Name: La determinazione di soppressione del sistema immunitario contro il sistema nervoso centrale di protezione per farmacologici Interventi a demielinizzazione autoimmune (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Scopri come determinare se i trattamenti farmacologici per l'encefalomielite autoimmune sperimentale proteggono il sistema nervoso centrale sopprimendo l'infiltrazione delle cellule immunitarie o attraverso effetti neuroprotettivi.

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Questo lavoro è stato finanziato dal NINDS P30-NS069324, la National Multiple Sclerosis SocietyRG 4587-A-1, la Fondazione Civitan International Research, The Mike L. Jezdimir trasversa Mielite Foundation, The University of Alabama Servizi sanitari Fondazione - Generale Endowment Fund, The National Science Foundation 1355183, e T32 AI007051 dal National Institute of Allergy e Malattie infettive, National Institutes of Health.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I pazienti con SM continuano a sperimentare le recidive di malattia durante l&#39;assunzione di farmaci che attenuano l&#39;attivazione delle cellule T e / o infiltrazione nel sistema nervoso centrale, garantendo lo sviluppo di opzioni di trattamento che proteggono direttamente il sistema nervoso centrale. EAE è stato classicamente utilizzato per modellare i sintomi della sclerosi multipla e può essere un potente strumento quando si studia la natura delle interazioni tra il sistema immunitario e del sistema nervoso centrale in vivo. Utilizzando tempi di considerazioni di trattamento in EAE, ad esempio, prima o dopo l&#39;inizio della malattia, in combinazione con l&#39;esame infiltrazione delle cellule immunitarie nel SNC e la proliferazione e l&#39;attivazione in periferia, è possibile delineare gli effetti dei trattamenti sia sul sistema immunitario e il CNS. Mentre EAE nel topo C57BL / 6 è più ampiamente utilizzato, EAE nel SJL mouse potrebbe essere più rappresentativi della maggior parte dei casi di SM, come questi topi hanno un fenotipo dirimessa e infiltrazione di cellule immunitarie nel parenchimadel cervello 10. topi SJL hanno recupero chiara durante la remissione pure, rendendo possibile iniziare il trattamento dopo che la malattia ha presentato, ma durante i periodi di riduzione dell&#39;infiammazione. E &#39;importante considerare che i topi SJL non sempre ricaduta e rimettono in sincronia, con conseguente potenzialmente grande variabilità quando i risultati vengono raggruppati. Di conseguenza, alcuni ricercatori possono scegliere di mostrare i risultati rappresentativi per i punteggi clinici da un animale durante l&#39;assunzione di topi per l&#39;analisi FACS ed istologia a punti individualizzati nella progressione della malattia. Considerando quando manipolazioni sono fatti per topi EAE può aiutare nella determinazione di come un trattamento agisce sul sistema immunitario o CNS. Ci sono molte opzioni per quando inizia il trattamento, ciascuno con la propria connotazione di se le cellule immunitarie sono entrati nel sistema nervoso centrale e come essi possono essere che interagiscono con il sistema nervoso centrale. Trattamento prima comparsa dei sintomi implica che le cellule immunitarie non sono ancora entrate o causato danni al sistema nervoso centrale.Trattamento dalla comparsa dei sintomi suggerisce che le cellule immunitarie sono entrati nel sistema nervoso centrale e hanno causato qualche danno. Utilizzando topi SJL, il trattamento può anche iniziare durante una ricaduta, in cui le cellule immunitarie sono attivamente infiltrando e causando infiammazione, o durante la remissione, in cui le cellule immunitarie possono essere meno diffuso nel SNC con meno infiammazione. ipotesi iniziali per quanto riguarda come trattamenti colpiscono il sistema nervoso centrale e il sistema immunitario può essere fatto se si considera dove le cellule immunitarie sono nel processo patologico durante il trattamento. Ci sono un certo numero di modi in cui i trattamenti possono influire cellule immunitarie e del SNC, ciascuno con il risultato finale di ridurre la gravità dei sintomi EAE. Pertanto, è necessario utilizzare l&#39;analisi citofluorimetrica e immunoistochimica guardare a come le cellule immunitarie sono influenzate in periferia e CNS, se le cellule immunitarie sono entrati nel CNS, e come il CNS reagisce al trattamento. Mentre l&#39;analisi di citometria di flusso del midollo spinale in grado di determinare quante cellule ettarive entrato nel CNS in un determinato momento, non si può determinare che questo effetto è dovuto al ridotto il traffico delle cellule immunitarie meno proliferazione delle cellule immunitarie è influenzato nella milza. È pertanto necessario analizzare sia tessuti periferici e CNS e determinare quali risultati medi meccanicamente quando entrambi i tessuti vengono confrontati. E &#39;anche possibile per profili di attività delle cellule immunitarie che deve essere modificato mediante trattamento, per esempio avendo un interruttore in un profilo patogeno cellule helper T pesanti ad un profilo cella pesante T normativo. Guardando i marcatori per i diversi tipi di cellule e confrontando espressione per cento tra gli animali trattati e non trattati è quindi anche una considerazione importante. Un concetto emergente nella ricerca MS suggerisce che le cellule B svolgono un ruolo importante nella demielinizzazione autoimmune. Questo si basa su studi che dimostrano che le cellule B sono necessarie per la riattivazione di cellule T 20. Questo concetto è supportato dal successo di trattamenti come rituximab, un anticorpo contro CD20 expremuto sulla superficie delle cellule B 21,22. Come dimostrato dal successo del ocrelizumab anticorpo monoclonale in studi clinici, farmaci destinati differenti epitopi di CD20 può migliorare l&#39;efficacia delle cellule B mirati terapeutica 23. Una limitazione delle tecniche presentate qui è che è possibile per le cellule immunitarie di entrare nel CNS ma essere in grado di viaggiare nel parenchima. Immunoistochimica può essere utilizzato per rilevare manicotti perivascolari di cellule immunitarie e valutare distanza percorsa nel parenchima tra gli animali trattati e non trattati. Un altro potenziale limitazione riguarda gli effetti della microbiome sulla EAE patogenesi. Commensale flora intestinale può influenzare pesantemente patogenesi della malattia 24; di conseguenza, i topi alloggiati in diverse colonie e anche in diverse gabbie possono avere grandi differenze nella gravità della malattia. Di conseguenza, è sempre preferibile ove possibile utilizzare i controlli littermate sollevati nella stessa gabbia peresperimenti EAE. Una nota finale è che se è sperimentalmente desiderabile eliminare gli effetti delle cellule immunitarie cambiamenti proliferative della periferia, può essere possibile farlo utilizzando induzione trasferimento passivo piuttosto che l&#39;induzione attivo descritto in questo protocollo. Un&#39;ulteriore conferma per la neuroprotezione può essere realizzato utilizzando un sistema di co-coltura 11 per testare specifici meccanismi di morte cellulare o tramite l&#39;utilizzo di topi knockout condizionali che consente l&#39;eliminazione di proteine ​​selettivamente su un tipo di cellula. Inoltre, per estendere l&#39;esplorazione di agenti farmacologici che sono neuroprotettivo, marcatori di transezione assonale e morte neuronale dovrebbero essere inclusi. Un altro settore di importanza è rimielinizzazione. assoni feriti sono in grado di remyelinate prestare ulteriore sostegno che le terapie neuroprotettive dovrebbe essere una parte importante di terapie rimielinizzazione. Inoltre, gli assoni amieliniche sono più vulnerabili al danno di myelinaassoni TED. Questo suggerisce che quando un assone diventa interventi terapeutici demielinizzati che promuovono la rimielinizzazione tempestivo impedirà danno assonale. Per esplorare queste vie, altri modelli in vivo per la demielinizzazione e rimielinizzazione possono essere utilizzati (ad esempio, cuprizone e lisolecitina). Il metodo descritto nel presente documento si è concentrato sulla valutazione neuroprotezione quantificando la perdita di mielina. Per la valutazione della remyelination il numero di cellule progenitrici nonché la loro capacità di proliferare e maturare sarebbe anche importante indagare. Con la menzione di questi modelli alternativi, si deve anche considerare diversi modelli di encefalite virale che sono mediate. Ci sono due modelli ben caratterizzati virale di RNA che producono la perdita di mielina: uno è encefalomielite murina di Theiler, un virus senza involucro Picornaviridae, e l&#39;altro è il mouse virus dell&#39;epatite, un membro della famiglia di virus Coronaviridae 25,26. EAE è uno strumento prezioso per studies di come manipolazioni o trattamenti influenzano il sistema immunitario e del sistema nervoso centrale in vivo. Il protocollo qui descritto può aiutare a determinare se i trattamenti colpiscono il processo della malattia, sia in periferia, alla barriera emato-encefalica, o nel SNC. Nessun attuali trattamenti per la SM curare la malattia e spesso i pazienti esperienza declino nel corso del tempo. Allo stesso modo, altre malattie che coinvolgono l&#39;infiltrazione di cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale e la degradazione della mielina, compresa l&#39;encefalomielite acuta disseminata, mielite trasversa, e neuromielite ottica, trattamenti mancanza che proteggono il sistema nervoso centrale in quanto è direttamente sotto attacco da infiltrazione di cellule immunitarie. Prendendo in considerazione i tempi di trattamento e mediante analisi citofluorimetrica della milza e del midollo spinale in combinazione con immunoistochimica del SNC per valutare l&#39;infiammazione e danni consentirà determinazioni meccanicistici essere fatte riguardo trattamenti.

La sclerosi multipla (SM) è caratterizzata da lesioni infiammatorie prevalentemente nelle regioni sostanza bianca del cervello nelle prime fasi della malattia. Dopo progressione a lungo termine, sostanza grigia atrofia viene rilevata mediante imaging MRI e segna la fase neurodegenerativa della malattia. gliosi reattiva, demielinizzazione, e danno assonale nella sostanza bianca sono attribuiti a CNS-infiltranti cellule immunitarie. Nessuno dei trattamenti attualmente utilizzati in MS inversa o direttamente prevenire la neurodegenerazione nel SNC - invece, ridurre l&#39;infiammazione attenuando l&#39;attivazione delle cellule T e / o infiltrazione nel SNC. Poiché non esiste una cura per la SM e pazienti che utilizzano trattamenti attuali continuano a sperimentare la progressione della malattia, le scoperte di farmaci che impediscono la demielinizzazione e perdita neuronale sono di fondamentale importanza. Tuttavia, distinguendo tra effetti sulle cellule immunitarie e quelli sul sistema nervoso centrale, può essere difficile sperimentalmente, come risultato - cioè, ridotta danni al SNC - guarda le same indipendentemente dei meccanismi attraverso i quali si verifica. Pertanto, la valutazione di protezione del sistema nervoso centrale deve essere una partnership con le valutazioni di SNC-infiltrazione di cellule immunitarie e la proliferazione delle cellule immunitarie nella periferia di determinare come agenti farmacologici influisce meccanismi di malattia. Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale consolidata di malattie infiammatorie autoimmuni che era direttamente responsabile per la scoperta di farmaci attualmente utilizzati per il trattamento di MS 1-4. I topi sono spesso utilizzati per EAE, con C57BL / 6 topi essere un ceppo popolare basata sulla disponibilità di varianti genetiche. C57BL / 6 topi indotti con EAE mostrano progressione della malattia cronica, con insorgenza intorno al giorno 10 post-induzione. L&#39;infiltrazione del parenchima del midollo spinale e del cervelletto sono caratteristici della istopatologia di questi animali, con l&#39;assenza di infiltrazione nel parenchima corticale 5. lesioni Inoltre, corticali e demielinizzazione nel bpioggia sono caratteristiche della malattia 6-9, che sono relativamente assenti in C57BL / 6 topi. Pertanto, può essere preferibile quando possibile utilizzare topi SJL, che hanno la malattia recidivante-remittente e lesioni riscontrate sia nel cervello e il midollo spinale che sembrano simili a quelle di MS 10. Il trattamento non può essere classificato come neuroprotettivo se le cellule immunitarie non raggiungono mai il sistema nervoso centrale. Pertanto, questo protocollo fa uso di flusso citometria di cervello, midollo spinale, e milza di topi EAE determinare effetti del trattamento sulla infiltrazione di cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale e la proliferazione delle cellule immunitarie nella periferia, come precedentemente dimostrato 11. analisi immunoistochimica del tessuto del sistema nervoso centrale per determinare entità e la natura di neuroprotezione è anche descritto. La combinazione di questi metodi consente di determinare se le cellule immunitarie sono stati attivati ​​e proliferano in periferia, se le cellule immunitarie entrati nel CNS, e se il CNS era protected da infiammazione o danni. Se gli effetti neuroprotettivi sono sospettate nonostante effetti sul sistema immunitario, sperimentatori possono alterare trattamento orari di inizio dopo l&#39;infiltrazione di cellule immunitarie nel è verificato il CNS. Qui, vi presentiamo un protocollo utilizzando due diversi modelli di EAE attivo, un modello animale cellulo-mediata T della sclerosi multipla, e citometria a flusso analisi combinata con immunoistochimica in diversi punti temporali durante la malattia per determinare l&#39;efficacia delle terapie sperimentali su diversi aspetti della patogenesi della SM. Questo metodo aiuterà i ricercatori a distinguere tra effetti sulla proliferazione delle cellule immunitarie e l&#39;infiltrazione contro la protezione del sistema nervoso centrale, rendendo più facile per restringere come farmaci agiscono sulla patogenesi della malattia.

<table><tbody><tr><td>Stampo per inclusione 22 x 22 x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9719245</td><td></td></tr><tr><td>Stampo per inclusione 22 x 30 x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531194</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>30 x 22 x 20 mm</td> stampo da incasso <td>Fisher Scientific</td><td>18-30</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Quality Biologico</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552775</td><td>0,2 mg/ml di concentrazione madre</td></tr><tr><td>anti-Foxp3-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5773-82</td><td>0,5 mg/ml di concentrazione madre</td></tr><tr><td>anti-GFAP (Cocktail)</td><td>Biolegend</td><td>835301</td><td>1 - 3 mg/ml di concentrazione madre</td></tr><tr><td>anti-Iba-1 Anticorpo policlonale (50 &#181; g)</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>0,5 mg/ml concentrazione madre</td></tr><tr><td>anti-IFN-&gamma; APC</td><td>eBioscience</td><td>17-7311-82</td><td>0,2 mg/ml concentrazione madre</td></tr><tr><td>anti-IL-17A PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-7177-82</td><td>0,2 mg/ml concentrazione madre</td></tr><tr><td>anti-Ki-67 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5698-82</td><td>0,2 mg/ml concentrazione madre</td></tr><tr><td>anti-MBP (D-18)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-13912</td><td>0,2 mg/ml concentrazione madre</td></tr><tr><td>anti-TCR&beta; FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-85</td><td>0,5 mg/ml concentrazione madre</td></tr><tr><td>anti-TCR&beta; PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-83</td><td>0,2 mg/ml concentrazione madre</td></tr><tr><td>Capra biotinilata Anti-coniglio IgG</td><td>Vector Labs</td><td>BA-1000</td><td>1,5 mg/ml concentrazione madre</td></tr><tr><td>Cavallo biotinilato Anti-Topo IgG</td><td>Vector Labs</td><td>BA-2000&nbsp;</td><td>Concentrazione madre di 1,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Acido citrico, anidro, 99,5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42356-5000</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), sale tetrasodico diidrato, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC446085000</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Vetrini per microscopio, confezione da 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Golgi Plug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>inibitore del trasporto delle proteine</td></tr><tr><td>Immedge Penna barriera idrofobica</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>EMD Millipore</td><td>407952-5 mg</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi non essenziali</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>vicino a IR Vivo/morto Kit di colorazione</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td>colorante di vitalità</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo normale</td><td>Vector Labs</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide, 96%</td> Fisher <td>Scientific</td><td>AC416785000</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Sanità</td><td>17-0891-01</td><td>gradiente di densità</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td>terreno di montaggio resinoso</td></tr><tr><td>Forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma</td><td>P1585-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Purificato anti-mielina proteina basica Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>808401</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT Composto</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>detergente non ionico</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit (standard)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9206402</td><td>avidina-biotina-perossidasi&nbsp; complesso (ABC) in immunoperossidasi&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit substrato perossidasi (DAB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9276270</td><td>soluzione DAB</td></tr></tbody></table>

la determinazione di soppressione del sistema immunitario contro il sistema nervoso centrale di protezione per farmacologici interventi a demielinizzazione autoimmune

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

Uno dei principali segni distintivi della malattia demielinizzante autoimmune sclerosi multipla (SM) è l'infiltrazione di cellule immunitarie nel cervello e nel midollo spinale con conseguente distruzione della mielina, che non solo rallenta la conduzione degli impulsi nervosi, ma provoca lesioni assonali con conseguente declino motorio e cognitivo. Gli attuali trattamenti per la SM si concentrano sull'attenuazione dell'infiltrazione delle cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC). Questi trattamenti riducono il numero di ricadute, migliorando la qualità della vita, ma non eliminano completamente le ricadute, quindi la disabilità a lungo termine non viene migliorata. Pertanto, gli agenti terapeutici che proteggono il SNC sono giustificati. Sia nei modelli animali che nei pazienti umani con SM, l'ingresso delle cellule T nel SNC è generalmente considerato l'evento infiammatorio iniziale. Al fine di valutare se un farmaco protegge il SNC, è necessario escludere qualsiasi potenziale effetto sull'infiltrazione o la proliferazione delle cellule immunitarie nella periferia. Questo protocollo descrive come determinare se la protezione del SNC osservata dopo l'intervento farmacologico è una conseguenza dell'attenuazione delle cellule immunitarie infiltranti il SNC o del blocco della morte delle cellule del SNC durante gli insulti infiammatori. La capacità di esaminare i trattamenti per la SM che sono protettivi per il SNC durante gli insulti infiammatori è estremamente critica per l'avanzamento delle strategie terapeutiche poiché i trattamenti attuali riducono, ma non eliminano completamente, le recidive (cioè l'infiltrazione di cellule immunitarie), lasciando il SNC vulnerabile alla degenerazione.

Questo protocollo descrive come determinare se i trattamenti farmacologici per l'encefalomielite autoimmune sperimentale mostrano protezione del SNC come conseguenza della soppressione dell'infiltrazione delle cellule immunitarie o sono neuroprotettivi durante l'assalto dell'infiltrazione delle cellule immunitarie.

La determinazione di soppressione del sistema immunitario contro il sistema nervoso centrale di protezione per farmacologici Interventi a demielinizzazione autoimmune

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

L'obiettivo generale di questo metodo concettuale è determinare se i trattamenti farmacologici per l'encefalomielite autoimmune sperimentale dimostrano la loro protezione del sistema nervoso centrale durante l'attacco dell'infiltrazione delle cellule immunitarie o come conseguenza della soppressione dell'infiltrazione delle cellule immunitarie. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia neuronale, ad esempio: in che modo la modulazione dei tempi di trattamento dell'EAE differenzia gli effetti sull'infiltrazione delle cellule immunitarie rispetto alla protezione?Le implicazioni di questa tecnica si estendono anche alla terapia della sclerosi multipla, poiché al momento non esistono trattamenti neuroprotettivi per questa malattia. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo scoperto che il trattamento di topi con EAE mediante un inibitore del trasportatore del sistema Xc- era sia neuroprotettivo che immunomodulante. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per studiare trattamenti farmacologici, può essere applicato anche a studi che impiegano topi knock-out geneticamente modificati sottoposti a EAE o ad altre manipolazioni.Cominciare utilizzando forbici sterili per tritare i cervelli e i midolli spinali di singoli animali in piccoli pezzi. Quindi utilizzare un pistone di siringa da tre millilitri per ogni tessuto, schiacciando ogni campione singolarmente su filtri cellulari da 70 micron, raccogliendo in singole provette coniche da 50 millilitri, risciacquando contemporaneamente i filtri con il mezzo. Una volta macerati tutti i pezzi, portare il volume finale nelle provette a 50 millilitri con mezzo fresco, quindi centrifugare le sospensioni cellulari.Risospendere ogni pellet in quattro millilitri di soluzione a gradiente di densità al 40%. Quindi stratificare delicatamente la cellula lentamente lungo le pareti di provette coniche individuali da 15 millilitri, al di sopra di due millilitri di soluzione a gradiente di densità al 70% per provetta. Separare le cellule mediante centrifugazione e utilizzare pipette di trasferimento da un millilitro per scartare con attenzione gli strati superiori di mielina.Successivamente, trasferire le cellule vitali dalle interfacce del campione in nuovi tubi conici da 15 millilitri e lavare le cellule in un volume finale di 15 millilitri di mezzo fresco per ogni tubo. Risospendere i pellet in 200 microlitri di mezzo fresco e trasferire le sospensioni cellulari in pozzetti separati di una piastra rotonda a 96 pozzetti. Centrifugare la piastra e rimuovere rapidamente i soprannatanti.Quindi, risospendere i pellet in 200 microlitri di mezzo di restimolazione e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per quattro ore. Al termine dell'incubazione, centrifugare nuovamente la piastra e rimuovere i soprannatanti. Quindi lavare le cellule con 200 microlitri di PBS integrato con 2% FCS e risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS integrato con 2% FCS e FC-block per 10-15 minuti sul ghiaccio.Al termine dell'incubazione, lavare le cellule come appena dimostrato e risospendere i pellet in 15 microlitri di cocktail per la colorazione della superficie cellulare, lasciando agire per 15 minuti sul ghiaccio. Successivamente, centrifugare le cellule e lavare i campioni due volte in 200 microlitri di PBS. Quindi, risospendere le cellule nei reagenti per la colorazione del fattore di trascrizione FOXP3 seguendo le istruzioni del produttore, per un periodo compreso tra 30 minuti e tutta la notte a 4 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in 150 microlitri di tampone di permeabilizzazione. Quindi centrifugare le cellule e risospendere i pellet negli anticorpi intracellulari di interesse in 15 microlitri di tampone di permeabilizzazione su ghiaccio. Dopo 30 minuti, centrifugare le cellule seguito da tre lavaggi in 200 microlitri di tampone di permeabilizzazione.Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere i pellet in 200 microlitri di PBS e analizzare i campioni mediante citometria a flusso, selezionando le cellule vive CD4-positive e TCR beta-positive. È inoltre importante valutare la proliferazione delle cellule T periferiche poiché le variazioni a livello periferico possono influenzare l'infiltrazione delle cellule immunitarie nel SNC. Per quantificare il numero di astrociti e cellule gliali presenti nei campioni di tessuto del midollo spinale dopo l'induzione di EAE, acquisire immagini di ciascuna sezione a un ingrandimento di 4x e salvare le immagini come file TIFF.Successivamente, in ImageJ, selezionare l'immagine di interesse e utilizzare lo strumento di selezione poligonale per tracciare l'intera sezione del tessuto spinale. Nel menu immagine, selezionare tipo e 16-bit per convertire l'immagine in 16-bit. Quindi, aprire il menu elabora e selezionare sottrai sfondo, impostando il raggio della sfera rotolante almeno pari alla dimensione dell'oggetto più grande che non fa parte dello sfondo.Controllare il paraboloide scorrevole e fare clic su OK. Quindi, sotto immagine, selezionare aggiusta e soglia, e utilizzare le barre scorrevoli per impostare il livello della soglia inferiore. Per ottenere la percentuale dell'area sogliata all'interno della regione selezionata, sotto analizza e imposta misure, selezionare frazione di area. Assicurarsi che il limite alla soglia sia deselezionato e che visualizza etichetta sia selezionato, quindi fare clic su OK. Per ottenere le misurazioni, sotto analizza, selezionare misura.Apparirà una finestra pop-up con i risultati. Salvare questi dati e confrontare i valori della frazione d'area tra i gruppi sperimentali. Per quantificare la colorazione della mielina mediante densità ottica, aprire l'immagine di interesse e utilizzare lo strumento di selezione poligonale per disegnare un'area di interesse all'interno del campione.In analisi e impostazione delle misure, selezionare il valore medio di grigio e verificare che l'opzione limita alla soglia sia deselezionata e che l'opzione mostra etichetta sia selezionata. Fare clic su OK. Quindi, nel menu analizza, selezionare misura. Apparirà una nuova finestra popup dei risultati contenente i dati del valore medio di grigio della proteina basica della mielina.La rimozione del midollo spinale e l'analisi mediante citometria a flusso permettono la valutazione dell'infiltrazione di cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale, dove l'infiltrazione cellulare immunitaria raggiunge il massimo livello nel picco della malattia. L'analisi statistica del numero di cellule positive per CD4, interferone gamma, IL-17 e FOXP3 può rivelare l'importanza delle variazioni osservate nel numero di linfociti T infiltranti CD4-positivi negli animali trattati con farmaco rispetto agli animali di controllo, con un'analisi approfondita della coespressione essenziale per escludere un bias come fattore confondente nella riduzione complessiva del numero di linfociti T infiltranti CD4-positivi. Per eliminare la possibilità che una riduzione delle cellule T infiltranti nel sistema nervoso centrale sia conseguenza dell'inibizione della proliferazione, dell'attivazione e della differenziazione in periferia, si possono valutare il numero di linfociti T in attiva proliferazione e la proporzione dei sottotipi di cellule T.Per una valutazione quantitativa dell'integrit&agrave; della mielina, &egrave; possibile effettuare un'analisi statistica della densit&agrave; ottica della colorazione della proteina basica della mielina, che pu&ograve; rivelare una significativa demielinizzazione del tessuto del midollo spinale in animali knock-out genetici non specificati rispetto ai rispettivi controlli wild type, ad esempio. Per ulteriormente confermare che l'infiammazione neurologica venga mantenuta o ridotta da interventi terapeutici, &egrave; inoltre possibile valutare la gliosi reattiva misurando la frazione media dell'area corrispondente alla gliosi reattiva, come appena dimostrato. Una volta acquisita padronanza, la tecnica di citometria a flusso pu&ograve; essere completata in due giorni se eseguita correttamente, mentre la quantificazione della colorazione tissutale pu&ograve; essere effettuata in circa due ore per ogni colorazione.L'immunomodulazione può essere valutata somministrando i trattamenti prima dell'infiltrazione delle cellule immunitarie, al fine di quantificare le variazioni nella migrazione e nella proliferazione delle cellule T. La protezione del sistema nervoso centrale può essere valutata somministrando i trattamenti durante il picco della malattia, quando le cellule immunitarie hanno già infiltrato il SNC. Nel corso di questa procedura, è importante ricordare di valutare le impostazioni ottimali della soglia in ImageJ per evidenziare in modo specifico solo la colorazione cellulare.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare gli effetti di trattamenti specifici sulla proliferazione e sulle risposte di migrazione delle cellule T e sul sistema nervoso centrale. Modificando i tempi di trattamento prima e dopo l'infiltrazione delle cellule immunitarie.

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Alcuni ceppi di topi sono in grado di resistere induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) con proteina basica della mielina. Qui descritto è un protocollo di immunizzazione semplice che inverte la mancanza di risposta e induce malattia paralitica in diversi tipiche macchie resistenti EAE del mouse.

Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

Un nuovo ex vivo preparazione per l'imaging del midollo spinale di topo. Questo protocollo consente a due fotoni imaging interazioni cellulari vivi tutto il midollo spinale.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Le malattie demielinizzanti possono essere modellate negli animali mediante l'applicazione focale di lisolecitina nel SNC. Una singola iniezione di lisolecitina nel midollo spinale del topo produce una lesione che si ripara spontaneamente nel tempo. L'obiettivo è studiare i fattori coinvolti nella de- e rimielinizzazione e testare agenti per migliorare la riparazione.

Demielinizzazione sperimentale e rimielinizzazione di Murine midollo spinale da iniezione focale Lysolecithin

Questo manoscritto descrive i metodi per l'induzione e il punteggio del modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE), insieme alla valutazione della distribuzione delle cellule immunitarie e dei livelli di citochine mRNA nei linfonodi, nella milza, nel sangue e nel midollo spinale utilizzando la citometria a flusso e la PCR quantitativa, rispettivamente, in varie fasi della malattia.

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

Qui, presentiamo protocolli per studiare danno dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale in vivo. Ci rivolgiamo in particolare come determinare la permeabilità della barriera emato - encefalica e attività della gelatinasi coinvolti nella migrazione dei leucociti attraverso la limitans glia.

Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo

Questo manoscritto presenta un protocollo per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale attiva (EAE) nei topi. Viene inoltre presentato un metodo per l'isolamento e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati nel sistema nervoso centrale (CNS) per mostrare come i linfociti siano coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.

Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Il presente protocollo descrive l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino utilizzando glicoproteina oligodendrocitaria mielinica e monitorando il processo della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico. I sintomi sperimentali correlati all'encefalomielite autoimmune vengono analizzati utilizzando l'analisi della tomografia microcomputerizzata del femore di topo e il test in campo aperto per valutare il processo della malattia in modo completo.

Induzione e diversi indicatori di valutazione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale

Il presente protocollo descrive un'iniezione a due punti di lisofosfatidilcolina attraverso un frame stereotassico per generare un modello di demielinizzazione stabile e riproducibile nei topi.

Un'iniezione a due punti stabilmente stabilita del modello di demielinizzazione focale indotta da lisofosfatidilcolina nei topi

Ad oggi, i protocolli per l'isolamento simultaneo di tutti i principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale dallo stesso topo sono una richiesta insoddisfatta. Il protocollo mostra una procedura applicabile nei topi con encefalomielite autoimmune naïve e sperimentale per studiare reti cellulari complesse durante la neuroinfiammazione e contemporaneamente ridurre il numero di topi richiesti.

Isolamento simultaneo dei principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale da topi adulti con encefalomielite autoimmune

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) funge da modello animale di sclerosi multipla. Questo articolo descrive un approccio per valutare l'infiammazione del midollo spinale, la demielinizzazione e la lesione assonale nell'EAE. Inoltre, viene presentato un metodo per quantificare i livelli di luce solubile dei neurofilamenti nel siero dei topi, facilitando la valutazione del danno assonale nei topi vivi.

Punteggio dell'infiammazione del sistema nervoso centrale, della demielinizzazione e della lesione assonale nell'encefalomielite autoimmune sperimentale

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla (SM), che condivide con la malattia umana una robusta risposta autoimmune umorale. Qui, riportiamo un protocollo ELISA semplice e flessibile per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi immunizzati con EAE.

Quantificazione degli anticorpi autoreattivi nei topi dopo encefalomielite autoimmune sperimentale

Scopri come determinare se i trattamenti farmacologici per l'encefalomielite autoimmune sperimentale proteggono il sistema nervoso centrale sopprimendo l'infiltrazione delle cellule immunitarie o attraverso effetti neuroprotettivi.

La determinazione di soppressione del sistema immunitario contro il sistema nervoso centrale di protezione per farmacologici Interventi a demielinizzazione autoimmune (Video) | JoVE Journal

La determinazione di soppressione del sistema immunitario contro il sistema nervoso centrale di protezione per farmacologici Interventi a demielinizzazione autoimmune

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