La determinazione di soppressione del sistema immunitario contro il sistema nervoso centrale di protezione per farmacologici Interventi a demielinizzazione autoimmune

L'obiettivo generale di questo metodo concettuale è determinare se i trattamenti farmacologici per l'encefalomielite autoimmune sperimentale dimostrano la loro protezione del sistema nervoso centrale durante l'assalto dell'infiltrazione delle cellule immunitarie o come conseguenza della soppressione dell'infiltrazione delle cellule immunitarie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia neurale. Ad esempio, in che modo la manipolazione dei tempi di trattamento EAE differenzia gli effetti sull'infiltrazione delle cellule immunitarie rispetto alla protezione.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono anche verso la terapia della sclerosi multipla, poiché attualmente non esistono trattamenti neurali protettivi per questa malattia. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo scoperto che il trattamento dei topi EAE con un inibitore del sistema Xc-transporter era sia neuroprotettivo che immunomodulatore. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per studiare trattamenti farmacologici, può anche essere applicato a studi che utilizzano topi geneticamente knockout sottoposti a EAE o altre manipolazioni.

Inizia usando le forbici sterili per tritare il cervello e il midollo spinale dei singoli animali in piccoli pezzi. Quindi utilizzare uno stantuffo della siringa da tre millilitri per tessuto per schiacciare ogni campione su singoli filtri cellulari da 70 micron in singoli tubi conici da 50 millilitri, risciacquando i filtri con il terreno. Quando tutti i pezzi sono stati macerati, portare il volume finale nelle provette fino a 50 millilitri con terreno fresco, quindi centrifugare le sospensioni cellulari.

Risospendere ogni pellet in quattro millilitri di soluzione a gradiente di densità al 40%. Quindi stratificare con cura la cellula lentamente lungo le pareti di singole provette coniche da 15 millilitri sopra due millilitri di soluzione con gradiente di densità al 70% per provetta. Separare le cellule mediante centrifugazione e utilizzare pipette di trasferimento da un millilitro per scartare con cura gli strati di mielina superiore.

Successivamente, trasferire le cellule vitali dalle interfacce del campione in nuove provette coniche da 15 millilitri e lavare le cellule in un volume finale di 15 millilitri di terreno fresco per provetta. Risospendere i pellet in 200 microlitri di terreno fresco e trasferire le sospensioni cellulari in pozzetti individuali di una piastra di fondo rotonda da 96 pozzetti. Centrifugare la piastra e rimuovere i surnatanti.

Quindi, risospendere i pellet in 200 microlitri di terreno di restimolazione e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per quattro ore. Al termine dell'incubazione, centrifugare nuovamente la piastra e rimuovere i surnatanti. Quindi lavare le cellule in 200 microlitri di PBS integrato con il 2% di FCS e risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS integrato con il 2% di FCS e il blocco FC per 10-15 minuti su ghiaccio.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule come appena dimostrato e risospendere i pellet in 15 microlitri di cocktail di macchia sulla superficie cellulare per 15 minuti su ghiaccio. Quindi centrifugare le cellule e lavare i campioni due volte in 200 microlitri di PBS. Quindi, risospendere le cellule nei reagenti di colorazione del fattore di trascrizione FOXP3 secondo le istruzioni del produttore per 30 minuti per una notte a 4 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in 150 microlitri di tampone di permeabilizzazione. Quindi centrifugare le cellule e risospendere i pellet negli anticorpi intracellulari di interesse in 15 microlitri di tampone di permeabilizzazione su ghiaccio. Dopo 30 minuti, centrifugare le cellule e poi fare tre lavaggi in 200 microlitri di tampone di permeabilizzazione.

Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere i pellet in 200 microlitri di PBS e analizzare i campioni mediante citometria a flusso, gating sulle cellule vive CD4-positive, TCR beta-positive. È anche importante valutare la proliferazione delle cellule T periferiche perché i cambiamenti nella periferia possono influenzare l'infiltrazione delle cellule immunitarie nel SNC. Per quantificare il numero di astrociti e cellule gliali presenti nei campioni di tessuto del midollo spinale dopo l'induzione dell'EAE, ottenere immagini di ciascuna sezione con un ingrandimento di 4x e salvare le immagini come file TIFF.

Successivamente, in ImageJ, selezionare l'immagine di interesse e utilizzare lo strumento di selezione dei poligoni per tracciare l'intera sezione di tessuto spinale. Nel menu immagine, selezionare il tipo e 16 bit per convertire l'immagine in 16 bit. Quindi, apri il menu di processo e seleziona lo sfondo del soggetto per impostare il raggio della palla rotante almeno alla dimensione dell'oggetto più grande che non fa parte dello sfondo.

Controllare il paraboloide scorrevole e fare clic su OK. Quindi, in immagine, selezionare Regola e soglia e utilizzare le barre di scorrimento per impostare il livello di soglia inferiore. Per ottenere la percentuale dell'area con soglia all'interno dell'area selezionata, in Analizza e imposta misure, selezionare la frazione di area. Assicurarsi che il limite alla soglia sia deselezionato e che l'etichetta di visualizzazione sia selezionata, quindi fare clic su OK.To ottenere le misurazioni, in Analizza, selezionare misura.

Apparirà una finestra popup dei risultati. Salvare questi dati e confrontare i valori della frazione di area tra i gruppi di trattamento. Per quantificare la colorazione basica della mielina in base alla densità ottica, aprire l'immagine di interesse e utilizzare lo strumento sezioni poligonali per disegnare una regione di interesse all'interno del campione.

In Analizza e imposta misurazioni, selezionare il valore grigio medio e verificare che il limite alla soglia sia deselezionato e che l'etichetta di visualizzazione sia selezionata. Fare clic su OK. Quindi, nel menu Analizza, selezionare misura. Apparirà una nuova finestra popup dei risultati con i dati del valore medio di grigio della proteina basica della mielina.

La rimozione del midollo spinale e l'analisi citofluorimetrica consentono di valutare l'infiltrazione delle cellule immunitarie del sistema nervoso centrale, dove l'infiltrazione delle cellule immunitarie è massima al culmine della malattia. L'analisi statistica del numero di cellule CD4-positive, interferone gamma-positivo, IL-17-positivo e FOXP3-positivo può rivelare il significato dei cambiamenti osservati nel numero di cellule T infiltranti CD4-positive negli animali trattati con farmaci, rispetto agli animali di controllo, con un'analisi approfondita della coespressione essenziale per escludere l'inclinazione come fattore confondente nella riduzione complessiva del numero di cellule T infiltranti CD4-positive. Per eliminare la possibilità che una riduzione delle cellule T infiltranti il sistema nervoso centrale sia una conseguenza dell'inibizione della proliferazione, dell'attivazione e della differenziazione nella periferia, è possibile valutare il numero di cellule T attivamente proliferanti e la proporzione di sottotipi di cellule T.

Per la valutazione quantitativa dell'integrità della mielina, è possibile eseguire un'analisi statistica della densità ottica della colorazione delle proteine basiche della mielina, rivelando una significativa demielinizzazione del tessuto del midollo spinale in animali knockout genetici non specificati rispetto ai compagni di cucciolata wild type, ad esempio. Per dimostrare ulteriormente che la neuroinfiammazione è sostenuta o diminuita dagli interventi terapeutici, la gliosi reattiva può anche essere valutata misurando l'area della frazione media per la gliosi reattiva, come appena dimostrato. Una volta padroneggiata, la tecnica di citofluorimetria può essere completata in due giorni se eseguita correttamente, mentre la quantificazione della colorazione del tessuto può essere eseguita in circa due ore per colorazione.

L'immunomodulazione può essere valutata introducendo i trattamenti prima dell'infiltrazione delle cellule immunitarie per quantificare le modificazioni migratorie e proliferative nelle cellule T. La protezione del SNC può essere valutata introducendo i trattamenti durante il picco della malattia, quando le cellule immunitarie si sono già infiltrate nel SNC. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di valutare le impostazioni di soglia ottimali in ImageJ solo per l'evidenziazione specifica della colorazione cellulare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare gli effetti di trattamenti specifici sul sistema nervoso centrale, sulla proliferazione delle cellule T e sulle risposte alla migrazione. Alterando i tempi di trattamento prima e dopo l'infiltrazione delle cellule immunitarie.