Fluorescenza Time-lapse imaging del Complete S. venezuelae Ciclo di vita Uso di un dispositivo a microfluidi

L'obiettivo generale di questo protocollo di microscopia time-lapse fluorescente è quello di fornire un metodo per studiare i processi cellulari biologici che sono alla base dello sviluppo e della differenziazione cellulare nel batterio filamentoso sporulante, Streptomyces venezuelae. Il metodo describe fornisce un'eccellente piattaforma per studiare i processi biologici cellulari che sono fondamentali per il ciclo di vita di Streptomyces, tra cui la localizzazione dinamica delle proteine, la crescita polarizzata e la settazione della sporulazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che lo Streptomyces venezuelae sporula in un liquido, il che ci consente di far crescere le cellule in un dispositivo microfluidico e monitorare al microscopio l'intero ciclo di vita.

Questo metodo dimostra l'immenso potenziale di Streptomyces venezuelae come nuovo sistema di sviluppo per il genere, perché consente l'imaging su cellule vive della differenziazione di un micelio multicentrico in catene di spore. Per iniziare, inoculare 30 millilitri di terreno di coltura integrato con 10 microlitri di spore del ceppo S.venezuela da visualizzare. Per una crescita e una sporulazione costanti delle cellule, utilizzare un pallone deflettore o un pallone che contenga una molla per consentire un'aerazione sufficiente.

Coltivare le cellule per 35-40 ore a 30 gradi Celsius e 250 giri/min. Quando sei pronto, dovresti essere in grado di vedere i frammenti miceliali e le spore tramite microscopia a contrasto di fase montata su liquido. Centrifugare un millilitro di coltura in una centrifuga da tavolo a 400 volte G per un minuto per pellettare il micelio e i frammenti cellulari più grandi.

Quindi trasferire circa 300 microlitri del surnatante contenente una sospensione di spore, in un nuovo tubo da 1,5 millimetri e posizionare il tubo sul ghiaccio. Conservare il terreno di coltura rimanente per utilizzarlo in una fase successiva. Successivamente, diluire le spore da una a 20 in un terreno di coltura integrato e mantenere le spore diluite sul ghiaccio fino a quando non sono necessarie.

Versare il terreno di coltura rimanente in un becher da 50 millilitri, quindi aspirare 10 millilitri con una siringa e utilizzare un filtro per siringa sterile da 22 micrometri per filtrare e sterilizzare il terreno di coltura rimanente. Per ottenere un terreno di coltura integrato esaurito privo di spore e frammenti miceliali. Conservare il terreno di coltura filtrato e integrato per alcuni giorni a quattro gradi Celsius se si devono condurre ulteriori esperimenti, utilizzando condizioni di crescita simili.

Ogni piastra microfluidica può essere utilizzata per un massimo di quattro esperimenti indipendenti. Per evitare di contaminare le camere di flusso inutilizzate, assicurarsi di utilizzare soluzioni sterili e condizioni di lavoro durante l'impostazione dell'esperimento. Iniziare rimuovendo la soluzione di spedizione dalla piastra microfluidica.

Quindi sciacquare i pozzetti con terreno di coltura sterile integrato. Una volta risciacquato, aggiungere 300 microlitri del terreno di coltura integrato all'ingresso del pozzetto uno e 300 microlitri del terreno di coltura integrato esaurito ai pozzetti da due a sei. Successivamente, caricare 40 microlitri di spore diluite nel pozzetto otto della corsia A e sigillare il collettore alla piastra secondo le istruzioni del produttore.

Avviare il software di controllo della microfluidica e selezionare il tipo di piastra appropriato. Impostare un programma di flusso per far fluire il terreno dai pozzetti di ingresso da uno a cinque a sei psi per due minuti per pozzetto al fine di adescare il canale di flusso e la camera di coltura. Quindi farlo fluire con un mezzo di crescita integrato a sei psi nel pozzetto di ingresso uno per sei ore.

Ciò consentirà la germinazione e la crescita vegetativa. Dopo sei ore, il programma passa al terreno di coltura integrato esaurito e lo fa fluire nei pozzetti da due a cinque a sei psi per il resto dell'esperimento. Preriscaldare la camera climatica a 30 gradi Celsius in anticipo.

Quindi accendere il microscopio e il software di controllo del microscopio. Posizionare un obiettivo ad immersione in olio ad alta apertura numerica e verificare che siano presenti i filtri appropriati e gli specchi diagrammatici impostati per acquisire le immagini di contrasto interferenziale differenziale, insieme alle immagini delle fusioni proteiche fluorescenti gialle e rosse. Posizionare una goccia di olio da immersione nell'obiettivo e nella parte inferiore della finestra di imaging sulla piastra microfluidica.

Montare con cautela il dispositivo microfluidico sigillato sul tavolino del microscopio invertito e fissarlo in posizione. Utilizza gli indicatori di posizione incorporati per mettere a fuoco la finestra di imaging della camera di coltura microfluidica. Concentrati sulla parte più a sinistra della prima camera di flusso etichettata A, quindi sposta il tavolino sulla dimensione della trappola cinque, corrispondente all'altezza della trappola di 7 micrometri.

Nel software microfluidico, impostare il sistema per caricare le celle dal pozzo di ingresso otto a quattro psi per 15 secondi. Dopo aver eseguito il processo, controllare la densità cellulare nella camera di coltura spostando il tavolino attraverso la finestra di imaging. Se non sono state intrappolate spore, ripetere la fase di caricamento delle cellule o, in alternativa, aumentare la pressione e/o il tempo di caricamento fino a raggiungere la densità cellulare desiderata da una a 10 spore per finestra di imaging.

Fare attenzione a non sovraccaricare la camera di coltura. Quindi, avviare il programma di flusso precedentemente preparato nel software di controllo e lasciare che la piastra microfluidica si equilibri termicamente per un'ora nella fase del microscopio prima di iniziare l'acquisizione dell'immagine. Nel software di controllo del microscopio, impostare un'acquisizione multidimensionale per acquisire più immagini in più posizioni del tavolino nel tempo, specificando prima una directory per il salvataggio automatico dei file di immagine.

Successivamente, vai alle impostazioni di illuminazione e inserisci le impostazioni di illuminazione ottimali predeterminate per ogni costrutto specifico. Quindi imposta una serie temporale per acquisire immagini ogni 40 minuti per 24 ore. Per determinare le posizioni del tavolino e impostare l'autofocus, scansionare la camera di coltura e memorizzare le posizioni del tavolino per ogni posizione di imaging di interesse.

Assicurarsi che le posizioni a stadio singolo siano posizionate a una distanza sufficiente per ridurre al minimo lo sbiancamento delle foto e la tossicità delle foto. Una volta verificate le coordinate Z delle posizioni del palco selezionate, attivare l'autofocus hardware. Quindi avviare l'esperimento time-lapse nel software di controllo del microscopio.

Interrompere l'acquisizione dell'immagine dopo 24-30 ore, o quando le ife nella regione di interesse si sono differenziate in spore. Quindi arrestare il programma di flusso nel software e smontare il dispositivo microfluidico. Preparare la piastra microfluidica usata per la conservazione a breve termine rimuovendo il mezzo rimanente dai pozzetti di ingresso, dal pozzetto di scarto e dal pozzetto di caricamento delle celle.

Quindi riempire i pozzetti usati della corsia A e i pozzetti delle corsie inutilizzate con PBS sterile. Infine, sigillare il piatto con pellicola di pera per evitare che si secchi. E conservare la piastra a quattro gradi Celsius.

Il successo dell'imaging di cellule vive dell'intero ciclo di vita del S.venezuela produce una serie temporale continua, comprese le fasi chiave dello sviluppo della germinazione, della crescita vegetativa e della sporulazione. Durante la germinazione o la crescita vegetativa, DivIVA-mCherry si accumula esclusivamente sulle punte ipniche in crescita o segna i punti di ramificazione ifali di nuova formazione. Al contrario, FtsZ-YPet forma singole strutture ad anello a intervalli irregolari nel micelio in crescita.

Queste strutture forniscono l'impalcatura per la sintesi di pareti trasversali vegetative non costruttive che portano alla formazione di compartimenti ifali interconnessi. Nelle ife sporulanti, il modello di localizzazione di FtsZ-YPet cambia drasticamente. In primo luogo, i filamenti elicoidali di FtsZ-YPet cadono lungo l'ifa e poi, in un evento improvviso, quasi sincrono, queste eliche si fondono in una scala di anelli FtsZ-YPet regolarmente distanziati.

Infine, i setti di sporulazione diventano distinguibili nelle immagini di contrasto di interferenza differenziale e, infine, le nuove spore vengono rilasciate. Questa tecnica fornisce un protocollo robusto per eseguire l'imaging su cellule vive dell'intero ciclo di vita di Streptomyces. Il sistema microfluidico è facile da usare.

Offre flessibilità sperimentale e consente il monitoraggio a lungo termine del Questo set up sperimentale offre anche un ottimo punto di partenza per studiare specifici eventi di sviluppo in risposta a mutevoli condizioni culturali o all'uso di coloranti fluorescenti per monitorare la sintesi di peptidoglicano o per visualizzare l'organizzazione cromosomica.