rispettivamente.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C per 2 giorni.</li>
	<li>Raccogliere 50 µ l di terreno da ogni pozzetto e aspirare il mezzo residuo.</li>
	<li>Aggiungere mezzo induzione degli osteoclasti in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C per 1 giorni. Nota: A questo punto del tempo, grandi, multinucleated osteoclasti dovrebbero essere visto sotto un microscopio invertito (Figura 2A).</li>
	<li>Se non si vedono gli osteoclasti, cambiare il mezzo di induzione degli osteoclasti e osservare quotidianamente fino a quando gli osteoclasti sono visti.</li>
	<li>Raccogliere 50 µ l di terreno da ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti dopo gli osteoclasti sono formate.</li>
</ol>6. tartrato fosfatasi acida resistente (TRAP) colorazione
Nota: Gli osteoclasti maturi possono essere presenti dopo 6-7 giorni di coltura in vitro (passaggio 4).
<ol><li>Medio di aspirare e lavare delicatamente 3 volte con 1x PBS.</li>
	<li>Fissare le cellule in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti con 100 µ l di soluzione di correzione per 30 s a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo la fissazione, aspirare la soluzione di fix e lavare delicatamente 3 volte con acqua deionizzata preriscaldata a 37 ° C. Aspirare acqua deionizzata.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di macchia TRAP in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti e posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 30 min e scudo dalla luce.</li>
	<li>Dopo la colorazione, aspirare la macchia di trappola e delicatamente lavare 3 volte con acqua deionizzata.</li>
	<li>Osteoclasti immagine utilizzando un microscopio invertito a 40 ingrandimenti.</li>
</ol>7. trappola attività quantificazione del terreno di coltura
<ol><li>Raccogliere il supernatante di coltura di 30 µ l di ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti dal passaggio 5.1, 5.4 e 5.8; Utilizzare 30 µ l di terreno di induzione di osteoclasto non coltivate come controllo negativo. Posizionare i campioni in una nuova piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere 90 μL di mixture(1.5.5) di substrato in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti.</li>
	<li>Posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 1 h e scudo dalla luce.</li>
	<li>Fermare la reazione aggiungendo 50 µ l di 3 M NaOH in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti.</li>
	<li>Misurare la theabsorbance alla lunghezza d'onda di 405 nm.</li>
</ol>8. Western Blotting
Nota: Dopo 6-7 giorni di cultura in vitro della piastra a 24 pozzetti, osteoclasti maturi dovrebbero essere visibili.
<ol><li>Aspirare il mezzo.</li>
	<li>Lavare delicatamente con pre-raffreddata 1X PBS 3 volte.</li>
	<li>Aspirare il PBS.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di 1 x SDS lysis buffer contenente l'inibitore della proteasi cocktail.</li>
	<li>Lisati di calore a 105 ° C per 10 min e centrifugare a 12.000 × g e 4 ° C per 10 min. raccogliere i surnatanti contenenti proteine.</li>
	<li>Separare i lisati contenenti 30 µ g di proteina di 10% SDS-PAGE11 e poi il trasferimento ad una membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF).</li>
	<li>Bloccare le membrane con 5% latte scremato per 30 min.</li>
	<li>Incubare le membrane con anti-Raptor, anti-P-S6, anti-S6, anti-β-actina a diluizione 1:1,000 in 5% latte scremato a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>Lavare le membrane con Tris isotonico con Tween-20 (TBST) per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 8,9 due volte.</li>
	<li>Incubare le membrane con perossidasi di rafano (HRP)-coniugato gli anticorpi di IgG anti-topo o coniglio alla diluizione di 1:5,000 in 5% latte scremato per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le membrane 3 volte con TBST per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Per rilevazione chemiluminescente, aggiungere substrato chemiluminescente occidentale di HRP sulle membrane e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Drenare il substrato in eccesso ed esporre le macchie a pellicola di raggi x.</li>
</ol>

<ol><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Feng, X., McDonald, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Disorders of bone remodeling.</a> Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).</li>
<li>Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+osteoclast+biology+reveal+potential+new+drug+targets+and+new+roles+for+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).</li>
<li>Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+osteoclast-like+cells+and+their+progenitors+in+cultures+of+feline+marrow+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells.</a> J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li>
<li>Wong, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRANCE+is+a+novel+ligand+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family+that+activates+c-Jun+N-terminal+kinase+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells.</a> J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).</li>
<li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR%3A+from+growth+signal+integration+to+cancer%2C+diabetes+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).</li>
<li>Bhaskar, P. T., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+TORCs+and+Akt%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The two TORCs and Akt.</a> Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Regulatory-associated+Protein+of+mTOR+%28Raptor%29%2FMammalian+Target+of+Rapamycin+Complex+1+%28mTORC1%29+Signaling+in+Osteoclasts+Increases+Bone+Mass+by+Inhibiting+Osteoclast+Differentiation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice.</a> J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li>
<li>Tevlin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+derivation+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Osteoclast derivation from mouse bone marrow.</a> J Vis Exp. (93), e52056(2014).</li>
<li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL-based+osteoclastogenic+assays+from+murine+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells.</a> Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).</li>
<li>Hsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+receptor+family+member+RANK+mediates+osteoclast+differentiation+and+activation+induced+by+osteoprotegerin+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).</li>
<li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+where+comes+the+osteoclast%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">From where comes the osteoclast?</a> J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).</li>
<li>Wein, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+bone+resorption+in+mice+by+Schnurri-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Control of bone resorption in mice by Schnurri-3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).</li>
</ol>

Tutti gli autori dichiarano che non hanno conflitti di interesse.

Il dosaggio di osteoclastogenico è il metodo più utilizzato per isolare e cultura gli osteoclasti in vitro12,13. Mentre diversi induzioni degli osteoclasti RANKL-base sono stati descritti13,14,15, lo studio presente ha descritto un protocollo con alcune modifiche sulla base dei metodi precedenti.
Nello studio precedente, saggi erano p...

Dell'osso è un organo mutevole ed è ristrutturato da osteoblasti e osteoclasti per tutta la vita. Gli osteoclasti sono responsabili del riassorbimento di matrice mineralizzata e osteoblasti sintetizzano e secernono nuovo osso matrici1. L'equilibrio tra la formazione dell'osso e riassorbimento dell'osso è cruciale per salute dell'osso, compreso il mantenimento di ossa massa e la risposta alla stimolazione e lesioni. Se questo equilibrio viene interrotto, può verificarsi una serie di malattie metaboliche dell'osso, compreso l'osteoporosi e le malattie parodontali. In queste malattie, perdita di massa ossea derivante da riassorbimento osteoclastic dell'osso supera l'osso formando la capacità di osteoblasti2,3. Così, al fine di sviluppare obiettivi farmaceutici per il trattamento di patologie ossee come l'osteoporosi, è fondamentale per capire la generazione e la biologia di osteoclasti4.
Gli osteoclasti sono cellule multinucleated giganti uniche situate in o vicino alla superficie dell'osso e appartengono alla famiglia del monocito/macrofago1. Ibbotson K. J. et al. segnalato un metodo per generare osteoclast-come le cellule in vitro con mezzo contenente 1,25-diidrossi-vitamina D35. L'identificazione del fattore di stimolazione della macrofago-colonia (M-CSF) e attivatore del recettore per il ligando di nuclear factor-κ B (RANKL) come fattori essenziali della formazione degli osteoclasti è aumentato drammaticamente l'efficienza di osteoclastogenesi in vitro 1 , 6 , 7. la capacità di cultura osteoclasti in vitro ha migliorato la nostra comprensione della generazione e regolamento degli osteoclasti.
La destinazione dei mammiferi/meccanicistica rapamycin (mTOR) funzioni in due complessi strutturalmente e funzionalmente distinte, vale a dire mTORC1 e mTORC28,9. I due complessi della multi-proteina sono distinti gli uni dagli altri a causa dei loro diversi componenti e substrati a valle. mTORC1 contiene la proteina unica regolamentazione-collegata di mTOR (Raptor), mentre mTORC2 contiene il compagno rapamicina-insensibile di mTOR (Rictor)9. mTORC1 è in grado di integrare e trasmettere segnali importanti per regolare la crescita cellulare, la proliferazione e la differenziazione. Recentemente, abbiamo dimostrato che mTORC1 svolge un ruolo chiave nella rete di riassorbimento dell'osso catabolico dall'eliminazione di Raptor per inattivare mTORC1 in osteoclasti10. Tuttavia, i meccanismi di fondo richiedono ulteriore studio. Nel presente studio, un metodo basato su RANKL osteoclastogenico è stato usato per generare gli osteoclasti da derivate da midollo osseo macrofagi (saggi) di wild-type (WT) e topi RapCtsk e di studiare l'influenza di inattivazione di mTORC1 su osteoclasto formazione.

<table><tbody><tr><td>Raptorfl/fl topi</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>013188</td><td></td></tr><tr><td>Ctsk-cre un</td><td></td><td></td><td>regalo da S. Kato, Università di Tokyo, Tokyo, Giappone</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Corning</td><td>10-022-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Gibico</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina streptomicina</td><td>Gibico</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>BioInd</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Proteina M-CSF di topo ricombinante</td><td>R& D</td><td>Q3U4F9</td><td></td></tr><tr><td>Proteina RANKL ricombinante di topo</td><td>R& D</td><td>Q3TWY5</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lisi RBC</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302643</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di citrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit Fosfatasi Acida, Leucociti (TRAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Fast Garnet GBC Soluzione base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3872</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di nitrito di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>Naftolo AS-BI Soluzione di fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3871</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3863</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tartrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3873</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-031-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-tartarico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251380</td><td></td></tr><tr><td>Tartrato di sodio bibasico disidratato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4797</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrato della fosfatasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4744</td><td></td></tr><tr><td>anti-Raptor</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2280</td><td></td></tr><tr><td>anti-P-proteina ribosomiale S6 (S235/236)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2317</td><td></td></tr><tr><td>proteina anti-ribosomiale S6</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2211</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-actina</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>sc-130300</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldeide</td><td>Xilong scientific</td><td></td><td></td></tr> membrana di <tr><td>fluoruro di polivinilidene (PVDF)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western Chemiluminescente HRP Substrato (ECL)</td><td>Millipore</td><td>00000367MSDS</td><td></td></tr><tr><td>IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Envision</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm siringa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forbice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td></td><td></td><td></td> per zanzare</tr></tbody></table>

un base di rankl osteoclast cultura assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mtorc1 nella formazione degli osteoclasti

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Gli osteoclasti sono unico osso-resorbing cellule che si differenziano da monocito/macrofagica del midollo osseo. Una serie di malattie metaboliche dell'osso, compreso osteoporosi può provocare disfunzione degli osteoclasti. Per sviluppare obiettivi farmaceutici per la prevenzione della perdita di massa ossea patologica, si devono intendere i meccanismi da cui gli osteoclasti differenziano dai precursori. La capacità di isolare e un gran numero di osteoclasti in vitro della coltura è fondamentale al fine di determinare il ruolo di geni specifici nel corso del differenziamento degli osteoclasti. Inattivazione del mammiferi/meccanicistica bersaglio della rapamicina complesso 1 (TORC1) in osteoclasti può diminuire il numero degli osteoclasti e aumentare la massa ossea; Tuttavia, i meccanismi di fondo richiedono ulteriore studio. Nello studio presente, un protocollo basato su RANKL per isolare e cultura osteoclasti da midollo osseo di topo e di studiare l'influenza di inattivazione di mTORC1 sulla formazione degli osteoclasti è descritto. Questo protocollo ha provocato con successo un gran numero di osteoclasti giganti, in genere entro una settimana. Eliminazione di Raptor alterata formazione di osteoclasti ed ha fatto diminuire l'attività secretiva fosfatasi acida tartrato-resistente, che indica che mTORC1 è essenziale per la formazione degli osteoclasti.

Utilizzando il presente protocollo, un gran numero di osteoclasti giganti sono stato veduto il giorno 6; Se non si vedono gli osteoclasti giganti, un altro giorno di differenziazione di osteoclasto può essere necessari (Figura 1). Formazione di osteoclasti successo è stata confermata dalla trappola macchiatura (Figura 2A). Osteoclasts erano cellule giganti di vino rosso/viola con più di 3 nuclei. Più di 250 osteoclasti sono stati...

Questo manoscritto descrive un protocollo a isolare e cultura gli osteoclasti in vitro da midollo osseo di topo e di studiare il ruolo della destinazione dei mammiferi/meccanicistica della rapamicina complesso 1 nella formazione degli osteoclasti.

Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di isolare e coltivare osteoclasti in vitro da midollo osseo di topo e di studiare il ruolo del bersaglio mammifero del complesso rapamicina uno nella formazione degli osteoclasti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella formazione degli osteoclasti, come il ruolo di mTORC1 nella differenziazione degli osteoclasti. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di produrre un gran numero di osteoclasti giganti entro una settimana.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dell'osteoporosi perché è utile studiare il meccanismo con cui gli osteoclasti si differenziano dai loro precursori. Per iniziare questa procedura, praticare un'incisione verticale all'estremità distale della tibia di un topo soppresso e sezionare la pelle lungo gli arti posteriori. Quindi, taglia il legamento articolare delle articolazioni dell'anca con le forbici e disloca gli arti posteriori dal tronco.Tagliare il legamento articolare dell'articolazione del ginocchio e dissociare attentamente la tibia e il femore da esso. Rimuovere delicatamente il tessuto molle con le forbici. Mettere tutte le ossa di un topo in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti con due millilitri di alfa-MEM su ghiaccio.Per l'isolamento, riempire un pozzetto di una piastra a sei pozzetti con etanolo al 75% e gli altri cinque pozzetti con alfa-MEM. Mettere tutte le ossa di un topo nel lavaggio con etanolo per 15 secondi, quindi lavare le ossa cinque volte con alfa-MEM per 10 secondi ogni volta. Taglia le epifisi con la forbice e inserisci un ago da siringa da 0,45 millimetri nella cavità ossea.Sciacquare il midollo con alfa-MEM in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Quindi, sciacquare la cavità ossea usando lo stesso metodo dall'altra estremità dell'osso. Ripetere almeno due volte per lavare accuratamente la cavità ossea fino a quando l'osso non è pallido.Successivamente, centrifugare il midollo osseo per ottenere un pellet cellulare a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, aspirare il surnatante. Aggiungere tre millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi nella provetta da centrifuga e pipettare delicatamente per risospendere il midollo osseo.Quindi, tenere la provetta da centrifuga sul ghiaccio per otto minuti per lisare i globuli rossi. Dopo otto minuti, aggiungere sei millilitri di alfa-MEM nella provetta da centrifuga per fermare la lisi cellulare. Centrifugare a 800 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti e aspirare il surnatante.Quindi, risospendere in tre millilitri di terreno di coltura alfa-MEM e posizionare le cellule in una piastra a sei pozzetti. Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. In questa fase, trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga da 15 millilitri per raccogliere le cellule non attaccate la mattina successiva.Successivamente, centrifugare a 800 g e quattro gradi Celsius per cinque minuti e aspirare il surnatante. Quindi, risospendere le cellule in quattro millilitri di terreno di coltura alfa-MEM. Assumere 20 microlitri della soluzione cellulare e mescolare con 20 microlitri di Trypan Blue.Successivamente, aggiungere 10 microlitri della miscela alla camera di conteggio e ottenere la conta cellulare per millilitro di soluzione. Successivamente, aggiungere un volume appropriato di terreno di coltura alfa-MEM per ottenere una soluzione cellulare di 500.000 cellule per millilitro. Quindi, aggiungere 500 microlitri e 50 microlitri di terreno di induzione dei macrofagi del midollo osseo in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e una piastra da 96 pozzetti, rispettivamente.Successivamente, aggiungere 500 microlitri e 50 microlitri di soluzione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e di una piastra a 96 pozzetti, rispettivamente. Incubare a 37 gradi Celsius per tre giorni. Tre giorni dopo la placcatura, raccogliere 50 microlitri di terreno da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e congelarlo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius.Quindi, aspirare il mezzo residuo. Aggiungere un millilitro e 100 microlitri di terreno di induzione degli osteoclasti in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e di una piastra a 96 pozzetti, rispettivamente. Incubare a 37 gradi Celsius per due giorni.Dopo due giorni, raccogliere 50 microlitri di terreno da ciascun pozzetto e aspirare il terreno residuo. Quindi, aggiungere il terreno di induzione degli osteoclasti in ciascun pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per un giorno. Dopo che gli osteoclasti si sono formati, raccogliere 50 microlitri di terreno da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.In questa fase, aspirare il terreno e lavare delicatamente il campione tre volte con 1X PBS. Quindi, fissare le cellule in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti con 100 microlitri di soluzione fissa per 30 secondi a temperatura ambiente. Dopo il fissaggio, aspirare la soluzione di fissaggio e lavare delicatamente le cellule tre volte con acqua deionizzata preriscaldata a 37 gradi Celsius.Quindi, aspirare l'acqua deionizzata e aggiungere 100 microlitri di colorante TRAP in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Metti la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti e proteggila dalla luce. Dopo la colorazione, aspirare la macchia TRAP e lavare delicatamente tre volte con acqua deionizzata.Successivamente, visualizzare gli osteoclasti in un microscopio invertito con un ingrandimento di 40X. Quindi, trasferire 30 microlitri del terreno raccolto in precedenza in una nuova piastra a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 90 microlitri di miscela di substrato in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.Metti la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per un'ora e proteggila dalla luce. Dopo un'ora, interrompere la reazione aggiungendo 30 microlitri di idrossido di sodio a tre molari in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Quindi, misurare l'assorbanza alla lunghezza d'onda di 405 nanometri con il lettore di piastre multietichetta EnVision.Ecco la vista rappresentativa degli osteoclasti osservati in campo chiaro il sesto giorno. La linea rossa delineava il bordo degli osteoclasti. E qui è mostrato un osteoclasta tipicamente gigante, multinucleato, TRAP-positivo.La freccia nera indicava due nuclei dell'osteoclasta multinucleato. Questa figura mostra la colorazione TRAP dei BMM il sesto giorno. Vengono mostrate immagini ad alto ingrandimento dei quadrati nei gruppi knockout wild-type e Ctsk-Cre Raptor, rispettivamente.Questi erano osteoclasti meno giganti, positivi per TRAP, formatisi nei BMM knockout Ctsk-Cre Raptor rispetto al gruppo wild-type. Questa figura mostra l'attività TRAP di BMM in coltura wild-type e Ctsk-Cre Raptor knockout. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro una settimana se viene eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere la vitalità dei macrofagi del midollo osseo, poiché la densità di semina ottimale dei macrofagi vitali del midollo osseo è fondamentale. Si consiglia di mantenere l'osso in ghiaccio per non più di un'ora e di risospendere delicatamente le cellule. Questa procedura può essere combinata con altre metodiche, come il saggio di riassorbimento degli osteoclasti con fette ossee, per studiare la fisiologia normale e patologica degli osteoclasti.Con questo metodo, abbiamo scoperto che mTORC1 svolge un ruolo importante nella formazione degli osteoclasti, che potrebbe fungere da potenziale bersaglio farmacologico per il trattamento di disturbi metabolici ossei, come l'osteoporosi, in futuro.

a-rankl-based-osteoclast-culture-assay-mouse-bone-marrow-to

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Trattamento di osteoblasti di topo primari con acido retinoico produce una popolazione omogenea di cellule ramificate recanti caratteristiche morfologiche e molecolari di osteociti. Il metodo supera la difficoltà di ottenere e mantenere osteociti primari in coltura, e può essere vantaggioso per studiare cellule derivate da modelli transgenici.

Applicazione di acido retinoico per ottenere colture osteocytes da principale del mouse osteoblasti

La differenziazione delle cellule precursori in osteoclasti è regolata da citochine e fattori di crescita. Qui vengono descritti una nuova tecnica di trasferimento genico per la differenziazione degli osteoclasti in vivo e protocolli di coltura cellulare per differenziare le cellule precursori in osteoclasti in vitro come metodo per studiare gli effetti delle citochine sull'osteoclastogenesi.

A Novel In vivo Tecnica Gene Transfer e In vitro test cellulari per lo studio della perdita ossea nei disturbi muscoloscheletrici

Gli osteoclasti sono cellule che riassorbono l'osso principale nel corpo. La capacità di isolare osteoclasti in gran numero ha causato notevoli progressi nella comprensione della biologia osteoclasti. In questo protocollo, si descrive un metodo per l'isolamento, la coltivazione e quantificare l'attività degli osteoclasti in vitro.

Osteoclasti derivazione dal midollo osseo di topo

La segnalazione notch è una forma di comunicazione cellulare che si basa sul contatto diretto tra le cellule. Per indurre correttamente la segnalazione di Notch in vitro, i ligandi di Notch devono essere presentati alle cellule in uno stato immobilizzato. Questo protocollo descrive i metodi per la stimolazione in vitro della segnalazione Notch nei precursori degli osteoclasti di topo.

La stimolazione di Notch segnalazione in mouse osteoclasti Precursori

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un in vitro umano modello preclinico di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico in coltura con linee cellulari di cancro al seno per simulare l'interazione cellula-osteoclasto cancro. Il modello potrebbe essere utilizzato per avanzare la nostra comprensione della formazione di metastasi ossea e migliorare le opzioni terapeutiche.

Sviluppo di un modello preclinico umano di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico co-coltivati con linee cellulari di cancro al seno

In questo articolo, presentiamo metodi per isolare e differenziare cellule stromali del midollo osseo e cellule staminali ematopoietiche da ossa lunghe del mouse. Due differenti protocolli sono presentati ottenendo diverse popolazioni cellulari adatte per espansione e differenziazione in osteoblasti, adipociti e gli osteoclasti.

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

Gli osteoclasti sono polykaryons di macrofage specifici del tessuto derivato dal lignaggio dei monociti-macrofage delle cellule staminali ematopoietiche. Questo protocollo descrive come isolare le cellule del midollo osseo in modo da ottenere grandi quantità di osteoclasti riducendo il rischio di incidenti riscontrati nei metodi tradizionali.

Isolamento, purificazione e differenziazione dei precursori dell'osteoclast dal midollo osseo del ratto

Questo protocollo comprende dissezione delle ossa lunghe murine e isolamento del midollo osseo, per generare i macrofagi del midollo osseo e producono gli osteoclasti usando fattore (M-CSF) e attivatore del ricevitore del legante di fattore nucleare Kappa-B (RANKL) di stimolazione della Colonia del macrofago o fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e loro arresto dall'anticorpo anti-c-fms, ricevitore di M-CSF.

Effetto dell'anticorpo Anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti e la proliferazione dei precursori degli osteoclasti In Vitro

Questo protocollo descrive un metodo canonico per comprendere i geni critici che controllano l'attività osteoclasta in vivo. Questo metodo utilizza un modello di topo transgenico e alcune tecniche canoniche per analizzare il fenotipo scheletrico.

Analisi del fenotipo scheletrico di un modello di mouse di eliminazione Stat3 condizionale

Qui, presentiamo una procedura di analisi semplice ed efficace per i saggi di riassorbimento della fossa utilizzando piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio.

Un semplice protocollo di analisi dei pozzi per visualizzare e quantificare il riassorbimento osteoclastico in vitro

Scopri come isolare e coltivare osteoclasti dal midollo osseo di topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella differenziazione cellulare. Questo metodo genera un gran numero di osteoclasti giganti in una settimana.

Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti (Video) | JoVE Journal

Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti

Esplora altri video