Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

Questo manoscritto descrive i metodi per l'induzione e il punteggio del modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE), insieme alla valutazione della distribuzione delle cellule immunitarie e dei livelli di citochine mRNA nei linfonodi, nella milza, nel sangue e nel midollo spinale utilizzando la citometria a flusso e la PCR quantitativa, rispettivamente, in varie fasi della malattia.

L'obiettivo generale del modello sperimentale di encefalomielite autoimmune o EAE, è quello di facilitare lo studio dei potenziali meccanismi molecolari alla base dello sviluppo della sclerosi multipla. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della sclerosi multipla, come ad esempio, in quale fase della malattia le cellule immunitarie si infiltrano nel sistema nervoso centrale? Il vantaggio principale di questa tecnica è che il modello EAE imita molte delle principali caratteristiche della sclerosi multipla, come la demielinizzazione e l'infiltrazione delle cellule immunitarie.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia della sclerosi multipla perché i farmaci testati con questo metodo sono già stati approvati per questa malattia. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avrebbero difficoltà perché ci sono condizioni approfondite che devono essere prese in considerazione quando si induce l'EAE. I topi devono essere tenuti in un ambiente privo di stress e una tossina della pertosse deve essere preparata al momento.

La dimostrazione ufficiale di questo metodo è fondamentale in quanto l'isolamento dei linfonodi e l'estrazione del midollo spinale sono difficili da apprendere solo con la descrizione. Inizia iniettando per via sottocutanea topi femmina di 10-13 settimane con 200 microgrammi di glicoproteina oligodendrocitaria mielina. emulsionato in 200 microlitri di coadiuvante completo di Freund, contenente 400 microgrammi di Mycobacterium tuberculosis.

Immediatamente e 24 ore dopo, iniettare intraperitonealmente nei topi 0,2 microgrammi di tossina della pertosse in 200 microlitri di PBS. È essenziale che i topi siano stati adattati sia alla manipolazione che all'ambiente sperimentale prima dell'induzione dell'EAE verso l'induzione di stress che può prevenire lo sviluppo di sintomi clinici. Una settimana dopo l'iniezione, esaminare i topi ogni giorno per i sintomi clinici come descritto nella tabella.

Per valutare la popolazione di cellule immunitarie linfonodali indotta da EAE, al momento opportuno dopo l'induzione, bagnare l'area dell'incisione con l'80% di isopropanolo e rimuovere con cura la pelle sopra la regione dell'anca. Usando una pinza, rimuovere con cura il linfonodo inguinale dal tessuto adiposo. Quindi pesare il nodo e posizionare il campione in PBS sul ghiaccio.

Per analizzare le cellule del midollo spinale, bagnare la parte posteriore dell'animale con isopropanolo e utilizzare un bisturi per eseguire un taglio longitudinale lungo la colonna vertebrale. Quindi rimuovere la pelle e sezionare la parte lombare della colonna vertebrale, innervando gli arti posteriori. Sciacquare la colonna vertebrale con una siringa riempita di PBS per estrarre il midollo spinale.

Dopo aver rimosso circa 1/3 del midollo lombare, pesare il frammento spinale e conservare il tessuto in PBS su ghiaccio. Per analizzare la popolazione di cellule immunitarie spleniche, aprire il tessuto per accedere alla parte inferiore dell'addome. Quindi, rimuovere la milza e tagliare circa 1/8 del tessuto.

Pesare il frammento di milza e conservare il tessuto in PBS su ghiaccio. Quindi utilizzare lo stantuffo di una siringa da due ml per macerare il resto del tessuto attraverso un setaccio a maglie da 70 micron su un tubo da 50 millilitri, seguito da un lavaggio PBS da cinque millilitri del colino. Centrifugare le celle filtrate.

Risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone di lisi cellulare e trasferire le cellule in una provetta da 1,5 millilitri. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, lavare le cellule due volte in 500 microlitri di PBS. Dopo il secondo lavaggio, risospendere il pellet in 100 microlitri di 0,2% BSA in PBS e aggiungere due microlitri di recettore Fc un tampone bloccante alle cellule.

Dopo 15 minuti al buio a temperatura ambiente, etichettare le cellule con 13 microlitri di cocktail di anticorpi per altri 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule almeno due volte in 500 microlitri di PBS, e risospendere il pellet finale in 500 microlitri di PBS fresco. Quindi trasferire le cellule in una provetta per citometria a flusso su ghiaccio.

Infine, per analizzare i campioni mediante citometria a flusso, direttamente prima della misurazione della citometria a flusso, aggiungere 30 microlitri di conta assoluta citofluorimetrica standard alle cellule per determinare la conta cellulare assoluta. Quindi analizzare i campioni sul citometro a flusso. Come illustra questa figura, durante la fase acuta dell'induzione dell'EAE si osserva un aumento transitorio di tutte le popolazioni di cellule immunitarie all'interno dei linfonodi.

Nella milza, tuttavia, solo i macrofagi, le cellule B, le cellule T e i neutrofili dimostrano un aumento dell'infiltrazione. Nel sangue, tutte le popolazioni di cellule immunitarie dimostrano un aumento transitorio della loro circolazione periferica durante la fase preclinica che corrisponde a un simile aumento dipendente dalla malattia nel midollo spinale lombare durante la fase acuta della malattia, escludendo la popolazione di monociti, che presumibilmente si differenzia in macrofagi dopo l'ingresso nel midollo spinale. Qui viene mostrata la strategia di gating per la valutazione delle diverse popolazioni cellulari.

Il numero di cellule è correlato alla quantità di tessuto o al volume di sangue analizzato, riflettendo la conta cellulare assoluta. Nei linfonodi, l'espressione dell'mRNA di IL-23 è aumentata durante la fase preclinica, mentre l'espressione di IL-6 aumenta in modo dipendente dalla malattia. Nella milza, l'espressione di IL-6 e IL-23 aumenta nella fase preclinica, mentre l'espressione dell'mRNA beta di IL-1 non è influenzata fino all'insorgenza della malattia.

Nel sangue, l'espressione del solo mRNA del TNF-alfa è sovraregolata e dipendente dalla malattia. Nel midollo spinale lombare, il TNF-alfa, l'IL-1 beta e l'interferone gamma sono indotti durante la fase acuta, mentre l'IL-6 è sovraregolata solo durante la fase di insorgenza della malattia. Una volta padroneggiato, il modello EAE, il successivo isolamento cellulare e l'analisi degli effetti possono essere completati in otto ore per dieci topi, se eseguiti correttamente.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il Western Blot o l'ELISA per confermare i risultati dell'analisi dell'espressione dell'mRNA. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della sclerosi multipla per esplorare il meccanismo della demielinizzazione nel sistema nervoso centrale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre il modello EAE e di come isolare le cellule immunitarie per ottenere risultati riproducibili della citometria a flusso.

Non dimenticare che lavorare con l'adiuvante completo di Freund può essere estremamente pericoloso e aggiungere precauzioni come sollevare la pelle del topo e garantire la completa penetrazione della pelle dalla siringa durante l'esecuzione di questa procedura.