Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare le cellule vive attraverso la crescita e la divisione utilizzando la microscopia a fluorescenza in modo da poter studiare l'effetto della storia cellulare e dell'ascendenza sullo sviluppo cellulare dei batteri. Ciò si ottiene trasferendo prima le cellule da un mezzo liquido con concentrazioni relativamente elevate di nutrienti a un mezzo liquido di fame. Successivamente, un vetrino microscopico su cui le cellule batteriche cresceranno in una micro colonia.

Il monostrato è preparato. Quindi viene registrato un filmato di microscopia a fluorescenza time lapse. Infine, il filmato viene elaborato e i dati analizzati.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano lo sviluppo di una singola cellula batterica attraverso la microscopia a fluorescenza time-lapse. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti come la citometria a flusso e la microscopia standard, è che consente il monitoraggio della dinamica delle proteine, del comportamento cellulare e dello sviluppo di singole cellule nel tempo, dimostrando che la procedura sarà in cono, uno studente di dottorato del mio laboratorio per preparare le cellule inoculate da meno 80 gradi Celsius, scorte in 10 millilitri di microscopia time-lapse o terreno TLM in fiasche sterili integrate con antibiotici se necessario, far crescere le cellule durante la notte a 30 gradi Celsius e 225 giri/min in una fiaschetta sterile la mattina seguente per saccheggiare le cellule da una a 10 in Prewarm, terreno chimicamente definito o CDM senza antibiotici, far crescere le cellule più sottili delle api fino alla fase esponenziale media, che dura circa quattro ore. Misurare l'assorbanza della coltura a 600 nanometri e diluire le cellule a circa 600 di 0,035.

Utilizzo di CDM. Questo OD assicura che le singole cellule con una distanza appropriata tra le cellule vengano individuate sul vetrino del microscopio per la microscopia time-lapse. Un'ora prima che le cellule raggiungano la metà della crescita esponenziale.

Preparare il vetrino del microscopio pulendo due vetrini con etanolo al 70% e acqua. Rimuovere una delle coperture di plastica da un telaio genetico, facendo attenzione a non causare lo smontaggio della copertura di plastica sull'altro lato del telaio. Attacca la cornice genetica al centro di uno dei vetrini prima attaccandolo da un lato, quindi guidando il resto con un'unghia.

Usa un forno a microonde per sciogliere 150 milligrammi di aros a basso punto di fusione ad alta risoluzione. In 10 millilitri di CDM, assicurarsi che l'aros sia completamente disciolto per prevenire la fluorescenza di fondo. Pipettare 500 microlitri di agro CDM caldo al centro della cornice genetica, assicurandosi che l'intera area, compresi i bordi, sia completamente coperta.

Lavorando rapidamente per evitare un'eccessiva essiccazione dell'aros. Posizionare il secondo vetrino sulla cornice genetica riempita di Aros CDM cercando di evitare bolle d'aria. Posizionare il panino in posizione orizzontale a quattro gradi Celsius per 45 minuti per consentire agli agro di solidificarsi a sufficienza.

Una volta che l'aros si è solidificato con cura, sfilare il vetro superiore. Usa una lama di rasoio per ritagliare strisce di agro di circa cinque millimetri di larghezza su cui cresceranno i batteri. È possibile utilizzare un massimo di tre strisce per vetrino, separate da spazi di circa quattro millimetri su entrambi i lati.

Questi spazi forniranno aria essenziale per la crescita di Blu. Rimuovere con cautela il secondo e ultimo coperchio di plastica dal telaio genetico per esporre il lato adesivo. Caricare le singole celle in circa 2,5 microlitri di liquido sul mezzo solido, iniziando dalla parte superiore del tampone agros senza toccarlo.

Con il puntale della pipetta, lasciare che il fluido si distribuisca uniformemente inclinando il vetrino verso l'alto e verso il basso. Posizionare un coperchio pulito del microscopio sulla cornice del gene per attaccare completamente il vetrino coprioggetto. Utilizzare un'unghia per applicare pressione Quindi, dopo che le celle sono state caricate.

È fondamentale attendere che il liquido si asciughi abbastanza a lungo in modo da non ottenere cellule che nuotano e crescono in più strati. Tuttavia, se le cellule vengono essiccate troppo a lungo, avranno problemi a crescere in un monostrato di micro cholon. Quindi il tempo necessario per asciugare i vetrini dipende dall'esperimento e non può essere misurato.

E di conseguenza, è ovviamente necessario avere un'idea per evitare problemi di messa a fuoco automatica durante le prime ore dell'esperimento time-lapse, preriscaldare il vetrino per un'ora a 30 gradi Celsius per prepararsi alla microscopia time-lapse. Preriscaldare la camera ambientale per almeno due ore. Prima dell'inizio dell'esperimento, seleziona i filtri obiettivo e lo specchio dicroico appropriati in base alla tua configurazione sperimentale.

Per esperimenti lunghi, assicurarsi che un filtro UV sia posizionato tra la sorgente luminosa e il campione. Inoltre, se possibile, bloccare parte della luce di eccitazione utilizzando filtri a densità neutra per ridurre al minimo l'esposizione. Programmare l'esperimento in base alla specifica configurazione sperimentale.

È consigliabile determinare la quantità di luce necessaria per costrutti specifici, nonché le impostazioni di messa a fuoco automatica per altri microscopi time-lapse o batteri prima dell'esperimento vero e proprio. Tempi di esposizione più brevi e livelli più bassi di luce di eccitazione ridurranno al minimo lo sbiancamento e la fototossicità Utilizzare la luce scopica per la funzione di messa a fuoco automatica. Infine, posizionare il vetrino preparato nella camera ambientale di preriscaldamento del microscopio e monitorare la crescita delle singole cellule in un monostrato di microcolonia a 30 gradi Celsius.

Un esperimento di fluorescenza time-lapse di successo produrrà un monostrato di micro colonia completamente localizzato all'interno del campo visivo. Alla fine dell'esperimento in questo filmato, il campo luminoso è sulla sinistra e si può vedere la fluorescenza. A destra.

Ecco un esempio di una micro colonia di B Sottili in cui alcune cellule sono cresciute l'una sull'altra, rendendo difficile risalire con precisione alla loro storia e misurare correttamente i loro livelli di fluorescenza. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare con successo un campione microscopico per la microscopia time-lapse e di come eseguire una microscopia a fluorescenza time-lapse. Sperimenta con le celle BACE.