Name: Fluorescenza Time-lapse imaging del Complete S. venezuelae Ciclo di vita Uso di un dispositivo a microfluidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Scopri la microscopia a fluorescenza time-lapse per studiare il ciclo di vita completo di Streptomyces venezuelae utilizzando dispositivi microfluidici. Questo metodo consente l'osservazione in tempo reale della sporulazione e della localizzazione proteica.

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Gli autori ringraziano Grant Calder per l'assistenza tecnica con il microscopio, Matt Bush per i commenti sul protocollo e il John Innes Centre per l'acquisto del microscopio a campo largo Zeiss. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione BBSRC BB/I002197/1 (a M.J.B.), dalla sovvenzione BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 al John Innes Centre, dalla sovvenzione del Consiglio svedese della ricerca 621-2010-4463 (a K.F.) e da una borsa di studio post-dottorato Leopoldina (a S.S.).

1. Isolamento di Fresh S. venezuelae spore e Preparazione del terreno di coltura esaurito <ol><li> Seminare 30 ml maltosio-Yeast Extract-estratto di malto (MYM) medio, integrato con 60 microlitri R2 soluzione oligoelemento (TE), con 10 microlitri spore di tensione SV60 [ATTB φ BT1 :: pSS209 (P divIVA - divIVA-mCherry P FtsZ -ftsZ-ypet)]. Per la crescita costante e sporulazione delle cellule, utilizzare un pallone confuso o un pallone che contiene una molla per consentire una sufficiente aerazione. </li><li> cellule di coltura per 35-40 ore a 30 ° C e 250 rpm. </li><li> Esaminare le cellule di liquido montato microscopio a contrasto di fase. A questo punto frammenti e spore micelio saranno visibili. </li><li> Centrifuga 1 ml cellule in una centrifuga da tavolo a 400 xg per 1 minuto per far sedimentare il micelio e frammenti di cellule più grandi. </li><li> Trasferire circa 300 microlitri surnatante containing una sospensione di spore in una nuova provetta da 1,5 ml e tenere in ghiaccio. Tenere il terreno di coltura per la restante fase 1.7. </li><li> Diluire spore 1:20 in MYM-TE (concentrazione finale: 0,5-5 x 10 7 spore / ml) e tenere in ghiaccio fino al momento (vedi punto 2.3). Nota: Anche se le esatte condizioni che scatenano sporulazione in Streptomyces non sono compresi, utilizzando speso medio MYM-TE, comprese le eventuali segnali extracellulari sconosciuti da una cultura sporulanti, stimola la sporulazione. </li><li> Filtro-sterilizzare 10 ml di terreno di coltura residuo per ottenere speso MYM-TE che è libero di spore e frammenti di micelio. Utilizzare un filtro siringa da 0,22 micron sterile e trasferimento trascorso MYM-TE a una provetta sterile 15 ml. </li><li> Tenere il preparato speso MYM-TE per alcuni giorni a 4 ° C, se gli esperimenti aggiuntivi utilizzando le condizioni di crescita simili devono essere effettuate. </li></ol> 2. Preparazione del dispositivo a microfluidi Nota: ogni pla microfluidicate permette fino a quattro esperimenti indipendenti da effettuare. Per evitare la contaminazione delle camere di flusso non utilizzati, usare soluzioni sterili e le condizioni di lavoro quando si imposta un esperimento. <ol><li> Rimuovere soluzione di spedizione dalla piastra microfluidica e lavare i pozzetti con sterili MYM-TE. </li><li> Aggiungere 300 ml MYM-TE a presa bene 1 e 300 ml speso MYM-TE per pozzi da 2 a 6. </li><li> Caricare 40 ml diluiti spore dal punto 1.6 a carico delle cellule ben 8 di corsia &quot;A&quot; e sigillano il collettore alla piastra secondo le istruzioni produce. </li><li> Avviare il software di controllo microfluidica, selezionare il tipo di piatto appropriato e impostare un programma di flusso per innescare il canale di flusso e la camera di cultura da parte di media che scorre da pozzi di ingresso da 1 a 5 a 6 psi per 2 minuti per pozzetto. </li><li> Nel software di controllo microfluidica, creare un protocollo di flusso per l&#39;esperimento: scorre MYM-TE dal bocchettone 1 per 6 ore per consentire la germinazione e la crescita vegetativa delle cellule. Interruttorepoi perfusione trascorso MYM-TE da ben 2 a 5 per il tempo rimanente dell&#39;esperimento. Nel corso dell&#39;esperimento mantenere costante la pressione di flusso a 6 psi (corrispondenti a circa 9 microlitri medio / hr). Avviare il programma di flusso dopo la fase 3.5. </li></ol> 3. Impostazione del microscopio e il protocollo Time-lapse Nota: Questo metodo è stato implementato su un microscopio invertito widefield completamente motorizzato e automatizzato dotato di una fotocamera sCMOS, una lampada ad alogenuri metallici, una messa a fuoco automatica dell&#39;hardware, un supporto palcoscenico per 96 pozzetti e una camera climatica. <ol><li> Pre-riscaldare la camera ambientale di 30 ° C in anticipo per evitare problemi con l&#39;autofocus dopo l&#39;inizio dell&#39;esperimento. Il tempo richiesto dipende dalla camera ambientale usato, il microscopio e il sistema di riscaldamento. Iniziare a riscaldare il sistema la notte prima dell&#39;esperimento. </li><li> Accendere il microscopio e l&#39;automazione e il controllo microscopio softwari. Utilizzare un&#39;alta apertura numerica (NA) obiettivo ad immersione per la raccolta ottimale del segnale e risoluzione spaziale, come ad esempio un 100X, 1.46 olio NA obiettivo DIC. Selezionare filtri appropriati e specchi bicrome di acquisire differenziale di contrasto interferenze immagini (DIC) e le immagini di fusioni di proteine ​​di colore giallo-fluo e rosso-fluorescenti. </li><li> Mettere una goccia di olio di immersione sul oggettivo e aggiungere liquido di immersione al fondo della finestra di imaging sulla piastra microfluidica per migliorare cell-focus durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. montare con attenzione il dispositivo di microfluidica sigillata (passo 2.5) sul palco del microscopio invertito. Assicurarsi che la piastra sia posizionato correttamente nel supporto fase e non si sposta nel corso dell&#39;esperimento. </li><li> Portare la finestra di imaging della camera di cultura microfluidica a fuoco utilizzando gli indicatori di posizione integrati per l&#39;orientamento. Primo sulla parte sinistra della prima camera di flusso (etichetta &quot;A&quot;) con la dimensione trap 5, corrispondenti aun&#39;altezza trappola di 0,7 micron. </li><li> Nel software microfluidica, celle di carico dal bocchettone 8 a 4 psi per 15 sec. Controllare la densità delle cellule nella camera di coltura spostando la fase attraverso la finestra di imaging. Se non spore sono stati intrappolati, ripetere la fase di caricamento delle cellule oppure aumentare la pressione e / o il tempo di caricamento fino a raggiungere la densità cellulare desiderato (1-10 spore per finestra di imaging con 2.048 x 2.048 pixel). Evitare di sovraccaricare la camera di cultura. Nota: normalmente si usa dimensioni trappola 5 per l&#39;imaging Streptomyces, ma abbiamo anche ottenuto buoni risultati con la trappola grandezze 4 e 3. Consultare il manuale del fornitore per ulteriori suggerimenti su come ottimizzare il processo di caricamento delle cellule. </li><li> Avviare il programma di flusso nel software di controllo dal punto 2.5 e lasciare che la piastra microfluidica per riscaldare-stabilizzi per 1 ora in fase di microscopio prima di avviare l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. </li><li> Nel software di controllo del microscopio, impostare una acquisizione multi-dimensionale di prendere muimmagini ltiple a più posizioni di scena nel corso del tempo: <ol><li> Per Salvataggio automatico: specificare la directory per il salvataggio automatico dei file di immagine. </li><li> Per le impostazioni di illuminazione, determinare le impostazioni di illuminazione ottimali per ogni costrutto specifica in anticipo. Per l&#39;esperimento descritto, utilizzare i seguenti tempi di esposizione: DIC 150 msec, YFP 250 msec, RFP 100 msec. </li><li> Per Time-series: impostare una serie di tempo per acquisire le immagini in corrispondenza dei punti di tempo desiderato in sequenza. Per l&#39;imaging del ciclo di vita di S. venezuelae, selezionare un intervallo di tempo di 40 minuti per un periodo di 24 ore. </li><li> Per le posizioni di scena e messa a fuoco automatica: scansione della camera di cultura spostando le posizioni palco e palco negozio per ogni posizione di imaging di interesse. Assicurarsi che le singole posizioni stadio si trovano sufficientemente a parte per ridurre al minimo photobleaching e phototoxicity.Typically utilizzano fino a 12 posizioni. routine di messa a fuoco automatica Eseguire per ogni punto di tempo per correggere la deriva focale lento. Se disponibile nel software di controllo del microscopio, La strategia messa a fuoco automatica è impostato su &quot;aggiornamento superficie locale messa a fuoco automatica dell&#39;hardware&quot;. Una volta che le Z-coordinate delle posizioni stadio selezionato sono verificate, attivare la messa a fuoco automatica dell&#39;hardware. </li></ol></li><li> Avviare l&#39;esperimento time-lapse nel software di controllo del microscopio. </li><li> Verificare che tutte le posizioni di scena sono ancora a fuoco nei punti successivi. Per gli esperimenti time-lapse in esecuzione su diverse ore, occasionalmente osserviamo una deriva palco anche quando si utilizza l&#39;autofocus. Se le posizioni fase devono essere riorientato, interrompere l&#39;esperimento in un punto momento opportuno, regolare il fuoco e riavviare l&#39;esperimento entro l&#39;intervallo di tempo di imaging definito (punto 3.7.3). Vedere il punto 4.3 per come concatenare le serie storiche. </li><li> Smettere di acquisizione delle immagini dopo 24-30 ore o quando le ife nella regione di interesse sono differenziate in spore (vedi DIC serie di immagini). Fermare il programma di flusso nel software e smontare il dispositivo a microfluidi. </li><li> Preparare piatto microfluidica utilizzato per sto a breve terminerabbia. Rimuovere restante MYM-TE e ha trascorso MYM-TE da ben 1 a 6, ben rifiuti vuoto 7 e il caricamento delle cellule ben 8. In condizioni sterili, ri-riempire pozzi di corsia &quot;A&quot; e pozzi di piste non utilizzati ( &quot;B&quot; utilizzato per &quot;D&quot;) sulla piastra con sterile tampone fosfato (PBS). Sigillare la piastra con parafilm per evitare che si secchi e conservare a 4 ° C. </li></ol> 4. Generazione di Time-lapse film usando Fiji Software Nota: Prendiamo atto che diversi pacchetti software commerciali e di connessione sono a disposizione per elaborare le immagini di microscopia time-lapse compreso ZenBlue, Metamorph, ICY, ImagePro o ImageJ. Qui ci concentriamo su Fiji, che è un programma di elaborazione delle immagini open-source basata su ImageJ, e che già fornisce una serie di utili plug-in preinstallati. <ol><li> dati di imaging trasferimento dal vostro esperimento time-lapse a un computer che ha installato Fiji. </li><li> Avviare il programma e importare il file di immagini utilizzando &amp;# 34; File&gt; Importa&gt; Bio-formati &quot;. O semplicemente trascinando il file di immagini in Fiji In&quot;-Formati Bio opzioni di importazione &quot;, spuntare la casella&quot; canali Split &quot;per ottenere una pila di un&#39;immagine separata per ogni canale illuminazione (DIC , RFP, YFP). </li><li> Opzionale: Per unire serie temporale separata risultante da una pausa nel nella acquisizione delle immagini a causa della rifocalizzazione (passo 3.9), aprire rispettive pile di immagini ed eseguire &quot;Immagine&gt; Stack&gt; Strumenti&gt; concatenare&quot; per ciascun canale (DIC, RFP, YFP ). </li><li> Valutare la qualità dei dati time-lapse scorrendo le pile di immagini. Cercare ife che rimase a fuoco nel corso del tempo, spettacolo crescita del micelio e, infine, formare spore (DIC stack). Esaminare la localizzazione subcellulare prevista per DivIVA-mCherry a punte ifali (stack RFP) e FtsZ-YPet formando anelli singoli o multipli, strutture scala simili a vegetativa o sporigeni ife (stack YFP), rispettivamente. </li><li> Isolare una regione di interesse per i Processi a valleng delle immagini. Time-lapse microscopia spesso produce file di grandi dimensioni, che possono rallentare l&#39;elaborazione da parte Fiji. Si raccomanda pertanto di identificare e isolare una regione di interesse (ROI) e per eseguire ulteriori fasi di elaborazione dell&#39;immagine in questa versione più piccola della serie di immagini. <ol><li> Selezionare lo strumento &quot;rettangolare Selezione&quot; nel menu e disegnare una ROI rettangolare nella serie di immagini DIC in modo tale che le ife sviluppo sono racchiusi dalla ROI tutta la serie di immagini. </li><li> Duplicate ROI-stack con &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li> Fare clic sulla barra nome della pila di immagini YFP e selezionare &quot;Modifica&gt; Selezione&gt; Ripristina Selezione&quot; nel menu per ripristinare la precedente selezione rettangolare dall&#39;originale DIC impilare allo stesso positon nello stack YFP e duplicare il ROI con &quot;Ctrl&quot; + &quot;shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li> Ripetere questo processo per lo stack RFP. </li></ol></li><li> Allineare le immagini nell&#39;immagine tre pile to rimuovere le derive di scena nel piano xy nel corso del tempo. Scorrere fino all&#39;ultimo fotogramma nella pila DIC e selezionare &quot;Plugin&gt; Registrazione&gt; StackReg&gt; RigedBody&quot; dal menu. Ripetere questo passaggio per la richiesta di offerta e la serie di immagini YFP. Se necessario, ritagliare il ROI ripetendo il passaggio 4.5.1-4.5.3. </li><li> Optional: Regolare la luminosità e il contrasto manualmente per ogni pila di immagini con il &quot;regolare luminosità e contrasto Tool&quot; ( &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;C&quot;), oppure selezionare &quot;Processo&gt; Migliora contrasto&quot; dal menu e applicare il &quot;normalizzare&quot; comando per tutte le immagini nella pila. Va osservato che quest&#39;ultimo comando alterare i valori di pixel e può quindi influenzare analisi dell&#39;immagine valle. </li><li> Opzionale: Combinare le singole pile (convertiti nel formato di file RGB, vedi 4.11) orizzontalmente o verticalmente utilizzando il plug-in &quot;Immagine&gt; Stack&gt; Strumenti&gt; Combine&quot;. </li><li> Aggiungere una barra di scala ( &quot;Analizza&gt; Strumenti&gt; Scala Bar&quot;) e una matrice di tempo (&amp;# 34; immagine&gt; Stack&gt; Tempo Stamper &quot;). </li><li> Salva pile di immagine modificati come una sequenza di immagini nel formato &quot;.tiff&quot;. Per produrre un film, salva come &quot;.avi&quot;. In alternativa, serie di immagini di esportazione in formato QuickTime con il &quot;Bio-Formati&gt; Bio-Formati Exporter&quot; plug-in e selezionare il tipo di file &quot;.mov&quot;. </li><li> Per ottenere immagini da singoli fotogrammi, selezionare il frame di interesse e duplicare l&#39;immagine &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. Cambiare il tipo di immagine risultante in &quot;RGB&quot; o &quot;8-bit&quot; sotto &quot;Immagine&gt; Tipo&gt; colore RGB o 8-bit&quot; e salvare l&#39;immagine come &quot;.tiff&quot;. Nota: Fiji offre una serie di funzioni aggiuntive per annotare ulteriormente o serie processo di time-lapse. Vai a supporto online Fiji per informazioni dettagliate (http://fiji.sc/Fiji). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Time-lapse microscopia del ciclo di vita Streptomyces è tecnicamente impegnativo in passato. Qui vi presentiamo un protocollo robusto per eseguire l&#39;imaging dal vivo di cellule del ciclo di vita completo utilizzando fusioni proteina fluorescente al marcatore DivIVA polarità delle cellule e la proteina divisione cellulare FtsZ per aiutare a visualizzare e tracciare la progressione attraverso il programma di sviluppo (Figura 2). Al centro di questo metodo è la coltivazione di S. venezuelae in un dispositivo a microfluidi che permette costante perfusione media e lo scambio di normale mezzo di crescita (MYM-TE) con il mezzo trascorso (speso MYM-TE). Il cambio di condizione di cultura è importante per il protocollo descritto perché la scalata nutrizionale come pozzi come eventuali segnali extracellulari ancora non identificati (ad esempio il quorum sensing segnali) nel terreno di coltura speso, promuovere la sporulazione, mentre una fornitura continua di media ricchi di nutrienti stimola growt vegetativoh con quasi nessuna formazione di spore (dati non riportati). Così, coltura di cellule in questo sistema microfluidico è superiore alla coltura di cellule in agarosio in quanto offre la flessibilità più sperimentali e consente il monitoraggio a lungo termine delle variazioni di crescita batterica in risposta alle mutevoli condizioni di coltura. Sebbene le piastre microfluidica sono progettati per uso singolo, flusso canali che non sono stati inoculati con cellule possono essere utilizzati in esperimenti successivi. Si consiglia di utilizzare tutti i canali di una piastra microfluidica entro una settimana, come abbiamo sperimentato problemi di tenuta del collettore di piatti che sono stati aperti per tempi più lunghi. Quando si imposta un esperimento, abbiamo scoperto che le spore preparate al momento germinati entro due ore di essere caricati nella camera di flusso, mentre le spore provenienti da uno stock di glicerolo congelato necessari almeno 6 ore prima di tubi germinali sono emersi (dati non riportati). Questo ritardo nella germinazione estende la durata dell&#39;esperimento e può interferire condisponibilità di attrezzature e condizioni sperimentali. E &#39;anche importante iniziare l&#39;esperimento con perfusione di MYM-TE per almeno 3 ore per fornire nutrienti sufficienti per lo sviluppo e la conseguenza di tubi germinali. Perfusione con MYM-TE può essere esteso al di là della iniziale di 3 ore se l&#39;esperimento è stato progettato per studiare la crescita vegetativa. Mentre spore forniscono la scelta preferita di materiale di partenza, frammenti breve ifali possono essere caricati nella piastra microfluidica. Tuttavia, l&#39;efficienza di carico quando si utilizza micelio tosato è significativa più bassa e spesso richiede diversi percorsi di carico che possono presentare una limitazione in sede di esame mutanti non sporulanti. Indipendentemente dal tipo di inoculo utilizzato, è importante non sovraccaricare la camera di coltura con spore o frammenti ifali come questa di una rapida sovraffollamento che possono interferire con la diffusione multimediale e complicare analisi dell&#39;immagine. È importante pianificare la costruzione di proteine ​​reporter carefully per l&#39;uso della fluorescenza time-lapse imaging in Streptomyces. Lunghezza Linker tra la proteina bersaglio e il reporter fluorescente e la scelta di N- o fusioni C-terminale può essere critico. Inoltre, le condizioni sperimentali ottimali, tra cui la frequenza delle immagini e il tempo di esposizione, devono essere determinati in anticipo per ogni proteina fluorescente-tag. S. venezuelae ife mostra auto-fluorescenza nel verde dei canali / giallo che può diventare problematico quando l&#39;imaging una proteina fluorescente che si esprime a livelli bassi. Inoltre, si deve notare che, durante la germinazione e la fase di crescita vegetativa iniziale, S. venezuelae è particolarmente sensibile alla luce a breve lunghezza d&#39;onda (ad esempio quando si utilizza fusioni di proteine ​​per PCP). Nonostante i continui progressi nelle tecniche di imaging e di sistemi reporter fluorescente per l&#39;imaging dal vivo di cellule di batteri, la maggior parte dei pacchetti software (ad esempio MicrobeTracker, Schnitzelcells, CellProfiler) per un successivo trattamento automatizzato di questi tipi di insiemi di dati non supportano l&#39;analisi di immagini derivate da batteri filamentosi con uno stile di vita pluricellulare 27-29. Pertanto, vi è la necessità di sviluppare un algoritmo adatto per l&#39;analisi quantitativa ad alta produttività dei dati di imaging di Streptomyces e altri batteri filamentosi. In sintesi, il lavoro descritto qui dimostra l&#39;immenso potenziale di S. venezuelae come un nuovo sistema di sviluppo di modello per il genere, a causa della sua capacità di sporulare in liquido. Il dispositivo di coltura microfluidica è semplice da usare anche per gli utenti meno esperti. Esso fornisce una piattaforma eccellente per studiare i processi biologici cellulari centrali al ciclo di vita Streptomyces, tra cui localizzazione dinamica delle proteine, la crescita polarizzata, e la differenziazione morfologica di un micelio multicellulare in catene di spore unigenomic. Inoltre questo sperimentale u setp fornisce anche un punto di partenza allettante per indagare gli eventi nello sviluppo che richiedono alternano condizioni di coltura, o l&#39;uso di coloranti fluorescenti come acidi fluorescenti D -ammino per monitorare sintesi del peptidoglicano o ioduro di propidio e 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per visualizzare l&#39;organizzazione dei cromosomi 30,31.

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Mark Buttner
to:
Mark J. Buttner

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The middle initial J. has been added to author Mark Buttner.

Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomycetes sono batteri che vivono nel suolo che sono caratterizzati da un ciclo di sviluppo complesso che coinvolge la differenziazione morfologica da un multicellulare, nutriente-lavaggio micelio di dormienti, spore unigenomic 1-3. In condizioni di crescita favorevoli, una spora tipici Streptomyces comincia a germinare estrudendo uno o due tubi germinali (Figura 1). Questi tubi allungare per estensione punta e crescono in una rete ramificata ifale conosciuto come il micelio vegetativo. la crescita polare e ifale ramificazione è diretto dal DivIVA essenziale delle proteine. Questa proteina coiled-coil è parte di un grande complesso citoplasmatico chiamato polarisome, che è cruciale per l&#39;inserimento di nuovo materiale dell&#39;involucro cellulare sulla punta estendentesi 4-7. Durante la crescita vegetativa, i filamenti ifali diventano compartimentato dalla formazione infrequente dei cosiddetti trasversali pareti 8. La formazione di queste pareti trasversali ri<html> quaderni FtsZ, la tubulina, come le proteine ​​del citoscheletro che è essenziale per la divisione cellulare nella maggior parte dei batteri 9. In Streptomyces, tuttavia, questi vegetative trasversali pareti non portano ad costrizione e cellula-cellula separazione e quindi la massa miceliari rimane come una rete di compartimenti sinciziale interconnessi. In risposta alla limitazione di nutrienti e altri segnali che non sono ben compresi, ife aerea specializzata staccarsi dal micelio vegetativo e crescere in aria 3. La costruzione di queste strutture avvia la fase riproduttiva dello sviluppo, durante la quale il lungo ife aeree multi-genomica diventare diviso in decine di uguali dimensioni compartimenti prespore unigenomic. Questo massiccio evento divisione cellulare è guidato dalla costrizione sincrono di anelli multipli FtsZ all&#39;interno singolo 2,10 ife sporigeni. differenziazione morfologica si completa con il rilascio di dormienti, spore, pigmentate spesse pareti. t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig1.jpg" /> Figura 1:. Il ciclo di vita Streptomyces su supporti solidi Questo è un modello del ciclo di vita basata su studi classici di S. coelicolor crescita su piastre di agar. Lo sviluppo cellulare di una spora inizia con la formazione di uno o due tubi germinali, che crescono per estensione punta per formare una rete di ramificazione ife. la crescita polare e la ramificazione delle ife vegetativo è diretto da DivIVA (rosso). La formazione di vegetative incrociati pareti richiede FtsZ (verde). In risposta alle limitazioni di nutrienti e altri segnali, ife aeree sono erette. Arresto della crescita aerea è strettamente coordinato con il montaggio di una scala di FtsZ-ring, che danno luogo alla setti sporulazione che compartimenti stagni le ife sporigeni in compartimenti prespore scatolari. Questi comparti assemblare un muro di spore di spessore e sono alla fine Released spore pigmentate come maturi. I principali eventi di sviluppo del ciclo di vita Streptomyces sono ben caratterizzati 1,3. Tuttavia, ciò che è ancora scarse sono studi sulle cellule biologiche che utilizzano la fluorescenza time-lapse microscopia a fornire una conoscenza dei processi alla base subcellulari differenziazione, come ad esempio le dinamiche di localizzazione della proteina, il movimento dei cromosomi e la divisione cellulare evolutivamente controllata. Live-cell imaging di sviluppo Streptomyces è difficile a causa della complessità del ciclo di vita e le caratteristiche fisiologiche dell&#39;organismo. Precedenti studi sulla crescita vegetativa e le fasi iniziali di sporulazione septation hanno impiegato camere di imaging ossigeno-permeabile, o la crescita agarosio supportata di Streptomyces coelicolor su un palco microscopio 11-15. Questi metodi, tuttavia, sono limitati da una serie di fattori. Alcuni sistemi consentono solo di imaging a breve termine di una crescita cellulareproteine ​​fluorescenti D Prima cellule soffrono di apporto di ossigeno insufficiente o crescere fuori del piano focale dovuta al modello tridimensionale di sviluppo ifale. Nei casi in cui l&#39;imaging a lungo termine è possibile, coltivando le cellule sui rilievi agarosio limiti di flessibilità sperimentale perché le cellule non possono essere esposti a condizioni di crescita o di stress alternativi, e la fluorescenza di fondo dalla media delle pastiglie agarosio limita fortemente la possibilità di monitorare a fluorescenza più debole segnali. Qui si descrive un protocollo per live-cell imaging del ciclo di vita completo Streptomyces con ottima precisione e sensibilità. Con crescente Streptomyces in un dispositivo microfluidica collegato ad un microscopio a fluorescenza widefield (figura 2), siamo ora in grado di monitorare la germinazione, crescita vegetativa e la sporulazione septation per un periodo di tempo fino a 30 ore. Questo è notevolmente facilitata dall&#39;utilizzo dei nuovi Streptomyces organismo modello </em&gt; venezuelae perché sporulates al di completamento nella cultura sommersa e quindi supera la limitazione della specie modello classico S. coelicolor, che sporulates solo su terreni solidi 16-20. Per aiutare a visualizzare la crescita vegetativa e la sporulazione, abbiamo co-Express fluorescente tagged versioni del marcatore DivIVA polarità cellulare e la chiave di proteine ​​divisione cellulare FtsZ. Stiamo utilizzando un dispositivo di microfluidica disponibile in commercio che è stato impiegato con successo per micobatteri, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis e lievito 21-25. Il sistema intrappola cellule in un unico piano focale e permette il controllo di perfusione continua di terreno di coltura da diversi serbatoi. Nel protocollo dettagliato approfittiamo di questa funzione per esporre S. venezuelae micelio vegetativo ad una scalata nutrizionale per promuovere la sporulazione. Il protocollo deScribed è per l&#39;imaging dal vivo di cellule di tutto il ciclo di vita Streptomyces, ma le condizioni di media alternativi o le impostazioni del microscopio può essere scelto se specifici stadi di sviluppo sono di particolare interesse. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig2.jpg" /> Figura 2: Schema che descrive il flusso di lavoro sperimentale. Vengono visualizzati i tre passaggi principali descritti nel protocollo. Innanzitutto, spore e mezzo trascorso sono preparati da una cultura fase stazionaria. In secondo luogo, le spore freschi vengono caricati in un sistema di microfluidica e S. venezuelae viene esposta in tutto il suo ciclo di vita di sviluppo utilizzando un microscopio invertito completamente automatica con camera di incubazione a mantenere una temperatura di crescita ottimale. In terzo luogo, la serie di time-lapse ottenuto viene analizzato ed elaborati utilizzando il software open-source Fiji.

<table><tbody><tr><td>B04A CellAsic Piastra ONIX per cellule batteriche</td><td>Merck-Millipore</td><td>B04A-03-5PK</td><td>Piastre per colture microfluidiche</td></tr><tr><td>CellAsic ONIX Sistema di perfusione microfluidica e ONIX FG (versione 5.0.2)</td><td>Merck-Millipore</td><td>EV-262</td><td>L'ultima versione ONIX (luglio 2015) e le istruzioni su come utilizzare il programma sono disponibili qui: http://www.merckmillipore.com</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Microscopio a campo largo invertito completamente automatizzato e motorizzato</td></tr><tr><td>Incubatore XL multi S1 con modulo di temperatura S1 e unità di riscaldamento XL S2</td><td>Zeiss</td><td>411857-9061-000</td><td>Camera climatica che circonda il microscopio</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 100x/1.46 Obiettivo DIC a olio</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>Ocra FLASH 4 V2</td><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore HXP 120V</td><td>Zeiss</td><td>423013-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Set di filtri FL 46 HE YFP senza spostamento</td><td>Zeiss</td><td>489046-9901-000</td><td>Set di filtri fluorescenti, eccitazione 500/25 nm, emissione 535/30 nm</td></tr><tr><td>Set di filtri FL 63 HE RFP senza spostamento</td><td>Zeiss</td><td>489063-0000-000</td><td>Set di filtri fluorescenti, eccitazione 572/25 nm, emissione 629/30 nm</td></tr><tr><td>Telaio di montaggio K-M per multipozzetto </td><td>Zeiss</td><td>000000-1272-644</td><td>Supporto per tavolino per piastra microfluidica</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012</td><td>Zeiss</td><td>410135-1002-120</td><td>Software di controllo del microscopio</td></tr> Modulo <tr><td>ZEN Time Lapse</td><td>Zeiss</td><td>410136-1031-110</td><td>Modulo software per impostare esperimenti di microscopia time-lapse</td></tr> Modulo <tr><td>ZEN Piastrelle/Posizioni</td><td>Zeiss</td><td>410136-1025-110</td><td>Modulo software per salvare posizioni specifiche dello stadio (xzy)</td></tr><tr><td>Pacchetto software open source</td> <td>Fiji</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td>Generazione di filmati time-lapse</td></tr><tr><td>Estratto di malto di lievito-estratto di lievito (MYM) 4 g di maltosio 4 g di estratto di lievito 10 g di estratto di malto aggiungere 1 L di H2O utilizzando il 50% di acqua di rubinetto e il 50% di acqua di osmosi inversa e integrare con 200 ml di soluzione di oligoelementi R2 per 100 ml dopo la sterilizzazione in autoclave</td><td></td><td></td><td>Terreno di sporulazione utilizzato per la coltura S. venezuelae SV60</td></tr><tr><td>R2 Soluzione di oligoelementi (TE) 8 mg ZnCl2 40 mg FeCl3-6H2O 2 mg CuCl2-2H2O 2 mg MnCl2-4H2O 2 mg Na2B4O7-10H2O 2 mg ( NH4)6Mo7O24-4H2O aggiungere 200 ml di H2O Autoclave e conservare a 4 oC</td><td></td><td></td><td>Aggiungere 0,002 volumi a MYM</td></tr><tr><td>PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>Utilizzato per riempire i pozzetti di ingresso delle corsie inutilizzate nelle piastre B04A al fine di preparare le piastre per lo stoccaggio a breve termine.</td></tr><tr><td>0,22 &micro; m filtri per siringhe</td><td>Satorius stedim</td><td>16532-K</td> Preparazione del ceppo <td>esaurito MYM-TE</td></tr><tr><td>SV60</td><td>John Innes Centre collection</td><td></td> <td>S. venezuelae ceppo che esprime divIVA-mcherry e ftsZ-ypet</td></tr></tbody></table>

fluorescenza time-lapse imaging del complete<em&gt; s. venezuelae</em&gt; ciclo di vita uso di un dispositivo a microfluidi

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

L'imaging dei processi biologici a livello di singola cellula è stato determinante per la nostra attuale comprensione dell'organizzazione subcellulare delle cellule batteriche. Tuttavia, l'applicazione della microscopia time-lapse per studiare i processi biologici cellulari alla base dello sviluppo dei batteri filamentosi sporulanti Streptomyces è stata ostacolata da difficoltà tecniche. 
Qui presentiamo un protocollo per superare queste limitazioni coltivando la nuova specie modello, Streptomyces venezuelae, in un dispositivo microfluidico disponibile in commercio che è collegato a un microscopio a campo largo a fluorescenza invertita. A differenza delle specie modello classiche, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporula in liquido, consentendo l'applicazione di camere di crescita microfluidiche per coltivare e monitorare microscopicamente lo sviluppo cellulare e la differenziazione di S. venezuelae per lunghi periodi di tempo. Oltre a monitorare i cambiamenti morfologici, la distribuzione spazio-temporale delle proteine bersaglio marcate in fluorescenza può anche essere visualizzata mediante microscopia time-lapse. Inoltre, la piattaforma microfluidica offre la flessibilità sperimentale per scambiare il terreno di coltura, che viene utilizzato nel protocollo dettagliato per stimolare la sporulazione di S. venezuelae nella camera microfluidica. Le immagini dell'intero ciclo di vita di S. venezuelae vengono acquisite a intervalli specifici ed elaborate nel software open-source Fiji per produrre filmati delle serie temporali registrate.

Il live-cell imaging di successo di tutta la S. venezuelae ciclo di vita produce una serie temporale continuo, compresa la chiave fasi di sviluppo di germinazione, crescita vegetativa e sporulazione (Figura 3, Film 1). Visualizzazione della progressione attraverso il ciclo di vita viene ulteriormente rafforzata dalla localizzazione subcellulare distinto di DivIVA-mCherry e FtsZ-YPet. Durante la germinazione e la crescita vegetativa, DivIVA-mCherry accumula esclusivamente alle punte ifali crescita o marchi di nuova formazione punti di diramazione (Figura 4A). Questi risultati sono in linea con il posizionamento subcellulare precedentemente riportato di DivIVA 12,26. Al contrario, FtsZ-YPet forma singole strutture ad anello simile a intervalli irregolari nel crescente micelio (Figura 4B). Queste strutture forniscono l&#39;impalcatura per la sintesi di non costrittiva vegetative incrociati pareti, portando alla formazione di interconnette scomparti ifali 8. La differenziazione cellulare di crescere ife in ife sporigeni diventa visibile dalla scomparsa polare foci DivIVA-mCherry, l&#39;arresto della crescita polare e l&#39;aumento concomitante di FtsZ-YPet fluorescenza (Figura 4C). In sporulanti ife, il modello di localizzazione di FtsZ-YPet cambia radicalmente; primi elicoidale filamenti FtsZ-YPet cadere lungo la ifa e poi, in un improvviso evento, quasi sincrono, queste eliche si fondono in una scala di anelli FtsZ-YPet intervalli regolari. Nelle condizioni sperimentali qui descritte, queste scale FtsZ-YPet uniformemente distribuiti persistono per circa 2 ore. Infine, la sporulazione setti diventare visibile nelle contrasto interferenziale differenziale (DIC) immagini (Figura 4D) e, infine, le nuove spore vengono rilasciati. Il successivo protocollo che descrive l&#39;elaborazione delle immagini utilizzando il software Fiji fornisce come<html> TEP-by-step spiegazione di come produrre un film per la pubblicazione della serie time-lapse acquisita (Film 1). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig3.jpg" /> Figura 3: Istantanee da un rappresentante di fluorescenza time-lapse serie di microscopia di S. venezuelae producendo fluorescente FtsZ (verde) e DivIVA (rosso) sono riportati fotogrammi selezionati delle immagini fuse (pannello superiore: RFP-YFP-DIC, pannello inferiore: DIC). visualizzazione del ciclo di vita Streptomyces tra cui la germinazione, crescita vegetativa e la sporulazione. Le immagini sono state prese da film 1. Il tempo è in h: min. Scala bar = 5 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> d / 53863 / 53863fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4: Risultati rappresentativi per una serie time-lapse con successo il ciclo di vita Streptomyces (A) Localizzazione di DivIVA-mCherry.. vengono riportati istantanee di due successivi punti temporali da Film 1 con immagini unite della richiesta di offerta e canali DIC. DivIVA-mCherry segna nuovi siti filiali ifale (testa freccia piena) e localizza sulla punta ifale per dirigere la crescita polare (aperto punta di freccia). Barra di scala = 10 micron (B) FtsZ-YPet localizzazione durante la crescita vegetativa (punta di freccia). FtsZ-YPet forma strutture ad anello-come singoli (pannello superiore) che non restringono (DIC, pannello inferiore). (C) FtsZ-YPet (verde) di localizzazione durante la sporulazione septation. foci DivIVA-mCherry sono mostrati in rosso, con il tempo trascorso illustrato di seguito (h: min). barra della scala: 5 micron. (D) corrispondenti immagini DIC della ife sporulanti da (C) che mostra la formazione di compartimenti prespore con setti sporulazione visibile (immagine a sinistra), che alla fine maturano in una catena di spore (immagine a destra). Il tempo è in h: min. Scala bar = 5 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Frame da Film 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863mov1.jpg" /> Film 1: Time-lapse serie microscopia a fluorescenza delle Streptomyces venezuelae ciclo di vita Il film è composto da immagini unite RFP-YFP (a sinistra) e le immagini corrispondenti contrasto interferenziale differenziale (DIC) (a destra).. DivIVA-mCherry è mostrato in rosso e FtsZ-YPet in verde. L&#39;intervallo di tempo tra singoli fotogrammi è di 40 min. Barra di scala = 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/movie1.mov" target="_blank">Cliccate qui per vedere Thi</a>s film.

Gli streptomici sono caratterizzati da un ciclo di vita complesso che è stato difficile da studiare sperimentalmente con mezzi biologici cellulari. Qui presentiamo un protocollo per eseguire la microscopia time-lapse a fluorescenza dell'intero ciclo di vita coltivando Streptomyces venezuelae in un dispositivo microfluidico.

Fluorescenza Time-lapse imaging del Complete<em&gt; S. venezuelae</em&gt; Ciclo di vita Uso di un dispositivo a microfluidi

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di microscopia a fluorescenza con acquisizione temporale è fornire un metodo per lo studio dei processi cellulari biologici alla base dello sviluppo e della differenziazione cellulare nel batterio filamentoso sporigeno, Streptomyces venezuelae. Il metodo descritto offre una piattaforma eccellente per studiare i processi di biologia cellulare centrali al ciclo vitale di Streptomyces, inclusi il reclutamento dinamico delle proteine, la crescita polarizzata e la formazione dei setti di sporulazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che Streptomyces venezuelae sporula in ambiente liquido, permettendoci di coltivare le cellule in un dispositivo microfluidico e di monitorare microscopicamente l'intero ciclo vitale.Questo metodo dimostra il grande potenziale di Streptomyces venezuelae come nuovo sistema di sviluppo per il genere, poiché consente l'analisi in tempo reale della differenziazione di un micelio multinucleato in catene di spore. Per iniziare, inoculare 30 millilitri di mezzo di crescita supplementato con 10 microlitri di spore della ceppa di S. venezuelae da analizzare. Per una crescita e una sporulazione costanti delle cellule, utilizzare un matraccio con baffle o un matraccio contenente una molla che permetta un'adeguata aerazione.Coltivare le cellule per 35-40 ore a 30 gradi Celsius e 250 giri al minuto. Al termine, dovrebbe essere possibile osservare i frammenti miceliali e le spore mediante microscopia a contrasto di fase con campione in sospensione liquida. Centrifugare un millilitro della coltura in una centrifuga da banco a 400 × g per un minuto per ottenere un pellet di micelio e dei frammenti cellulari più grandi.Quindi trasferire circa 300 microlitri del soprannatante contenente una sospensione di spore in un nuovo tubo da 1,5 millimetri e posizionare il tubo sul ghiaccio. Conservare il mezzo di coltura rimanente per un utilizzo successivo. Successivamente, diluire le spore di uno a 20 in mezzo di crescita supplementato e mantenere le spore diluite sul ghiaccio fino al momento dell'uso.Versare il mezzo di coltura rimanente in un becher da 50 millilitri, quindi aspirare 10 millilitri con una siringa e utilizzare un filtro sterile per siringa da 22 micrometri per sterilizzare per filtrazione il mezzo di coltura rimanente. Per ottenere un mezzo di crescita supplementato usato privo di spore e frammenti miceliali. Conservare il mezzo di crescita supplementato usato filtrato per alcuni giorni a quattro gradi Celsius se devono essere eseguiti ulteriori esperimenti utilizzando condizioni di crescita simili.Ogni piastra microfluidica può essere utilizzata per un massimo di quattro esperimenti indipendenti. Per evitare la contaminazione delle camere di flusso non utilizzate, assicurarsi di utilizzare soluzioni e condizioni di lavoro sterili durante l'allestimento dell'esperimento. Iniziare rimuovendo la soluzione di trasporto dalla piastra microfluidica.Quindi risciacquare le pozzette con mezzo di crescita supplementato sterile. Dopo il risciacquo, aggiungere 300 microlitri di mezzo di crescita supplementato all'ingresso della pozzetta uno e 300 microlitri di mezzo di crescita supplementato usato nelle pozzette due fino a sei. Successivamente, caricare 40 microlitri delle spore diluite nella pozzetta otto della fila A e sigillare il collettore alla piastra seguendo le istruzioni del produttore.Avviare il software di controllo della microfluidica e selezionare il tipo di piastra appropriato. Impostare un programma di flusso per far passare il mezzo dalle pozzette di ingresso dalla prima alla quinta a sei psi per due minuti per ogni pozzetta, al fine di preparare il canale di flusso e la camera di coltura. Successivamente, far fluire il mezzo di crescita supplementato a sei psi nella pozzetta di ingresso uno per sei ore.Questo permetterà la germinazione e la crescita vegetativa. Impostare il programma affinché passi dopo sei ore al mezzo di crescita supplementato usato, inviandolo nei pozzetti da due a cinque a sei psi per il resto dell'esperimento. Riscaldare in anticipo la camera ambientale a 30 gradi Celsius.Quindi accendere il microscopio e il relativo software di controllo. Posizionare un obiettivo ad immersione in olio con elevata apertura numerica e verificare che i filtri appropriati e gli specchi diagrammatici siano impostati per acquisire immagini in contrasto di interferenza differenziale, insieme alle immagini delle fusioni proteiche fluorescenti gialle e rosse. Applicare una goccia di olio per immersione sull'obiettivo e anche sul fondo della finestra di acquisizione presente nella piastra microfluidica.Montare con attenzione il dispositivo microfluidico sigillato sulla piastra del microscopio invertito e fissarlo saldamente. Utilizzare i marcatori di posizione integrati per mettere a fuoco la finestra di acquisizione dell'immagine della camera di coltura microfluidica. Mettere a fuoco sulla parte più a sinistra della prima camera di flusso contrassegnata con A, quindi spostare la piastra fino alla dimensione della trappola numero cinque, corrispondente all'altezza della trappola di 7 micrometri.Nel software microfluidico, impostare il sistema per caricare le cellule dal pozzetto di ingresso otto a quattro psi per 15 secondi. Dopo l'esecuzione del processo, verificare la densità cellulare nella camera di coltura spostando la piastra attraverso la finestra di imaging. Se non sono state intrappolate spore, ripetere il passaggio di caricamento delle cellule oppure aumentare la pressione e/o il tempo di caricamento fino al raggiungimento della densità cellulare desiderata, pari a una-dieci spore per finestra di imaging.Si presti attenzione a non sovraccaricare la camera di coltura. Successivamente, avviare nel software di controllo il programma di flusso precedentemente preparato e lasciare che la piastra microfluidica raggiunga l'equilibrio termico per un'ora sulla stage del microscopio prima di iniziare l'acquisizione delle immagini. Nel software di controllo del microscopio, impostare un'acquisizione multidimensionale per eseguire più immagini in diverse posizioni della stage nel tempo, specificando innanzitutto una directory per il salvataggio automatico dei file immagine.Successivamente, accedere alle impostazioni di illuminazione e inserire le impostazioni ottimali predeterminate per ciascun costrutto specifico. Impostare quindi una serie temporale per acquisire immagini ogni 40 minuti per un periodo di 24 ore. Per determinare le posizioni della piastra e impostare l'autofocus, scansionare la camera di coltura e memorizzare le posizioni della piastra per ciascuna posizione di interesse da immagineggiare.Assicurarsi che le posizioni del palco a singolo stadio siano posizionate a una distanza sufficiente per ridurre al minimo lo sbiancamento della fluorescenza e la tossicità fotoindotta. Una volta verificate le coordinate Z delle posizioni del palco selezionate, attivare l'autofocus hardware. Quindi avviare l'esperimento in lapse temporale nel software di controllo del microscopio.Interrompere l'acquisizione delle immagini dopo 24-30 ore o quando le ife nella regione di interesse si sono differenziate in spore. Quindi arrestare il programma di flusso nel software e smontare il dispositivo microfluidico. Preparare la piastra microfluidica utilizzata per la conservazione a breve termine rimuovendo il mezzo residuo dai pozzetti di ingresso, dal pozzetto di scarto e dal pozzetto di caricamento delle cellule.Quindi riempire le pozzette utilizzate della corsia A e le pozzette delle corsie non utilizzate con PBS sterile. Infine, sigillare la piastra con pellicola trasparente per evitare che si secchi e conservare la piastra a quattro gradi Celsius.L'imaging in tempo reale di cellule vive dell'intero ciclo vitale di S.venezuela produce una serie temporale continua, che comprende le fasi chiave dello sviluppo quali germinazione, crescita vegetativa e sporulazione. Durante la germinazione o la crescita vegetativa, DivIVA-mCherry si accumula esclusivamente alle estremità apicali in crescita o marca i punti di nuova formazione di ramificazioni ifali. Al contrario, FtsZ-YPet forma singole strutture ad anello a intervalli irregolari nel micelio in crescita.Queste strutture forniscono un'impalcatura per la sintesi di setti vegetativi non costruttivi che portano alla formazione di compartimenti ifali interconnessi. Negli ifi sporogeni, il pattern di localizzazione di FtsZ-YPet cambia in modo drammatico. Inizialmente, i filamenti elicoidali di FtsZ-YPet si muovono lungo l'ifa, per poi, in un evento improvviso e quasi sincrono, aggregarsi in una serie regolare di anelli di FtsZ-YPet disposti a scala.Infine, i setti di sporulazione diventano distinguibili nelle immagini ottenute mediante contrasto di interferenza differenziale e, alla fine, le nuove spore vengono rilasciate. Questa tecnica fornisce un protocollo solido per eseguire l'analisi in tempo reale dell'intero ciclo vitale di Streptomyces. Il sistema microfluidico è facile da utilizzare.Offre flessibilità sperimentale e permette il monitoraggio a lungo termine di questi eventi. Questa configurazione speriment inflammabile costituisce anche un ottimo punto di partenza per studiare eventi specifici dello sviluppo in risposta a variazioni delle condizioni colturali o all'uso di coloranti fluorescenti per monitorare la sintesi del peptidoglicano o per visualizzare l'organizzazione del cromosoma.

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