Name: Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Impara a eseguire l'imaging cellulare in diretta di Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse automatica. Questo metodo consente di studiare la dinamica delle proteine e il comportamento cellulare nel tempo.

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Il lavoro nel gruppo di JWV è supportata da un Marie-Curie dell&#39;UE reintegrazione Fellowship, una sovvenzione Sysmo2 (NWO-ALW/ERASysBio), un orizzonte di finanziamento (ZonMW) e da una borsa di studio VENI (NWO-ALW). Il gruppo di OPK è supportato da diversi concede STW (NWO), un SYSMO1 (IGdeJ) e SYSMO2 sovvenzione, FSE Eurocores SynBio concedere (SynMod) e dal Centro di Genomica Kluyver di Fermentazione Industriale e l&#39;Istituto superiore per Alimenti e la Nutrizione.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

A differenza di molte altre tecniche singola cellula, il time-lapse metodo di microscopia a fluorescenza qui descritto può essere usato per seguire la storia di una cella specifica in relazione ai suoi antenati, il suo comportamento, e gli eventi divisione. In combinazione con i promotori bersaglio fluorescente o proteine, specifica attivazione della via di sviluppo può essere seguito in tempo e la localizzazione delle proteine ​​e la dinamica delle proteine ​​può essere monitorato durante lo sviluppo dei batteri. Come indicato sopra, gli studi concentrandosi su diverse specie batteriche possono essere eseguite da adattare le condizioni di crescita a seconda delle esigenze di un batterio specifico. Le uniche limitazioni che abbiamo incontrato sono legati alle condizioni di crescita e la dimensione del campione. A causa di un ambiente sigillato, le condizioni di media non può essere modificato durante l&#39;esperimento. Inoltre, un massimo di quattro ceppi per esperimento può essere monitorato in modo efficiente. Considerando a pochi passi critico, l&#39;unico metodo di analisi delle cellule qui descritto può essere facilmente applicato con qualsiasi microscopio automatizzato. Di seguito, una panoramica di tali passaggi critici sarà dato. Informazioni dettagliate si possono trovare nel testo principale generali di redazione:. E &#39;consigliabile controllare le impostazioni di messa a fuoco automatica richieste per un batterio specifico prima dell&#39;esperimento. Allo stesso modo, approssimativo impostazioni ottimali per la visualizzazione della fluorescenza deve essere determinato in anticipo, se possibile. Inoltre, a seguito di un pronto time-line consente di avere tutto il materiale pronto per l&#39;uso nel tempo (pre-riscaldamento della camera di microscopio, la programmazione delle impostazioni microscopio, preparazione del vetrino uno ora prima che le cellule sono in fase di crescita desiderata, vedi figura 1) . crescita di B. subtilis in TLM e CDM: TLM e CDM sono chimicamente supporto definito la fame nel quale B. subtilis si sviluppa solo lentamente. Il periodo di tempo in cui vengono coltivate le cellule del supporto potrebbe essere prolungata a seconda del ceppo specifico. La crescita lenta impedisce alle cellule di accumulano l&#39;uno sull&#39;altro Preparazione del campione microscopio:. Bolle d&#39;aria tra la struttura del gene, il vetrino e la polizza di copertura devono essere prevenuti contro l&#39;essiccamento estensivo del agarosio-based media. Lo stesso vale per il medio / coperchio interfaccia slittamento. E &#39;fondamentale lasciare le pile a secco a sufficienza, per evitare che il nuoto e / o di crescita dello strato più Time-lapse microscopia a fluorescenza:. Pre-riscaldamento della diapositiva e la camera ambientale è fondamentale per prevenire problemi di messa a fuoco automatica più importanti. Le cellule dovrebbero essere selezionati nel bel mezzo di un tampone agar, dato che questi hanno la più alta possibilità di soggiornare in campo e mettere a fuoco durante l&#39;esperimento (a condizione che il campione è stato asciugato abbastanza bene). Un massimo di 10 posizioni per esperimenti funziona ancora correttamente. Dopo aver selezionato la prima cella di interesse solo utilizzare il software per regolare la messa a fuoco (vedi testo per i dettagli). Verificare se le cellule sono ancora a fuoco durante le prime ore della sperimentazione in intervalli di 30 min. Analisi: E &#39;importante controllare prima di procedure di analisi estese se lo sfondo del mezzo ha valori simili nei canali di fluorescenza. Piccole particelle di polvere, i componenti di media, lenti sporche o piccoli grumi agarosio può contribuire ad un aumento della fluorescenza a livello locale, rendendo il film difficili o impossibili da analizzare guasti:. Se le cellule crescono uno sopra l&#39;altro, questo potrebbe indicare che sia stato il coprioggetto attaccato troppo presto o che il mezzo non è adatto per la crescita di monostrati microcolony. Se le cellule di interesse continuamente muoiono prematuramente, mentre altre cellule sul vetrino divide felicemente, si potrebbe desiderare di controllare se si inserisce il filtro UV in posizione. Si potrebbe anche contribuire a diminuire il tempo di esposizione o l&#39;intensità della luce durante gli esperimenti a lungo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Gene Telaio </td><td> ABgene </td><td> AB-0578 </td><td> 1,7 x 2,8 centimetri </td></tr><tr><td> ad alta risoluzione a bassa fusione agarosio </td><td> Sigma </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> fodera grande </td><td> parecchi </td><td></td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> se lo si desidera, membrana tintura, ad esempio, FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> coloranti membrana altri sono disponibili anche: <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> Time-lapse microscopio con camera ambientale </td><td> parecchi </td><td></td><td> vedi i dettagli per il nostro dispositivo in sezioni corrispondenti </td></tr></tbody></table>

cellulare imaging in diretta di bacillus subtilis e streptococcus pneumoniae utilizzando automatico time-lapse microscopia

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Nel corso degli ultimi anni gli scienziati è diventato sempre più consapevole che i dati medi ottenuti da esperimenti popolazione microbica base non sono rappresentativi dello stato di comportamento, o fenotipo delle cellule singole. A causa di questa nuova visione del numero di studi singola cellula aumenta continuamente (per una rassegna recente si veda 1,2,3). Tuttavia, molte delle tecniche applicate singola cellula non consentono il monitoraggio dello sviluppo e il comportamento di una specifica cella singola nel tempo (ad esempio, citometria a flusso o microscopia standard). Qui, fornire una descrizione dettagliata di un metodo di microscopia utilizzato in diversi studi recenti 4, 5, 6, 7, che consente i seguenti e la registrazione (fluorescenza) singole cellule batteriche di Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae attraverso la crescita e la divisione per molte generazioni. I film risultante può essere usato per costruire alberi filogenetici lignaggio da ripercorrere la storia di una singola cella all&#39;interno di una popolazione che ha avuto origine da un antenato comune. Questo time-lapse metodo di microscopia a fluorescenza non può essere utilizzato solo per studiare la crescita, la divisione e la differenziazione delle cellule individuali, ma anche per analizzare l&#39;effetto della storia delle cellule e ascendenza su specifici comportamento cellulare. Inoltre, microscopia time-lapse è ideale per esaminare le dinamiche di espressione genica e localizzazione di proteine ​​durante il ciclo cellulare batterica. Il metodo spiega come preparare le cellule batteriche e di costruire il vetrino da microscopio per consentire la conseguenza di singole cellule in un microcolony. In breve, le singole celle sono macchiati di un semi-solida superficie costituita da terreno di coltura integrata con agarosio su cui crescono e si dividono con un microscopio a fluorescenza all&#39;interno di una camera a temperatura controllata ambientale. Le immagini vengono acquisiti a intervalli specifici e vengono poi analizzati utilizzando il software open source ImageJ.

Questo protocollo offre un passo-passo procedura per monitorare il comportamento singola cellula dei batteri diversi nel tempo con modalità automatizzate fluorescenza microscopia time-lapse. Inoltre, forniamo le linee guida su come analizzare le immagini di microscopia.

Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

Negli ultimi anni, gli scienziati sono diventati sempre più consapevoli del fatto che i dati medi ottenuti da esperimenti basati su popolazioni microbiche non siano...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere immagini di cellule vive durante la crescita e la divisione mediante microscopia a fluorescenza, in modo da poter studiare l'effetto della storia cellulare e dell'ascendenza sullo sviluppo cellulare dei batteri. Questo viene ottenuto trasferendo innanzitutto le cellule da un mezzo liquido con concentrazioni relativamente elevate di nutrienti a un mezzo liquido di privazione. Successivamente, si utilizza un vetrino su cui le cellule batteriche cresceranno formando una microcolonia.Viene preparato un monocstrato. Successivamente, viene registrato un filmato mediante microscopia a fluorescenza con acquisizione temporizzata. Infine, il filmato viene elaborato e i dati sono analizzati.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano lo sviluppo di una singola cellula batterica nel tempo mediante microscopia a fluorescenza in time-lapse. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto a tecniche esistenti come la citometria a flusso e la microscopia standard è che consente il monitoraggio della dinamica proteica, del comportamento cellulare e dello sviluppo di singole cellule nel tempo. A dimostrazione della procedura, interverrà Cone, una studentessa di dottorato del mio laboratorio. Per preparare i campioni, inoculare le cellule partendo da ceppi conservati a meno 80 gradi Celsius in 10 millilitri di mezzo per microscopia in time-lapse (TLM) in flaconi sterili per agitazione, aggiungendo antibiotici se necessario. Far crescere le cellule per tutta la notte a 30 gradi Celsius e 225 giri al minuto in un flacone sterile per agitazione. La mattina seguente, raccogliere le cellule e trasferirle in un mezzo chimicamente definito (CDM) preriscaldato, senza antibiotici, in un rapporto da 1 a 10. Far crescere le cellule più sottili fino alla fase esponenziale intermedia, operazione che richiede circa quattro ore. Misurare l'assorbanza della coltura a 600 nanometri e diluire le cellule fino a un valore approssimativo di A600 pari a 0,035.Utilizzando CDM. Questo OD garantisce che singole cellule con un'adeguata distanza tra loro vengano depositate sul vetrino del microscopio per la microscopia in time-lapse. Un'ora prima che le cellule raggiungano la fase di crescita esponenziale media.Preparare il vetrino pulendo due vetrini di vetro con etanolo al 70% e acqua. Rimuovere una delle coperture di plastica da un gene frame, avendo cura di non causare lo smontaggio della copertura di plastica sull'altro lato del telaio. Fissare il gene frame al centro di uno dei vetrini di vetro attaccandolo prima a un lato, quindi guidando il resto con l'unghia.Utilizzare un forno a microonde per sciogliere 150 milligrammi di agarosio a basso punto di fusione ad alta risoluzione in 10 millilitri di CDM, assicurandosi che l'agarosio sia completamente sciolto per evitare fluorescenza di fondo. Pipettare 500 microlitri del CDM agaro caldo al centro del gene frame, verificando che l'intera area, inclusi i bordi, sia completamente ricoperta.Lavorare rapidamente per evitare un'eccessiva essiccazione degli aros. Posizionare il secondo vetrino sulla cornice genica Aros CDM riempita, cercando di evitare bolle d'aria. Posizionare il sandwich in posizione orizzontale a quattro gradi Celsius per 45 minuti, in modo da permettere agli agros di solidificare sufficientemente.Una volta che l'agarosio si è solidificato accuratamente, rimuovere delicatamente il vetrino superiore. Utilizzare una lametta per tagliare strisce di agarosio larghe circa cinque millimetri, sulle quali cresceranno i batteri. È possibile utilizzare un massimo di tre strisce per vetrino, separate da spazi di circa quattro millimetri su ciascun lato.Questi spazi forniranno l'aria necessaria per la crescita di Blu. Rimuovere con attenzione il secondo e ultimo rivestimento di plastica dalla cornice genica per esporre il lato adesivo. Caricare singole cellule in circa 2,5 microlitri di liquido sul mezzo solido, iniziando dalla parte superiore dell'agros pad senza toccarlo.Con la punta della pipetta, inclinare il vetrino verso l'alto e verso il basso per far sì che il mezzo si distribuisca uniformemente. Posizionare un'apposita copertura per microscopio pulita sul telaio genico in modo da fissare completamente il vetrino coprioggetto. Applicare una pressione con l'unghia dopo che le cellule sono state caricate.È fondamentale attendere abbastanza a lungo affinché il liquido si asciughi, in modo da evitare cellule in movimento e crescita in strati multipli. Tuttavia, se le cellule vengono essiccate troppo a lungo, avranno difficoltà a svilupparsi in un monocstrato microcoloniale. Pertanto, il tempo necessario per l'essiccazione dei vetrini dipende dall'esperimento e non può essere misurato.E naturalmente, è necessario prendere confidenza con la procedura. Per evitare problemi di messa a fuoco automatica durante le prime ore dell'esperimento in time-lapse, preriscaldare il vetrino per un'ora a 30 gradi Celsius per prepararsi alla microscopia in time-lapse. Preriscaldare la camera ambientale per almeno due ore. Prima dell'inizio dell'esperimento, selezionare l'obiettivo appropriato, i filtri e lo specchio dicromatico in base al proprio setup sperimentale.Per esperimenti di lunga durata, assicurarsi che un filtro UV sia posizionato tra la sorgente luminosa e il campione. Inoltre, se possibile, bloccare parte della luce di eccitazione utilizzando filtri di densità neutra per minimizzare l'esposizione. Programmare l'esperimento in base all'allestimento sperimentale specifico.È consigliabile determinare la quantità di luce necessaria per costrutti specifici, così come le impostazioni di messa a fuoco automatica per altri microscopi a lapse temporale o per batteri, prima dell'esperimento effettivo. Tempi di esposizione più brevi e livelli inferiori di luce di eccitazione minimizzeranno lo sbiancamento e la fototossicità. Utilizzare luce scopia per la funzione di messa a fuoco automatica. Infine, posizionare il vetrino preparato nella camera ambientale preriscaldata del microscopio e monitorare la crescita di singole cellule fino a formare un monostrato di microcolonia a 30 gradi Celsius.Un esperimento di fluorescenza con lapse temporale riuscito produrrà un monostrato di microcolonia situato interamente all'interno del campo visivo. Al termine dell'esperimento mostrato in questo filmato, l'illuminazione in campo chiaro si trova a sinistra e la fluorescenza è visibile a destra.Di seguito è riportato un esempio di una microcolonia di B Subtles in cui alcune cellule sono cresciute l'una sopra l'altra, rendendo difficile risalire con precisione alla loro storia e misurare correttamente i livelli di fluorescenza. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare correttamente un campione microscopico per la microscopia in time-lapse e di come eseguire una microscopia a fluorescenza in time-lapse. Eseguire esperimenti con cellule BACE.

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