Name: Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Impara a indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e a valutare la distribuzione delle cellule immunitarie nei tessuti mediante citometria a flusso e PCR quantitativa per studiare la sclerosi multipla.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Else Kröner-Fresenius (EKFS) Research Training Group Translational Research Innovation - Pharma (TRIP) e dal "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung" dello Stato dell'Assia.

ETICA DICHIARAZIONE: Le nostre procedure sperimentali sono approvati dal Comitato Etico del Regierungspräsidium Darmstadt (Germania) e confermare le normative nazionali ed europee. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza degli animali e ridurre il numero di animali utilizzati. 1. EAE Modello <ol><li> Induzione del modello EAE <ol><li> Utilizzare 10- a 13 settimane di età femminile 129S4 / SvJae × C57BL / 6 topi per l&#39;induzione di EAE. </li><li> Dare i topi una iniezione sottocutanea, nella parte superiore e inferiore della schiena, del encefalitogenico MOG 35 - peptide 55 (mielina oligodendrociti glicoproteina) (200 mg), emulsionato in 200 ml completa adiuvante Freund`s (CFA) contenente 400 mg Mycobacterium tuberculosis. Nota: Come un negativo, il controllo sham non-malattia inducono, adiuvante incompleto di Freund contenente Mycobacterium tuberculosis, nello stesso volume e per la stessa via, può essere utilizzato. </li><li> therEDopo, e ancora 24 ore dopo, invia i topi un&#39;iniezione intraperitoneale di tossina della pertosse (in totale 0,2 mg, diluito in 200 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato, PBS). Utilizzare topi non trattati come gruppo di controllo, per poter confrontare malata con animali sani. Nota: È anche possibile indurre EAE da 200 - 300 mg MOG 35 - 55 peptide 300 - 500 mg di Mycobacterium tuberculosis in CFA e 0.2 - 0.3 mg tossina della pertosse in un volume di 0,1 - 0,2 ml per iniezione. </li><li> Inizio una settimana dopo l&#39;iniezione, esaminare i topi al giorno per sintomi clinici (vedere il punto 1.2.1) Nota: Il giorno di esordio della malattia varia nelle diverse esperienze, ma alle condizioni nel nostro laboratorio, questo è di circa 11 giorni e, quindi, qui il giorno 14 è definito come 3 giorni dopo l&#39;insorgenza della malattia. Tutti i topi in questo studio hanno sviluppato sintomi clinici. </li></ol></li><li> Punteggio dei topi <ol><li> Classificare i sintomi clinici di punteggi clinici come segue:0) che nessun indizio, 0.5) la paralisi distale della coda, 1) paralisi completa della coda, 1.5) coda molle e lieve debolezza degli arti posteriori, 2) di coda molle e grave debolezza delle zampe posteriori, 2.5) coda zoppicare e paralisi di una zampa posteriore, 3) la coda zoppicare e paralisi di entrambe le zampe posteriori, 3.5) la paralisi di entrambi gli arti posteriori e la debolezza di un arto anteriore (topi che hanno raggiunto questo punteggio sono stati eutanasia, in sintonia con le linee guida etiche locali). </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di singole cellule per l&#39;analisi Citometria a Flusso Nota: La miscela di anticorpi è composto da 1 ml CD45-Vioblue, 2 ml CD8-eFluor650, 0,5 ml CD11b-eFluor605, 0,5 ml F4 / 80-PE-Cy7, 1 ml CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0.5 ml CD11c -AlexaFluor700, 1 ml CD19-APC-H7 e 1 ml Ly6G-APC-Cy7. Nota: Se si prende il sangue, linfonodi, milza e il midollo spinale allora la procedura è la seguente: I topi sono profondamente anestetizzati con una combinazione di isoflUrane (2% in carbogeno al minuto) e ketamina (100 mg / kg di peso corporeo). Successivo aprire il torace, rimuovere il sangue con un bastone intracardial e profumato topi intracardiaca con PBS freddo. Quindi rimuovere i linfonodi seguita da milza e, infine, il midollo spinale. Se non c&#39;è bisogno di perfusione topi intracardiaca poi eutanasia i topi sotto anestesia profonda per la lussazione del collo. <ol><li> Isolamento di splenociti <ol><li> Anestetizzare topi con una combinazione di isoflurano (2% in carbogeno al minuto) e ketamina (100 mg / kg di peso corporeo). </li><li> zona di incisione bagnato con 80% di isopropanolo per evitare qualsiasi contaminazione con peli e aprire il torace longitudinale, senza puntura tessuti più profondi, con le forbici. </li><li> Profumato topi intracardiaca con PBS freddo pH 7,0 23. Nota: La milza si trova nella sinistra quadrante addominale superiore sotto la gabbia toracica. Se solo la milza è da studiare, tale organo può essere rimosso prima di perfusione per retain tutti i tipi di cellule di interesse. </li><li> Rimuovere la milza e tagliare circa 1/8 e si pesa. Conservare il campione in PBS in ghiaccio. </li><li> Comprimere il tessuto della milza attraverso un setaccio con maglie di 70 micron (posto sopra un tubo da 50 ml), con lo stantuffo di una siringa 2 ml. </li><li> Lavare la rete con 5 ml di PBS. Centrifugare a 1.800 xg per 3 min. Risospendere il pellet in 500 ml Soluzione di Lisi. Nota: A questo punto, può essere necessario effettuare un conteggio cella differenziale se, successivamente, un metodo di analisi FACS alternativa viene utilizzata che non utilizza perline (vedi punto 3). </li><li> Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) e aggiungere 500 microlitri di PBS. Centrifugare per 6 minuti a 650 xg a temperatura ambiente (RT). </li><li> Ripetere la fase di lavaggio con 500 microlitri di PBS. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 100 ml 0,2% di albumina sierica bovina (BSA) / PBS, aggiungere 2 ml Fc recettore-1 (FcRI) tampone bloccante e incubare per 15 min a RT al buio. </li><li> Aggiungere 13 ml unmiscela tibody, incubare 15 minuti a temperatura ambiente al buio, aggiungere 500 microlitri di PBS e centrifugare per 6 minuti a 650 xg a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante. Nota: procedura di colorazione del produttore consiglia un lavaggio singolo, ma ulteriore riduzione della colorazione di fondo può essere ottenuto opzionalmente ripetere la fase di lavaggio di una o due volte. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri PBS (o, eventualmente, tampone di corsa per la separazione delle proteine, per ridurre potenzialmente aggregazione delle cellule) e trasferire alla citometria a flusso tubo. Mantenere le cellule in ghiaccio. </li></ol></li><li> L&#39;isolamento di cellule dei linfonodi <ol><li> Anestetizzare topi con una combinazione di isoflurano (2% in carbogeno al minuto) e ketamina (100 mg / kg di peso corporeo). </li><li> zona di incisione bagnato con 80% di isopropanolo e aprire il torace longitudinalmente con le forbici. Profumato topi intracardiaca con PBS freddo pH 7,0 23. </li><li> Per isolare il linfonodo inguinale rimuovere con attenzione la pelle nella regione del hip e scegliere il linfonodo con attenzione fuori dal tessuto adiposo con una pinza. Pesare il linfonodo inguinale e conservare il campione in PBS in ghiaccio. Nota: Abbiamo usato linfonodi inguinali nei nostri studi, perché O`Connor et al. hanno scoperto che un numero elevato di monociti attivati, macrofagi, neutrofili e linfociti T erano tutti presenti nei linfonodi inguinali dopo EAE induzione 24. </li><li> Premere il linfonodo attraverso un setaccio di 70 micron (posto sopra un tubo da 50 ml) utilizzando lo stantuffo di una siringa 2 ml. </li><li> Lavare la rete con 5 ml di PBS. Centrifugare a 2.400 g per 8 minuti. Risospendere il pellet di cellule in 100 microlitri 0,2% BSA / PBS, aggiungere 2 microlitri FcRI tampone bloccante e incubare per 15 min a RT al buio. </li><li> Aggiungere 13 microlitri miscela di anticorpi, incubare 15 min a RT al buio, aggiungere 500 microlitri di PBS e centrifugare per 6 minuti a 650 xga RT. </li><li> Eliminare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 300 l di PBS (o di un buffer di esecuzione adatto) e trasferirload un tubo citometria di flusso. </li></ol></li><li> Isolamento di cellule del sangue <ol><li> Aggiungere 50 ml di 20 mM HEPES a 50 microlitri di sangue (stabilizzato con EDTA) e aggiungere 500 microlitri Soluzione di Lisi. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e aggiungere 500 microlitri di PBS. Centrifugare per 6 minuti a 650 xg a temperatura ambiente. Gettare il surnatante e ripetere la fase di lavaggio. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 100 microlitri 0,2% BSA / PBS, aggiungere 2 microlitri FcRI tampone bloccante e incubare per 15 min a RT al buio. </li><li> Aggiungere 13 microlitri miscela di anticorpi, incubare 15 min a RT al buio, aggiungere 500 microlitri di PBS e centrifugare per 6 minuti a 650 xga RT. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 300 ml di PBS e trasferirlo alla citometria a flusso tubo. </li></ol></li><li> L&#39;isolamento di cellule del midollo spinale <ol><li> Anestetizzare topi con una combinazione di isoflurano (2% in carbogeno al minuto) e ketamina (100 mg / kg di peso corporeo). </li><li> zona di incisione bagnato con 80% di isopropanolo e aprire il torace longitudinalmentecon le forbici. Profumato topi intracardiaca con PBS freddo pH 7,0 23. </li><li> Bagnare l&#39;area di incisione sulla schiena e rendere nuovamente un taglio longitudinale con un bisturi e rimuovere la pelle. </li><li> Tagliare la parte lombare della colonna vertebrale (che innerva gli arti posteriori) e lavare con una siringa PBS-riempita per estrarre il midollo spinale. Tagliare circa 1/3 del cavo lombare valutare questo e conservare il campione in PBS in ghiaccio. </li><li> Centrifugare a 250 xg per 2 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante, aggiungere 500 microlitri soluzione di distacco delle cellule e HBSS (1: 1). Aggiungere 3 mg / ml di collagenasi A e 1 unità / ml DNasi I, decollate le cellule ripetuta su e giù pipettaggio e incubare per 30 minuti con agitazione a 37 ° C a 400 rpm. Nota: Se preferito, la sospensione cellulare può essere cancellato di contaminare mielina e detriti cellulari dal gradiente di densità centrifugazione che possono migliorare la sensibilità della citometria a flusso misura, quindi, riducendo bassa autofluorescenza und il numero di eventi che devono essere acquisiti (vedi paragrafo 3.5). </li><li> Centrifugare a 250 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 1 ml 10% di vitello siero fetale (FCS) / medio Dulbecco minimo essenziale (DMEM) e decollate le cellule nuovamente ripetuto su e giù pipettaggio. </li><li> Centrifugare a 250 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Ripetere la fase di lavaggio. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS e spremere il midollo spinale attraverso un setaccio con maglie di 70 micron (posto sopra un tubo da 50 ml) utilizzando lo stantuffo di una siringa 2 ml. </li><li> Lavare la maglia con 4 ml di PBS. Centrifugare a 1.800 xg per 3 min a RT. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 100 ml 0,2% BSA / PBS, aggiungere 2 ml di reagente FcRI blocco e incubare per 15 min a RT al buio. </li><li> Aggiungere 13 microlitri miscela di anticorpi, incubare 15 min a RT al buio, aggiungere 500 microlitri di PBS e centrifugare per 6 minuti a 650 xga RT. </li><li> Eliminare il surnatante, risospendere il pelle delle cellulet in 500 microlitri di PBS (o un tampone di corsa adatto) e trasferirlo al flusso citometria tubo. </li></ol></li></ol> 3. analisi di citometria di flusso <ol><li> Titolare tutti gli anticorpi in anticipo per determinare le concentrazioni ottimali come descritto da Olesch et al. 25. </li><li> Utilizzare sfere di compensazione anticorpi di cattura per la compensazione singolo colore per creare matrici di compensazione multi-colore in base alle istruzioni del fornitore. </li><li> Controllare la calibrazione dello strumento quotidiano utilizzando perline specifici secondo le istruzioni del fornitore. </li><li> Direttamente prima della citometria a flusso di misura, aggiungere 30 ml di citometria di flusso conta assoluta standard per le celle (per l&#39;isolamento vedere la sezione 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) per determinare conta assoluta delle cellule. Invece di utilizzare il conteggio sfere le cellule possono essere contate. </li><li> Raccogliere campioni (cellule di milza, linfonodi e sangue: 100.000 eventi, midollo spinale: 500.000 eventi) in un citofluorimetro unND analizzare utilizzando un software specifico citometria a flusso. <ol><li> Aprire il software citometria a flusso e aggiungere FCS file 3.0 premendo il pulsante &quot;aggiungi campioni&quot;. </li><li> Aprire il file aggiunto con un doppio clic. Regolare i canali per gli assi X e Y. Per selezionare le popolazioni cellulari di interesse creano un cancello (vedi Figura 4). </li></ol></li></ol> 4. Analisi quantitativa PCR <ol><li> Isolamento di mRNA e trascrizione in cDNA <ol><li> Estrarre il mRNA dal midollo spinale lombare (1/3), la milza (1/8) e linfonodi inguinali da fenolo-cloroformio e precipitato con etanolo 26. <ol><li> Per questo, omogeneizzare il tessuto in 1 ml guanidinio miscela tiocianato-fenolo, incubare per 10 min. Aggiungere 200 ml di cloroformio e incubare ancora per 10 min. </li><li> Dopo una fase di centrifugazione (18.000 xg per 15 min a 4 ° C), lavare la fase acquosa superiore è di 500 microlitri isopropanolo e centrifugare (18.000 xg per 8 minuti a 4° C). </li><li> Lavare il pellet con 500 microlitri di etanolo e, dopo una fase di centrifugazione (18.000 xg per 5 minuti a 4 ° C), asciugare il pellet nel concentratore a vuoto (5 min a 30 ° C). Successivamente, risospendere il pellet in 30 microlitri di acqua. </li></ol></li><li> Per estrarre l&#39;mRNA dal sangue, centrifuga 500 microlitri di sangue EDTA-stabilizzato (300 xg 10 min 4 ° C). <ol><li> Prendere il buffy coat, contenente cellule bianche del sangue, e diluire in 1 ml di soluzione di lisi (150 mm NH 4 Cl, 100 mM NaHCO 3, 0.1 mM Na-EDTA pH 7.4). </li><li> Dopo 10 min di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare le cellule a 650 xg per 6 minuti e poi lavare due volte con PBS. </li><li> Estrarre il mRNA da globuli bianchi (WBC) utilizzando un kit per l&#39;estrazione di RNA in base alle istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Eseguire la sintesi del DNA utilizzando un kit per la sintesi del DNA compreso esameri casuali in base alle istruzioni del produttore. Utilizzare 200 ng mRNA per il CDNUna sintesi. </li></ol></li><li> PCR quantitativa <ol><li> Per quantificare la quantità di un mRNA specifico, utilizzare 1 ml di cDNA, 1 micron di primer avanti / indietro e un DNA colorante fluorescente vincolante secondo le istruzioni del produttore 27. Vedere la Tabella 1 per le sequenze per le coppie di primer. Misurare CT-valori di IL-1β, IL-6, IL-23, IFNγ, TNF e PPIA (peptidyl prolil isomerasi) utilizzando un sistema di PCR quantitativa. </li><li> Per determinare l&#39;espressione di mRNA relativa utilizzare il metodo comparativo 27 CT (soglia ciclo). <ol><li> Per questo, normalizzare CT-valori dei geni bersaglio ai livelli di espressione di PPIA sottraendo il CT-valore medio PPIA dal gene bersaglio, come descritto in studi precedenti (Barthelmes et al. 28, Schiffmann et al. 29, Schiffmann et al. 30). Successivamente, calcolare i cosiddetti ΔΔCT valori, con il quale, a normalizzare i ΔCT valoridei geni bersaglio da topi EAE al livello di espressione dei geni bersaglio di topi non trattati, sempre sottraendo il ΔCT valore medio nei topi non trattati dal ΔCT valore in topi EAE. </li><li> Per ottenere l&#39;espressione mRNA relativa del gene bersaglio, calcolare il rapporto utilizzando la seguente formula: 2 - ΔΔct. </li></ol></li></ol></li><li> Testare la specificità di ciascun primer. Determinare la dimensione del frammento amplificato utilizzando un gel di agarosio al 2% 31. La dimensione del frammento è mostrato nella tabella 1. </li></ol>

MJP è consulente di Xellia e Leo Pharmaceuticals.

Il modello di EAE qui descritto ha ricevuto la massima attenzione come modello di SM ed è abitualmente utilizzato in fase di test strategie terapeutiche per la SM 32. La malattia del mouse presenta molte caratteristiche cliniche e istologiche della SM ed è causata dall&#39;induzione di autoimmunità agli antigeni neuronali. La sensibilizzazione agli antigeni della mielina è associata con il cervello di sangue barriera erettile e in tal modo, l&#39;infiltrazione di cellule immunitarie nel sistema nervoso centra...

La sclerosi multipla (MS) e il corrispondente modello animale, l&#39;encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), mostrano variazioni neuroinfiammazione autoimmuni del sistema nervoso centrale (CNS). All&#39;inizio lesioni della SM e EAE attivi sono caratterizzati dalla presenza di cellule immunitarie infiltrate. L&#39;eziologia della SM rimane sconosciuta, ma è ampiamente considerato di coinvolgere la distruzione della mielina mediata dalle cellule T autoreattivi. Queste cellule T autoreattive secernono citochine pro-infiammatorie e chemochine che attraggono altre cellule del sistema immunitario come le cellule B, monociti e neutrofili dalla circolazione. I monociti differenziano in macrofagi. L&#39;interferone gamma (IFNγ) secreto da cellule T autoreattive polarizza i macrofagi in macrofagi pro-infiammatorie. Le citochine macrofagi rilascio pro-infiammatorie e specie reattive dell&#39;ossigeno che promuovono l&#39;apoptosi in oligodendrociti. La morte degli oligodendrociti porta a demielinizzazione. Inoltre, le cellule B si differenziano in pcellule LASMA e autoanticorpi rilascio contro la guaina mielinica, che si traduce nella degradazione della mielina. La perdita di mielina porta alla degradazione degli assoni e neuroni e quindi alla formazione di siti di lesione del SNC che rappresentano la caratteristica principale del MS 1. In periferia, cellule T e cellule B sono attivati ​​nei linfonodi, proliferano nella milza e migrano attraverso la circolazione nel sistema nervoso centrale. I monociti e neutrofili proliferano nel midollo osseo e migrano anche attraverso la circolazione nel sistema nervoso centrale. Leucociti stravaso da midollo osseo, milza e nei linfonodi nel sangue o dal flusso sanguigno nel SNC è un processo multifasico che dipende da diversi fattori, comprese le interazioni molecolari tra leucociti e endotelio mediata da chemochine e recettori per chemochine. La produzione di chemochine da vari tipi di cellule può essere indotta durante la reactio immunitarion dalle citochine come il fattore di necrosi tumorale-α (TNF), IFNγ e interleuchina-6 (IL-6), che recluta successivamente le cellule immunitarie al sito di infiammazione 2,3. Le cellule immunitarie presentano un sottoinsieme di recettori per chemochine sulla loro superficie, a seconda del tipo di cellula e percorso migrazione al sito infiammatorio. Così, CXCR2, CCR1 e CXCR1 sono espressi su neutrofili maturi nel midollo osseo e sangue 4, e vincolante dei suoi ligandi, CXCL2, CCL5 o CXCL6 rispettivamente, attiva neutrofili e promuove la loro adesione all&#39;endotelio e successivamente, la migrazione delle cellule nei tessuti 5-9. CCL2 e CCL20 attirare monociti e cellule Th1 / Th17 10, che esprimono CCR2 11 e CCR6 12, rispettivamente. CCR1 e CCR5, espressa da diversi tipi di cellule, comprese le cellule T, monociti e macrofagi 13, legare CCL3, CCL5 e CCL7 e sono upregulated durante MS 14. CXCR3 è espresso sulle cellule T e lega CCL9, CCL10 eCCL11 15. Una strategia principale nel trattamento SM è la deplezione di cellule immunitarie o la prevenzione di infiltrazione di cellule immunitarie nel SNC. Pertanto, il blocco dei recettori per chemochine specifiche è stato studiato in EAE. Antagonismo o delezione genetica di CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 o 19 CXCR2 riduce EAE patologia, mentre l&#39;antagonismo o delezione genetica di CCR1 20, CCR5 20 o CXCR3 21 non hanno ridotto la patologia. Quindi, l&#39;espressione di recettori per chemochine specifiche sui leucociti è cruciale per l&#39;infiltrazione di quest&#39;ultimo nel sistema nervoso centrale e detta corso di EAE. La deplezione di cellule immunitarie è una strategia di trattamento efficace per i pazienti SM, perché le cellule immunitarie infiltrate rilasciano citochine, quali TNF, IL-6 e IL-1β, che, a sua volta, promuovere il processo infiammatorio o la degradazione dei neuroni 22. Inoltre, auto-cellule Th1 reattive rilasciano IFNγ, che a sua volta stimola i macrofagi a rilasciare TNFa, IL-1β e IL-23. Questo manoscritto descrive l&#39;induzione di EAE, la determinazione della distribuzione delle cellule immunitarie ei livelli di citochine (mRNA) in vari tessuti in topi EAE. Le cellule sono state isolate in diversi momenti durante il corso della malattia per fornire una panoramica tempo-dipendente dei processi infiammatori che alla fine portano alla formazione di lesioni nel SNC.

<table><tbody><tr><td>Sistema di rilevamento di sequenza ABI Prism 7500&nbsp;</td><td>Applied Biosystems, Austin, USA</td><td></td><td>sistema di PCR quantitativa</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich Monaco di Baviera, Germania</td> Soluzione <td>di distacco cellulare</td><td>A6964</td></tr><tr><td>CD3-PE-CF594</td><td>BD, Heidelberg, Germania</td><td>562286</td><td></td></tr><tr><td>CD4-V500</td><td>BD, Heidelberg, Germania</td><td>560782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-eFluor650</td><td>eBioscience, Francoforte, Germania</td><td>95-0081-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-eFluor605</td><td>eBioscience, Francoforte, Germania</td><td>93-0112-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-AlexaFluor700</td><td>BD, Heidelberg, Germania</td><td>560583</td><td></td></tr><tr><td>CD19-APC-H7&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germania</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD45-Vioblue&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania</td><td>130-092-910</td><td></td></tr><tr><td>CompBeads</td><td>BD, Heidelberg, Germania</td><td>552843</td><td>perline di compensazione</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Sigma Aldrich Monaco, Germania</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Standard citometrico di conteggio assoluto&nbsp;</td><td>Polyscience, Eppelheim, Germania</td><td>BLI-580-10</td><td></td></tr><tr><td>Citometro Impostazione e Tracciamento delle perline&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germania</td><td>642412</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich Monaco di Baviera, Germania</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>EAE Kit</td><td>Hooke Laboratories, Lawrence, USA</td><td>EK2110</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE-Cy7&nbsp;</td><td>BioLegend, Fell, Germania</td><td>123114</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi del cDNA del primo filamento&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germania</td><td>K1612</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di blocco del recettore Fc-1</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Conteggio assoluto citofluorimetrico standard</td><td>Polyscience, Eppelheim, Germania</td><td>580</td><td></td></tr><tr><td>Software FlowJo v10&nbsp;</td><td>Treestar, Ashland, USA</td><td></td><td>software per citometria a flusso</td></tr><tr><td>LSRII/Fortessa&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germania</td><td></td><td>citometro a flusso</td></tr><tr><td>Ly6G-APC-Cy7&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germania</td><td>560600</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di lisi&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germania</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Maxima SYBR Green&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germania</td><td>K0221</td><td>colorante legante il DNA fluorescente&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit RNeasy Mini&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Germania</td> Kit di <td>estrazione dell'RNA</td> <td>74104</td></tr></tbody></table>

induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

La sclerosi multipla si presume essere una malattia autoimmune infiammatoria, che è caratterizzato dalla formazione di lesione al sistema nervoso centrale (CNS) con conseguente deterioramento cognitivo e motorio. Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di SM utile, perché è anche caratterizzata dalla formazione della lesione del sistema nervoso centrale, disabilità motoria ed è guidato anche da reazioni autoimmunitarie e infiammatorie. Uno dei modelli EAE viene indotta con un peptide derivato dalla proteina mielina oligodendrociti (MOG) 35-55 nei topi. I topi EAE sviluppare un corso di malattia progressiva. Il corso è suddiviso in tre fasi: la fase preclinica (giorno 0 - 9), l&#39;insorgenza della malattia (giorno 10 - 11) e la fase acuta (giorno 12 - 14). MS e EAE sono indotti da cellule T autoreattivi che si infiltrano il sistema nervoso centrale. Queste cellule T secernono chemochine e citochine che portano al reclutamento di ulteriori cellule immunitarie. Pertanto, la distribuzione di cellule immunitarie nel midollo spinale durante le tre fasi della malattia è stata studiata. Per evidenziare il punto di tempo della malattia in cui inizia l&#39;attivazione / la proliferazione / accumulo di cellule T, cellule B e monociti, la distribuzione delle cellule immunitarie nei linfonodi, la milza e il sangue è stato anche valutato. Inoltre, i livelli di diverse citochine (IL-1b, IL-6, IL-23, TNFa, IFNγ) nelle tre fasi di malattia sono stati determinati, al fine di conoscere i processi infiammatori della malattia. In conclusione, i dati forniscono una panoramica del profilo funzionale delle cellule immunitarie durante EAE patologia.

La figura 1 fornisce una panoramica schematica dei diversi metodi descritti in questo articolo. 1) Topi riceve un&#39;iniezione di MOG 35-55 antigene e sviluppare sintomi clinici iniziali dopo 10,7 ± 0,3 giorni 28. Un corso rappresentante della malattia di topi EAE è mostrato in Figura 1. 2) vari tessuti (milza, linfonodi, midollo spinale lombare) e il sangue sono estratti da topi di controllo e EAE...

Questo manoscritto descrive i metodi per l'induzione e il punteggio del modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE), insieme alla valutazione della distribuzione delle cellule immunitarie e dei livelli di citochine mRNA nei linfonodi, nella milza, nel sangue e nel midollo spinale utilizzando la citometria a flusso e la PCR quantitativa, rispettivamente, in varie fasi della malattia.

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

L'obiettivo generale del modello di encefalomielite autoimmune sperimentale, o EAE, è facilitare lo studio dei potenziali meccanismi molecolari alla base dello sviluppo della sclerosi multipla. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della sclerosi multipla, ad esempio: in quale fase della malattia le cellule immunitarie infiltrano il sistema nervoso centrale? Il principale vantaggio di questa tecnica è che il modello EAE riproduce molte delle caratteristiche principali della sclerosi multipla, come la demielinizzazione e l'infiltrazione delle cellule immunitarie.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della sclerosi multipla poiché i farmaci testati con questo metodo sono già stati approvati per questa malattia. In generale, le persone nuove a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà perché vi sono condizioni rigorose da prendere in considerazione durante l'induzione di EAE. I topi devono essere mantenuti in un ambiente privo di stress e la tossina della pertosse deve essere preparata fresca.La dimostrazione ufficiale di questo metodo è fondamentale poiché l'isolamento dei linfonodi ed il prelievo del midollo spinale sono difficili da apprendere sulla base di una semplice descrizione. Iniziare iniettando sottocute in topi femmina di età compresa tra 10 e 13 settimane 200 microgrammi di glicoproteina mielinica oligodendrocitaria, emulsionati in 200 microlitri di adiuvante completo di Freund, contenente 400 microgrammi di Mycobacterium tuberculosis.Immediatamente e 24 ore dopo, iniettare intraperitonealmente nei topi 0,2 microgrammi di tossina della pertosse in 200 microlitri di PBS. È essenziale che i topi siano stati adattati sia al manipolamento sia all'ambiente sperimentale prima dell'induzione dell'EAE, al fine di ridurre lo stress che potrebbe impedire lo sviluppo dei sintomi clinici. Una settimana dopo l'iniezione, esaminare i topi quotidianamente per i sintomi clinici come descritto nella tabella.Per valutare la popolazione di cellule immunitarie nei linfonodi indotta da EAE, al tempo appropriato dopo l'induzione, inumidire l'area dell'incisione con isopropanolo all'80% e rimuovere con attenzione la pelle nella regione dell'anca. Utilizzando pinzette, estrarre con cura il linfonodo inguinale dal tessuto adiposo. Successivamente, pesare il linfonodo e posizionare il campione in PBS su ghiaccio.Per analizzare le cellule del midollo spinale, inumidire la schiena dell'animale con isopropanolo ed eseguire un taglio longitudinale lungo la spina con un bisturi. Rimuovere quindi la pelle ed estrarre la porzione lombare della spina, che innerva gli arti posteriori. Lavare la spina con una siringa riempita di PBS per estrarre il midollo spinale.Dopo aver rimosso circa 1/3 del midollo lombare, pesare il frammento spinale e conservare il tessuto in PBS su ghiaccio. Per analizzare la popolazione di cellule immunitarie spleniche, aprire il tessuto per accedere alla parte inferiore dell'addome. Successivamente, rimuovere la milza e asportare circa 1/8 del tessuto.Pesare il frammento di milza e conservare il tessuto in PBS su ghiaccio. Quindi utilizzare lo stantuffo di una siringa da due mL per macerare il resto del tessuto attraverso un setaccio con maglia da 70 micron posizionato su un tubo da 50 millilitri, seguito da un lavaggio del setaccio con cinque millilitri di PBS. Centrifugare le cellule filtrate.Risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone per la lisi cellulare e trasferire le cellule in una provetta da 1,5 millilitro. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, lavare le cellule due volte in 500 microlitri di PBS. Dopo il secondo lavaggio, risospendere il pellet in 100 microlitri di BSA 0,2% in PBS e aggiungere due microlitri di tampone bloccante per il recettore Fc uno alle cellule.Dopo 15 minuti al buio a temperatura ambiente, etichettare le cellule con 13 microlitri di cocktail di anticorpi per altri 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule almeno due volte in 500 microlitri di PBS e risospendere il pellet finale in 500 microlitri di PBS fresco. Successivamente, trasferire le cellule in un tubo per citometria a flusso su ghiaccio.Infine, per analizzare i campioni mediante citometria a flusso, aggiungere direttamente prima della misurazione 30 microlitri di standard per il conteggio assoluto in citometria a flusso alle cellule, al fine di determinare il numero assoluto di cellule. Successivamente, analizzare i campioni sul citometro a flusso. Come illustrato in questa figura, si osserva un aumento transitorio di tutte le popolazioni di cellule immunitarie all'interno dei linfonodi durante la fase acuta dell'induzione di EAE.Nella milza, tuttavia, solo i macrofagi, le cellule B, le cellule T e i neutrofili mostrano un aumento dell'infiltrazione. Nel sangue, tutte le popolazioni di cellule immunitarie mostrano un aumento transitorio della loro circolazione periferica durante la fase preclinica, che corrisponde a un aumento simile dipendente dalla malattia nel midollo spinale lombare durante la fase acuta della malattia, esclusa la popolazione di monociti, che presumibilmente si differenzia in macrofagi dopo l'ingresso nel midollo spinale. Qui viene mostrata la strategia di gating per la valutazione delle diverse popolazioni cellulari.Il numero di cellule è correlato alla quantità di tessuto o volume ematico analizzato, riflettendo il conteggio assoluto delle cellule. Nei linfonodi, l'espressione dell'mRNA di IL-23 aumenta durante la fase pre-clinica, mentre l'espressione di IL-6 aumenta in modo dipendente dalla malattia. Nella milza, l'espressione di IL-6 e IL-23 aumenta nella fase pre-clinica, mentre l'espressione dell'mRNA di IL-1 beta non è alterata fino all'insorgenza della malattia.Nel sangue, l'espressione di soltanto il mRNA di TNF-alfa è aumentata e in maniera dipendente dalla malattia. Nel midollo spinale lombare, TNF-alfa, IL-1 beta e interferone gamma sono indotti durante la fase acuta, mentre IL-6 è aumentata soltanto durante la fase iniziale della malattia. Una volta padroneggiato, il modello EAE, l'isolamento cellulare successivo e l'analisi degli effetti possono essere completati in otto ore per dieci topi se eseguiti correttamente.Al termine di questa procedura, altri metodi come il Western Blot o l'ELISA possono essere eseguiti per confermare i risultati dell'analisi dell'espressione dell'mRNA. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della sclerosi multipla per esplorare il meccanismo della demielinizzazione nel sistema nervoso centrale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre il modello EAE e di come isolare le cellule immunitarie per ottenere risultati riproducibili mediante citometria a flusso.Non dimenticare che lavorare con l'adjuvante di Freund completo può essere estremamente pericoloso, e devono essere adottate precauzioni come sollevare la pelle del topo ed assicurare una completa penetrazione cutanea da parte della siringa durante l'esecuzione di questa procedura.

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Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti (Video) | JoVE Journal

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

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