Metodi di trasferimento Proprio localizzata di cellule o DNA in precoce post-impianto di embrioni di topo

L'obiettivo generale di queste procedure è dimostrare come trasferire con precisione cellule o DNA in embrioni di topo in fase precoce post-impianto. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali della biologia dello sviluppo, come testare il potenziale in vivo di cellule coltivate in vitro e le funzioni di determinati geni in specifiche fasi embrionali. I principali vantaggi di queste tecniche sono che non richiedono alcun equipaggiamento specializzato e rendono possibile la manipolazione sperimentale di embrioni di topo in fase precoce post-impianto. Dopo aver sacrificato una femmina gravida al giorno E 7,5 o E 8,5 secondo il protocollo descritto, utilizzare forbici e pinzette per isolare l'utero e posizionarlo in una piastra da 30 millimetri contenente mezzo M due con due paia di pinzette fini.

Separare con attenzione il miometrio, quindi staccare il deciduo, avendo cura di non perforare le cavità extraembrionali. Rimuovere la membrana di Riker utilizzando pinzette per pizzicarla e separarla lentamente dall'embrione. Quindi, al microscopio stereoscopico, controllare gli embrioni per assicurarsi che il sacco vitellino, l'amnios e il cono placentare siano integri. Con una pipetta, trasferire gli embrioni in una capsula pulita di M2 e posizionarli su un coperchio di una capsula di Petri di 30 millimetri su ghiaccio o una piattaforma di ghiaccio per raffreddare parzialmente gli embrioni.

Preparare il mezzo di coltura e coltivare gli embrioni seguendo il protocollo descritto nel testo per innestare cellule coltivate in embrioni di topo. Iniziare utilizzando una punta da pipetta da 200 microlitri per staccare fisicamente le cellule staminali blastocistiche, che esprimono ubiquitariamente GFP, da una piastra da sei pozzetti. Trasferire le cellule nella piastra contenente gli embrioni.

Collegare una pipetta capillare per innesto tirata a mano al tubo dell'aspiratore per creare una pipetta orale; aspirare delicatamente con la bocca per far entrare uno o più aggregati cellulari composti da più di 20 cellule nella pipetta capillare per innesto. Quindi espellere delicatamente le cellule per disperdere gli aggregati più grandi. Selezionare un aggregato contenente circa da 10 a 20 cellule e aspirarlo nella pipetta capillare per innesto.

Di nuovo, mantenere l'aggregato vicino all'apertura della capillare con una pinzetta. Tenere l'embrione in posizione in modo morbido e inserire la capillare per il trapianto nella regione di interesse. Per creare un'apertura.

Espellere delicatamente l'aggregato dalla capillare di innesto, lasciando nel blastocisti un breve tratto composto da 10-20 cellule. Lasciare i blastocisti nella stessa piastra contenente mezzo M due e utilizzare un microscopio stereoscopico a fluorescenza con telecamera per acquisire le immagini dei blastocisti innestati. Ridurre al minimo il tempo di acquisizione per evitare un'eccessiva esposizione dei blastocisti alla luce e al calore.

Immediatamente dopo l'acquisizione delle immagini utilizzando una pasta, trasferire gli embrioni con un volume minimo di mezzo M due in un mezzo di coltura pre-equilibrato e coltivare seguendo le linee guida descritte nel protocollo testuale. Prima di eseguire esperimenti di elettroporazione, utilizzare una micropipetta orizzontale polarizzata per tirare le pipette per iniezione del DNA con una punta fine e un'apertura inferiore a 10 micrometri per evitare danni ai tessuti. Per l'elettroporazione con capillari di vetro, utilizzare un microforgiatore per tagliare l'apertura delle pipette per iniezione del DNA in modo da ottenere un diametro interno di 20 o 30 micrometri, con una punta pulita e senza bordi rotti. Fissare ciascun elettrodo di platino a un filo sottile isolato e inserirlo in un portaaighi da microiniezione ricoperto con nastro isolante.

Per preparare un elettrodo capillare artigianale, inserire un filo di platino del diametro di 0,2 millimetri in una pipetta capillare per elettroporazione con un'apertura fissa di 20 o 30 micrometri di diametro. Per focalizzare la corrente elettrica e consegnare il DNA plasmidico a una piccola regione d'interesse nell'embrione. Per realizzare un elettrodo a forma di L, piegare un filo di platino del diametro di 0,2 millimetri, creando una forma a L con la porzione orizzontale lunga circa un millimetro.

Montare i portaaighi su supporti standard per strumenti di micromanipolazione. Collegare l'elettrodo capillare all'anodo dell'alimentatore. Collegare l'elettrodo a forma di L all'anodo del multimetro.

Quindi collegare il catodo del multimetro al catodo dell'alimentatore. Riempire la capillare di vetro per elettroporazione con PBS fino a uno o due millimetri dal bordo superiore e inserire l'elettrodo di platino dritto nella capillare di vetro fino a raggiungere il fondo della stessa. Ancorare l'elettrodo a forma di L sulla superficie della piastra di Petri da 30 millimetri riempita con PBS.

Utilizzare una pompa pneumatica pico per l'iniezione del DNA. Inserire l'ago di iniezione dall'eblasto laterale nella cavità amniotica dell'embrione e iniettare circa cinque microlitri di soluzione di DNA nella cavità o fino a quando non sarà completamente piena. Prestare attenzione a non far scoppiare l'embrione.

Quindi posizionare con attenzione l'embrione tra gli elettrodi e spostare l'elettrodo capillare nella posizione precisa in cui il DNA deve essere consegnato. Utilizzando 200 volt in sei impulsi, ciascuno della durata di 50 millisecondi, elettroporare l'embrione con un intervallo di un secondo tra ogni impulso. Trasferire immediatamente l'embrione nel mezzo di coltura pre-equilibrato prima di ripetere l'elettroporazione per l'embrione successivo.

Rilevare cellule vive o morte elettroporate due ore dopo l'elettroporazione. Secondo il protocollo descritto, qui è mostrato un embrione con cellule staminali della linea epiblastica che esprimono ubiquitariamente EGFP, innestate a E 7,5 e coltivate ex vivo per 24 ore. Quando da 10 a 16 fscs sono state innestate in embrioni a E 7,5, si sono incorporate e hanno proliferato correttamente all'interno dell'embrione ospite.

Tuttavia, innestare un numero maggiore di cellule non porta a un migliore chimismo e anzi determina la formazione di aggregati non incorporati, come dimostrato qui. Come mostrato in questa elettroporazione di plasmidi esprimenti GFP. Le cellule positive per GFP sono state rilevate da una a due ore dopo l'elettroporazione.

Quando le cellule dell'epiblasto distale in embrioni allo stadio di striato primitivo avanzato sono state elettroporate, le cellule marcate hanno contribuito al derma neurale dopo 24 ore di coltura, il che corrisponde alle mappe di destino note per le cellule dell'epiblasto in embrioni allo stadio gastrula. Questa figura mostra che, in modo simile all'uso di altri tipi di elettrodi per l'elettroporazione, anche l'elettrodo capillare ha causato un certo grado di morte cellulare nella regione bersaglio. Poiché questa regione appariva di colore più scuro rispetto alle regioni adiacenti, i nuclei delle cellule morte sono stati marcati con un colorante fluorescente rosso lontano impermeabile alla membrana.

È stato confermato che la tecnica di elettroporazione capillare provoca la morte di un numero ridotto di cellule nelle immediate vicinanze del sito di elettroporazione. Durante l'esecuzione di queste procedure, è fondamentale iniziare la coltura degli embrioni entro due ore. Dopo aver isolato l'utero dai topi al termine della coltura, gli embrioni possono essere fissati.

Altri metodi, come la colorazione di sezioni, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio sul contributo di cellule donate o di cellule intrecciate elettricamente agli embrioni ospiti. Dopo aver visto questo video, dovremmo avere una buona comprensione di come trasferire con precisione cellule o DNA in embrioni di topo precoci post-impianto.