Fluorescenza Time-lapse imaging del Complete

L'obiettivo generale di questo protocollo di microscopia a fluorescenza con acquisizione temporale è fornire un metodo per lo studio dei processi cellulari biologici alla base dello sviluppo e della differenziazione cellulare nel batterio filamentoso sporigeno, Streptomyces venezuelae. Il metodo descritto offre una piattaforma eccellente per studiare i processi di biologia cellulare centrali al ciclo vitale di Streptomyces, inclusi il reclutamento dinamico delle proteine, la crescita polarizzata e la formazione dei setti di sporulazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che Streptomyces venezuelae sporula in ambiente liquido, permettendoci di coltivare le cellule in un dispositivo microfluidico e di monitorare microscopicamente l'intero ciclo vitale.

Questo metodo dimostra il grande potenziale di Streptomyces venezuelae come nuovo sistema di sviluppo per il genere, poiché consente l'analisi in tempo reale della differenziazione di un micelio multinucleato in catene di spore. Per iniziare, inoculare 30 millilitri di mezzo di crescita supplementato con 10 microlitri di spore della ceppa di S. venezuelae da analizzare. Per una crescita e una sporulazione costanti delle cellule, utilizzare un matraccio con baffle o un matraccio contenente una molla che permetta un'adeguata aerazione.

Coltivare le cellule per 35-40 ore a 30 gradi Celsius e 250 giri al minuto. Al termine, dovrebbe essere possibile osservare i frammenti miceliali e le spore mediante microscopia a contrasto di fase con campione in sospensione liquida. Centrifugare un millilitro della coltura in una centrifuga da banco a 400 × g per un minuto per ottenere un pellet di micelio e dei frammenti cellulari più grandi.

Quindi trasferire circa 300 microlitri del soprannatante contenente una sospensione di spore in un nuovo tubo da 1,5 millimetri e posizionare il tubo sul ghiaccio. Conservare il mezzo di coltura rimanente per un utilizzo successivo. Successivamente, diluire le spore di uno a 20 in mezzo di crescita supplementato e mantenere le spore diluite sul ghiaccio fino al momento dell'uso.

Versare il mezzo di coltura rimanente in un becher da 50 millilitri, quindi aspirare 10 millilitri con una siringa e utilizzare un filtro sterile per siringa da 22 micrometri per sterilizzare per filtrazione il mezzo di coltura rimanente. Per ottenere un mezzo di crescita supplementato usato privo di spore e frammenti miceliali. Conservare il mezzo di crescita supplementato usato filtrato per alcuni giorni a quattro gradi Celsius se devono essere eseguiti ulteriori esperimenti utilizzando condizioni di crescita simili.

Ogni piastra microfluidica può essere utilizzata per un massimo di quattro esperimenti indipendenti. Per evitare la contaminazione delle camere di flusso non utilizzate, assicurarsi di utilizzare soluzioni e condizioni di lavoro sterili durante l'allestimento dell'esperimento. Iniziare rimuovendo la soluzione di trasporto dalla piastra microfluidica.

Quindi risciacquare le pozzette con mezzo di crescita supplementato sterile. Dopo il risciacquo, aggiungere 300 microlitri di mezzo di crescita supplementato all'ingresso della pozzetta uno e 300 microlitri di mezzo di crescita supplementato usato nelle pozzette due fino a sei. Successivamente, caricare 40 microlitri delle spore diluite nella pozzetta otto della fila A e sigillare il collettore alla piastra seguendo le istruzioni del produttore.

Avviare il software di controllo della microfluidica e selezionare il tipo di piastra appropriato. Impostare un programma di flusso per far passare il mezzo dalle pozzette di ingresso dalla prima alla quinta a sei psi per due minuti per ogni pozzetta, al fine di preparare il canale di flusso e la camera di coltura. Successivamente, far fluire il mezzo di crescita supplementato a sei psi nella pozzetta di ingresso uno per sei ore.

Questo permetterà la germinazione e la crescita vegetativa. Impostare il programma affinché passi dopo sei ore al mezzo di crescita supplementato usato, inviandolo nei pozzetti da due a cinque a sei psi per il resto dell'esperimento. Riscaldare in anticipo la camera ambientale a 30 gradi Celsius.

Quindi accendere il microscopio e il relativo software di controllo. Posizionare un obiettivo ad immersione in olio con elevata apertura numerica e verificare che i filtri appropriati e gli specchi diagrammatici siano impostati per acquisire immagini in contrasto di interferenza differenziale, insieme alle immagini delle fusioni proteiche fluorescenti gialle e rosse. Applicare una goccia di olio per immersione sull'obiettivo e anche sul fondo della finestra di acquisizione presente nella piastra microfluidica.

Montare con attenzione il dispositivo microfluidico sigillato sulla piastra del microscopio invertito e fissarlo saldamente. Utilizzare i marcatori di posizione integrati per mettere a fuoco la finestra di acquisizione dell'immagine della camera di coltura microfluidica. Mettere a fuoco sulla parte più a sinistra della prima camera di flusso contrassegnata con A, quindi spostare la piastra fino alla dimensione della trappola numero cinque, corrispondente all'altezza della trappola di 7 micrometri.

Nel software microfluidico, impostare il sistema per caricare le cellule dal pozzetto di ingresso otto a quattro psi per 15 secondi. Dopo l'esecuzione del processo, verificare la densità cellulare nella camera di coltura spostando la piastra attraverso la finestra di imaging. Se non sono state intrappolate spore, ripetere il passaggio di caricamento delle cellule oppure aumentare la pressione e/o il tempo di caricamento fino al raggiungimento della densità cellulare desiderata, pari a una-dieci spore per finestra di imaging.

Si presti attenzione a non sovraccaricare la camera di coltura. Successivamente, avviare nel software di controllo il programma di flusso precedentemente preparato e lasciare che la piastra microfluidica raggiunga l'equilibrio termico per un'ora sulla stage del microscopio prima di iniziare l'acquisizione delle immagini. Nel software di controllo del microscopio, impostare un'acquisizione multidimensionale per eseguire più immagini in diverse posizioni della stage nel tempo, specificando innanzitutto una directory per il salvataggio automatico dei file immagine.

Successivamente, accedere alle impostazioni di illuminazione e inserire le impostazioni ottimali predeterminate per ciascun costrutto specifico. Impostare quindi una serie temporale per acquisire immagini ogni 40 minuti per un periodo di 24 ore. Per determinare le posizioni della piastra e impostare l'autofocus, scansionare la camera di coltura e memorizzare le posizioni della piastra per ciascuna posizione di interesse da immagineggiare.

Assicurarsi che le posizioni del palco a singolo stadio siano posizionate a una distanza sufficiente per ridurre al minimo lo sbiancamento della fluorescenza e la tossicità fotoindotta. Una volta verificate le coordinate Z delle posizioni del palco selezionate, attivare l'autofocus hardware. Quindi avviare l'esperimento in lapse temporale nel software di controllo del microscopio.

Interrompere l'acquisizione delle immagini dopo 24-30 ore o quando le ife nella regione di interesse si sono differenziate in spore. Quindi arrestare il programma di flusso nel software e smontare il dispositivo microfluidico. Preparare la piastra microfluidica utilizzata per la conservazione a breve termine rimuovendo il mezzo residuo dai pozzetti di ingresso, dal pozzetto di scarto e dal pozzetto di caricamento delle cellule.

Quindi riempire le pozzette utilizzate della corsia A e le pozzette delle corsie non utilizzate con PBS sterile. Infine, sigillare la piastra con pellicola trasparente per evitare che si secchi e conservare la piastra a quattro gradi Celsius.

L'imaging in tempo reale di cellule vive dell'intero ciclo vitale di S.venezuela produce una serie temporale continua, che comprende le fasi chiave dello sviluppo quali germinazione, crescita vegetativa e sporulazione. Durante la germinazione o la crescita vegetativa, DivIVA-mCherry si accumula esclusivamente alle estremità apicali in crescita o marca i punti di nuova formazione di ramificazioni ifali. Al contrario, FtsZ-YPet forma singole strutture ad anello a intervalli irregolari nel micelio in crescita.

Queste strutture forniscono un'impalcatura per la sintesi di setti vegetativi non costruttivi che portano alla formazione di compartimenti ifali interconnessi. Negli ifi sporogeni, il pattern di localizzazione di FtsZ-YPet cambia in modo drammatico. Inizialmente, i filamenti elicoidali di FtsZ-YPet si muovono lungo l'ifa, per poi, in un evento improvviso e quasi sincrono, aggregarsi in una serie regolare di anelli di FtsZ-YPet disposti a scala.

Infine, i setti di sporulazione diventano distinguibili nelle immagini ottenute mediante contrasto di interferenza differenziale e, alla fine, le nuove spore vengono rilasciate. Questa tecnica fornisce un protocollo solido per eseguire l'analisi in tempo reale dell'intero ciclo vitale di Streptomyces. Il sistema microfluidico è facile da utilizzare.

Offre flessibilità sperimentale e permette il monitoraggio a lungo termine di questi eventi. Questa configurazione speriment inflammabile costituisce anche un ottimo punto di partenza per studiare eventi specifici dello sviluppo in risposta a variazioni delle condizioni colturali o all'uso di coloranti fluorescenti per monitorare la sintesi del peptidoglicano o per visualizzare l'organizzazione del cromosoma.