Metodi di trasferimento Proprio localizzata di cellule o DNA in precoce post-impianto di embrioni di topo

L'obiettivo generale di queste procedure è dimostrare come trasferire con precisione le cellule o il DNA in embrioni di topo post-impianto. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo, come testare il potenziale in vivo delle cellule coltivate in vitro e le funzioni di alcuni geni in specifici stadi embrionali. I principali vantaggi di queste tecniche sono che non richiedono alcuna attrezzatura specializzata e rendono possibili manipolazioni sperimentali del topo di piantagione in posa precoce bryo Dopo aver sacrificato una femmina incinta il giorno E 7.5 o E 8.5 secondo il protocollo di testo, utilizzare forbici e pinze per isolare l'utero e metterlo in un piatto da 30 millimetri riempito con M due medium con due paia di pinze sottili.

Strappare con cura il miometrio, quindi staccare la decidua, facendo attenzione a non perforare le cavità embrionali extra. Rimuovere la membrana del riker usando una pinza per pizzicarla e separarla lentamente dall'embrione. Quindi, sotto un microscopio da dissezione stereoscopica, controllare gli embrioni per assicurarsi che l'amnio del sacco vitellino e il cono op placentare siano intatti Con una pipetta, trasferire gli embrioni in una piastra pulita di M due e posizionarli su una capsula di Petri di plastica da 30 millimetri con coperchio su ghiaccio o una piattaforma di ghiaccio per raffreddare parzialmente gli embrioni.

Preparare il terreno di coltura e gli embrioni di coltura secondo il protocollo di testo per innestare le cellule coltivate in embrioni di topo. Iniziate utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri per raschiare fisicamente le cellule staminali eblast, che esprimono ovunque la GFP da una piastra di coltura a sei pozzetti. Trasferisci le cellule nel piatto contenente gli embrioni.

Collegare un capillare da innesto tirato a mano al tubo di aspirazione per fare una pipetta orale Aspirare delicatamente la pipetta orale per aspirare uno o più grumi cellulari di più di 20 cellule nel capillare di innesto. Quindi soffiare delicatamente le cellule per disperdere i grandi grumi. Selezionare un ciuffo contenente circa 10-20 cellule e aspirarlo nel capillare di innesto.

Anche in questo caso, mantenendo il ciuffo vicino all'apertura del capillare con un paio di pinze. Tenere l'embryo in posizione libera e inserire il capillare dell'innesto nella regione di interesse. Per creare un'apertura.

Espellere delicatamente il grumo dal capillare dell'innesto, lasciando la breve stringa di 10-20 cellule alloggiata nell'embrione. Lasciare gli embrioni nella stessa piastra di terreno M two e utilizzare un microscopio da dissezione con composto a fluorescenza e una fotocamera per visualizzare gli embrioni innestati. Mantenere il tempo di imaging al minimo per evitare l'esposizione degli embrioni a luce e calore eccessivi.

Immediatamente dopo l'imaging con una pasta, trasferire gli embrioni con un volume minimo di terreno M due al terreno di coltura pre-bilanciato e alla coltura secondo le linee guida del protocollo di testo prima di eseguire esperimenti di elettroporazione, utilizzare una micropipetta orizzontale polare per estrarre le pipette per iniezione di DNA con una punta sottile e un'apertura inferiore a 10 micrometri per evitare danni ai tessuti. Per l'elettroporazione capillare in vetro, utilizzare una microforgia per tagliare l'apertura delle pipette per iniezione di DNA a un diametro interno di 20 o 30 micrometri con una punta pulita e senza bordi rotti. Collegare ciascun elettrodo di platino a un sottile filo isolato e inserirlo in un portaaghi per microiniezione coperto con nastro isolante.

Per preparare un elettrodo capillare fatto a mano, inserire un filo di platino di 0,2 millimetri di diametro in un capillare di vetro per elettroporazione con un'apertura fissa di 20 o 30 micrometri di diametro. Focalizzare la corrente elettrica e consegnare il DNA plasmatico a una piccola regione di interesse nell'embrione. Per fare in modo che un elettrodo a forma di L pieghi un filo di platino di 0,2 millimetri di diametro, creando una forma a L con la porzione orizzontale della L lunga circa un millimetro.

Montare i portaaghi sui portaaghi standard per strumenti di micromanipolazione. Collegare l'elettrodo capillare all'anodo dell'alimentatore. Collegare l'elettrodo a forma di L all'anodo del multimetro.

Quindi collegare il catodo del multimetro al catodo dell'alimentatore. Riempire il capillare in vetro per elettroporazione con PBS entro uno o due millimetri dalla parte superiore e inserire l'elettrodo di platino diritto nel capillare in vetro fino a raggiungere la parte inferiore del capillare. Ancorare l'elettrodo a forma di L sulla superficie della capsula di Petri da 30 millimetri riempita di PBS.

Utilizzare una pompa pico pneumatica per l'iniezione di DNA. Inserire l'ago per iniezione dall'eblast laterale nella cavità amniotica dell'embrione e iniettare circa cinque microlitri di soluzione di DNA nella cavità o fino a quando non è completamente piena. Fare attenzione a non far scoppiare l'embrione.

Quindi posizionare con cura l'embrione tra gli elettrodi e spostare l'elettrodo capillare nella posizione precisa in cui il DNA deve essere consegnato. Utilizzando 200 volt in sei impulsi della durata di 50 millisecondi ciascuno, ha elettroporato l'embrione con un intervallo di un secondo tra ogni impulso. Trasferire immediatamente l'embrione in un terreno di coltura pre-bilanciato prima di ripetere l'elettroporazione per l'embrione successivo.

Rileva le cellule vive o morte elettroporate due ore dopo l'elettroporazione. Secondo il protocollo di testo mostrato qui è un embrione con epi PSC che esprimono ubiquitariamente EGFP innestato su E 7.5 e coltivato ex vivo per 24 ore. Quando da 10 a 16 fsc sono state innestate in embrioni E 7.5, si sono incorporate e hanno proliferato bene all'interno dell'embrione ospite.

Tuttavia, l'innesto di più cellule non si traduce in un migliore chimerismo e di fatto si traduce in grumi non incorporati, come dimostrato qui. Come mostrato in questa elettroporazione di plasmidi che esprimono GFP. Le cellule GFP positive sono state rilevate una o due ore dopo l'elettroporazione.

Quando le cellule distali dell'eblast nell'embrione dello stadio tardo primitivo sono state elettroporate, le cellule marcate hanno contribuito al derma neurale dopo 24 ore in coltura, il che corrisponde alle mappe del destino note delle cellule dell'eblast negli embrioni allo stadio gastro. Questa figura mostra che, in modo simile all'utilizzo di altri tipi di elettrodi per l'elettroporazione, l'elettrodo capillare ha anche causato un certo grado di morte cellulare nella regione bersaglio. Poiché questa regione appariva di colore più scuro rispetto alle regioni vicine, i nuclei delle cellule morte con una membrana impermeabile alla luce della fluorescenza rossa morivano.

Confermato che la tecnica di elettroporazione capillare produce solo un piccolo numero di cellule morte vicino al sito di elettroporazione. Durante il tentativo di queste procedure, è importante iniziare a coltivare gli embrioni entro due ore. Dopo aver isolato l'utero dai topi alla fine della coltura, gli embrioni possono essere riparati.

Altri metodi, come la colorazione con sezionamento, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come il contributo di un donatore o di cellule elettrointrecciate agli embrioni ospiti. Dopo aver visto questo video, dovremmo avere una buona comprensione di come trasferire con precisione le cellule del nostro DNA in embrioni di topo post-impianto.