Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia
28 luglio 2011
Questo protocollo offre un passo-passo procedura per monitorare il comportamento singola cellula dei batteri diversi nel tempo con modalità automatizzate fluorescenza microscopia time-lapse. Inoltre, forniamo le linee guida su come analizzare le immagini di microscopia.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere immagini di cellule vive durante la crescita e la divisione mediante microscopia a fluorescenza, in modo da poter studiare l'effetto della storia cellulare e dell'ascendenza sullo sviluppo cellulare dei batteri. Questo viene ottenuto trasferendo innanzitutto le cellule da un mezzo liquido con concentrazioni relativamente elevate di nutrienti a un mezzo liquido di privazione. Successivamente, si utilizza un vetrino su cui le cellule batteriche cresceranno formando una microcolonia.
Viene preparato un monocstrato. Successivamente, viene registrato un filmato mediante microscopia a fluorescenza con acquisizione temporizzata. Infine, il filmato viene elaborato e i dati sono analizzati.
In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano lo sviluppo di una singola cellula batterica nel tempo mediante microscopia a fluorescenza in time-lapse. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto a tecniche esistenti come la citometria a flusso e la microscopia standard è che consente il monitoraggio della dinamica proteica, del comportamento cellulare e dello sviluppo di singole cellule nel tempo. A dimostrazione della procedura, interverrà Cone, una studentessa di dottorato del mio laboratorio. Per preparare i campioni, inoculare le cellule partendo da ceppi conservati a meno 80 gradi Celsius in 10 millilitri di mezzo per microscopia in time-lapse (TLM) in flaconi sterili per agitazione, aggiungendo antibiotici se necessario. Far crescere le cellule per tutta la notte a 30 gradi Celsius e 225 giri al minuto in un flacone sterile per agitazione. La mattina seguente, raccogliere le cellule e trasferirle in un mezzo chimicamente definito (CDM) preriscaldato, senza antibiotici, in un rapporto da 1 a 10. Far crescere le cellule più sottili fino alla fase esponenziale intermedia, operazione che richiede circa quattro ore. Misurare l'assorbanza della coltura a 600 nanometri e diluire le cellule fino a un valore approssimativo di A600 pari a 0,035.
Utilizzando CDM. Questo OD garantisce che singole cellule con un'adeguata distanza tra loro vengano depositate sul vetrino del microscopio per la microscopia in time-lapse. Un'ora prima che le cellule raggiungano la fase di crescita esponenziale media.
Preparare il vetrino pulendo due vetrini di vetro con etanolo al 70% e acqua. Rimuovere una delle coperture di plastica da un gene frame, avendo cura di non causare lo smontaggio della copertura di plastica sull'altro lato del telaio. Fissare il gene frame al centro di uno dei vetrini di vetro attaccandolo prima a un lato, quindi guidando il resto con l'unghia.
Utilizzare un forno a microonde per sciogliere 150 milligrammi di agarosio a basso punto di fusione ad alta risoluzione in 10 millilitri di CDM, assicurandosi che l'agarosio sia completamente sciolto per evitare fluorescenza di fondo. Pipettare 500 microlitri del CDM agaro caldo al centro del gene frame, verificando che l'intera area, inclusi i bordi, sia completamente ricoperta.
Lavorare rapidamente per evitare un'eccessiva essiccazione degli aros. Posizionare il secondo vetrino sulla cornice genica Aros CDM riempita, cercando di evitare bolle d'aria. Posizionare il sandwich in posizione orizzontale a quattro gradi Celsius per 45 minuti, in modo da permettere agli agros di solidificare sufficientemente.
Una volta che l'agarosio si è solidificato accuratamente, rimuovere delicatamente il vetrino superiore. Utilizzare una lametta per tagliare strisce di agarosio larghe circa cinque millimetri, sulle quali cresceranno i batteri. È possibile utilizzare un massimo di tre strisce per vetrino, separate da spazi di circa quattro millimetri su ciascun lato.
Questi spazi forniranno l'aria necessaria per la crescita di Blu. Rimuovere con attenzione il secondo e ultimo rivestimento di plastica dalla cornice genica per esporre il lato adesivo. Caricare singole cellule in circa 2,5 microlitri di liquido sul mezzo solido, iniziando dalla parte superiore dell'agros pad senza toccarlo.
Con la punta della pipetta, inclinare il vetrino verso l'alto e verso il basso per far sì che il mezzo si distribuisca uniformemente. Posizionare un'apposita copertura per microscopio pulita sul telaio genico in modo da fissare completamente il vetrino coprioggetto. Applicare una pressione con l'unghia dopo che le cellule sono state caricate.
È fondamentale attendere abbastanza a lungo affinché il liquido si asciughi, in modo da evitare cellule in movimento e crescita in strati multipli. Tuttavia, se le cellule vengono essiccate troppo a lungo, avranno difficoltà a svilupparsi in un monocstrato microcoloniale. Pertanto, il tempo necessario per l'essiccazione dei vetrini dipende dall'esperimento e non può essere misurato.
E naturalmente, è necessario prendere confidenza con la procedura. Per evitare problemi di messa a fuoco automatica durante le prime ore dell'esperimento in time-lapse, preriscaldare il vetrino per un'ora a 30 gradi Celsius per prepararsi alla microscopia in time-lapse. Preriscaldare la camera ambientale per almeno due ore. Prima dell'inizio dell'esperimento, selezionare l'obiettivo appropriato, i filtri e lo specchio dicromatico in base al proprio setup sperimentale.
Per esperimenti di lunga durata, assicurarsi che un filtro UV sia posizionato tra la sorgente luminosa e il campione. Inoltre, se possibile, bloccare parte della luce di eccitazione utilizzando filtri di densità neutra per minimizzare l'esposizione. Programmare l'esperimento in base all'allestimento sperimentale specifico.
È consigliabile determinare la quantità di luce necessaria per costrutti specifici, così come le impostazioni di messa a fuoco automatica per altri microscopi a lapse temporale o per batteri, prima dell'esperimento effettivo. Tempi di esposizione più brevi e livelli inferiori di luce di eccitazione minimizzeranno lo sbiancamento e la fototossicità. Utilizzare luce scopia per la funzione di messa a fuoco automatica. Infine, posizionare il vetrino preparato nella camera ambientale preriscaldata del microscopio e monitorare la crescita di singole cellule fino a formare un monostrato di microcolonia a 30 gradi Celsius.
Un esperimento di fluorescenza con lapse temporale riuscito produrrà un monostrato di microcolonia situato interamente all'interno del campo visivo. Al termine dell'esperimento mostrato in questo filmato, l'illuminazione in campo chiaro si trova a sinistra e la fluorescenza è visibile a destra.
Di seguito è riportato un esempio di una microcolonia di B Subtles in cui alcune cellule sono cresciute l'una sopra l'altra, rendendo difficile risalire con precisione alla loro storia e misurare correttamente i livelli di fluorescenza. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare correttamente un campione microscopico per la microscopia in time-lapse e di come eseguire una microscopia a fluorescenza in time-lapse. Eseguire esperimenti con cellule BACE.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per monitorare il comportamento di singole cellule batteriche nel tempo mediante microscopia a fluorescenza automatizzata con acquisizione sequenziale di immagini. Include linee guida dettagliate per la preparazione dei campioni e l'analisi delle immagini ottenute.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Biologia cellulare
- Microscopia a fluorescenza
Sfondo
- Comprendere il comportamento delle cellule batteriche è fondamentale per vari studi biologici.
- La microscopia a intervalli temporali consente l'osservazione della dinamica delle cellule vive.
- Questo metodo fornisce informazioni sugli effetti della storia cellulare sullo sviluppo.
- I metodi tradizionali potrebbero non cogliere le sfumature del comportamento a livello di singola cellula.
Scopo dello studio
- Visualizzare cellule batteriche vive durante la crescita e la divisione.
- Analizzare l'impatto delle condizioni nutrizionali sullo sviluppo cellulare.
- Migliorare la comprensione della dinamica delle proteine e del comportamento cellulare.
Metodi Utilizzati
- Trasferire le cellule in un mezzo di privazione per avviare la crescita.
- Preparare un vetrino per microscopia per la crescita batterica.
- Registrare filmati in microscopia a fluorescenza con acquisizione temporizzata.
- Analizzare i dati registrati per osservare lo sviluppo cellulare.
Risultati principali
- Acquisizione di immagini riuscita di singole cellule batteriche nel tempo.
- Osservazione della formazione e dello sviluppo di microcoloni.
- Informazioni sulle dinamiche dell'espressione proteica in singole cellule.
- Dimostrazione dei vantaggi della microscopia a intervalli rispetto ai metodi tradizionali.
Conclusioni
- Il protocollo consente efficacemente lo studio del comportamento a livello di singola cellula nei batteri.
- La microscopia a intervalli è uno strumento potente per l'analisi cellulare.
- Studi futuri possono basarsi su questo metodo per esplorare altre dinamiche batteriche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il monitoraggio del comportamento di singole cellule nei batteri consente una riduzione meccanicistica dei rischi nella validazione di bersagli antimicrobici, rivelando eterogeneità nella crescita, nella divisione e nell'espressione proteica. Questo approccio supporta una previsione affidabile nella fase iniziale della scoperta, collegando la storia cellulare agli esiti fenotipici e fornendo informazioni per la selezione di portafogli nello sviluppo di antibiotici. La microscopia a intervalli temporali garantisce una continuità traslazionale dalla schermatura meccanicistica alla valutazione dei modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche monitorando le risposte individuali delle cellule a variazioni nutrizionali e perturbazioni genetiche nel tempo.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di bersagli mediante l'osservazione diretta della dinamica proteica e del comportamento cellulare a livello di singola cellula.
- Valore predittivo: Favorisce l'identificazione di composti promettenti correlando l'ascendenza cellulare con la stabilità fenotipica attraverso le generazioni.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi, stabilendo una formazione riproducibile di microcolonie su cuscinetti di agarosio.
- Risultati quantitativi: Genera dati temporali di fluorescenza e in campo chiaro che permettono la misurazione dei tassi di crescita, dei tempi di divisione e della localizzazione proteica.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma su diverse specie batteriche (B. subtilis, S. pneumoniae) per la valutazione standardizzata di bersagli antimicrobici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le Malattie: Modella il comportamento del patogeno in specie clinicamente rilevanti come S. pneumoniae per informare studi sui meccanismi d'azione degli antimicrobici.
- Allineamento del Biomarcatore Traduzionale: Collega la dinamica proteica a livello singola-cellula a fenotipi a livello di popolazione, supportando decisioni di avanzamento o meno basate sui biomarcatori.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli preclinici mediante la validazione degli effetti sul bersaglio a risoluzione singola-cellula.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo posiziona l'analisi temporale a livello di singola cellula tra la validazione dell'obiettivo e l'ottimizzazione del composto iniziale, consentendo la verifica delle ipotesi e la riduzione dei rischi meccanicistici prima dello screening dei composti.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici visualizzando come la dinamica dell'espressione genica influenzi il comportamento cellulare durante la crescita e la divisione.
- Screening: Fornisce microcoloni pronti per saggi, con spaziatura standardizzata e formazione di un monostrato, per una valutazione affidabile dei composti.
- Analisi: Fornisce variabili dipendenti quantitative, tra cui intensità di fluorescenza, tempistica della divisione e tracciamento della linea cellulare, per l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega le osservazioni a livello di singola cellula alla continuità preclinica attraverso modelli di comportamento dipendenti dall'ascendenza in sistemi patogeni.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di microscopia riutilizzabile per la valutazione di bersagli antimicrobici trasversale ai progetti nei modelli Gram-positivi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi attraverso l'osservazione diretta della dinamica proteica a livello di singola cellula e dell'eterogeneità comportamentale.
- Valore operativo: Preparazione standardizzata dei vetrini e controlli ambientali garantiscono la riproducibilità tra laboratori e tra diverse serie sperimentali.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione basate sulla coerenza delle risposte a livello di singola cellula, piuttosto che su medie di popolazione.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta del rischio dei candidati antimicrobici mediante dati fenotipici risolti a livello di linea cellulare, evitando falsi positivi derivanti dalla mascheratura di popolazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di coltura microbica, nella microscopia a fluorescenza e nell'uso di software di analisi delle immagini come ImageJ.
- È dipendente da camere ambientali a temperatura controllata, filtri di densità neutra e protezione UV per l'acquisizione di immagini a lungo termine.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei vetrini, la concentrazione di agarosio e i protocolli di carico cellulare, al fine di garantire coerenza tra laboratori.
- Le considerazioni per l'adattamento includono l'ottimizzazione dello spessore dell'agarosio e della composizione nutrizionale in base alle diverse specie batteriche e ai loro tassi di crescita.
- I limiti pratici comprendono il rischio di fototossicità durante acquisizioni prolungate e le difficoltà nel tracciare cellule che crescono in formazioni multistrato.
