Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Il protocollo che presentiamo qui ci sarà utile per capire come i linfociti sono coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del sistema nervoso centrale. Con questo metodo, i linfociti nel cervello possono essere studiati su base cellulare. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri modelli e malattie del sistema nervoso centrale che dovevano analizzare le caratteristiche e le funzioni delle cellule immunitarie.

In questo video, il protocollo può facilmente dimostrare come indurre il modello e isolare singole cellule nel cervello. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, utilizzare una siringa millilitro per iniettare per via sottocutanea topi C57BL/6 anestetizzati con 100 microgrammi di MOG 35-55 emulsionati in 100 microlitri di coadiuvante completo di Freund in due diversi siti della schiena vicino al collo. Lo stesso giorno e il secondo giorno di postimmunizzazione, iniettare per via intraperitoneale i topi con 200 microlitri di un nanogrammo per soluzione di lavoro di tossine per microliter pertosse.

Dopo la seconda iniezione, trasferire i topi nella gabbia di casa con un tampone riscaldante e il monitoraggio fino alla piena rimiglia. Il giorno successivo e durante tutto il corso della malattia, esaminare e classificare tutti i topi in modo accecato per i segni neurologici delineati nella tabella e per eventuali cambiamenti di peso. All'endpoint sperimentale appropriato, tagliare accuratamente il cranio dal naso al collo e trasferire il cervello di ogni animale dalla scatola cranale in singoli tubi da 50 millilitri contenenti 10 millilitri di mezzo RPMI.

Mescolare bene i tubi per rimuovere i globuli rossi aderenti e rimuovere il mezzo per aspirazione. Aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco ad ogni tubo e trasferire il cervello in singoli piatti da 100 millimetri. Infine tritare ogni cervello con un rasoio e utilizzare una pipetta di plastica per trasferire tanto tessuto da un piatto alla volta e sei millilitri di mezzo in un omogeneizzatore di vetro centrato su sette millilitri ghiacciato.

Macinare il cervello usando lo stantuffo sciolto del pestello prima di utilizzare lo stantuffo stretto per portare il tessuto fino a quando la sospensione non è omogenea. Quindi, versare il liquame tissutale risultante in un tubo conico pre-refrigerato da 15 millilitri sul ghiaccio. Una volta omogeneizzati tutti i campioni, regolare il volume in ogni tubo a sette millilitri con mezzo fresco, prima di aggiungere ogni sospensione tissutale a un nuovo tubo refrigerato da 15 millilitri contenente tre millilitri di matrice di membrana basale al 100% per tubo.

Mescolare per inversione un paio di volte e utilizzare una pipetta da tre millilitri per aggiungere con attenzione e lentamente un millilitro di soluzione gradiente di densità del 70% sotto ogni campione di soluzione tissutale. Separare le cellule per centrifugazione gradiente di densità e rimuovere quasi tutto lo strato superiore, facendo attenzione a rimuovere completamente tutta la mielina. Trasferire l'interfaccia in un nuovo tubo da 15 millilitri e regolare il volume a 10 millilitri con mezzo fresco.

Quindi centrifugare nuovamente i campioni e rimuovere il supernatante prima di rimescolare il pellet in circa 100 microlitri di mezzo per tubo. Per l'analisi citometrica del flusso delle cellule cerebrali raccolte, allocare circa due volte 10 alle sei cellule in 100 microlitri di mezzo in singoli pozzi di una piastra di 96 pozza. Quando tutte le cellule sono state placcate, aggiungere 100 microlitri di cocktail di stimolazione cellulare 500X più inibitori del trasporto proteico ai pozzi e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per quattro ore.

Alla fine del pool di incubazione le cellule nella parte inferiore dei pozzi per centrifugazione e rimorsi i pellet in 100 microlitri di tampone di citometria a flusso per pozzo. Pre-incubare le cellule con tre microlitri di Anti-Mouse CD16/CD32 Fc Block per 10 minuti a quattro gradi Celsius prima della colorazione. Per bloccare eventuali interazioni mediate da Fc non specifiche.

Alla fine dell'incubazione, aggiungere il cocktail anticorpale di interesse per ogni pozzo e posizionare il piatto a quattro gradi Celsius protetto dalla luce. Dopo 30 minuti, lavare i pozzi con 100 microlitri di tampone di citometria di flusso per pozzo e sedimentare le cellule mediante centrifugazione. Dopo aver scartato i supernatanti, aggiungere 200 microlitri di tampone di fissazione intracellulare ad ogni pozzo.

Dopo un'incubazione da 30 a 60 minuti a temperatura ambiente, raccogliere i campioni per centrifugazione e rimossare i pellet in 200 microlitri di tampone di permeabilità 1X per pozzo. Centrifugare nuovamente i campioni e, dopo aver scartato il supernatante, rimescolare il pellet in 100 microlitri con tampone di permeabilizzazione fresco. Successivamente, aggiungere gli anticorpi appropriati per il rilevamento di eventuali antigeni intracellulari di interesse per un'incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce.

Al termine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri di tampone di permeabilizzazione 1X ad ogni pozzo e far girare i campioni per centrifugazione. Quindi, rimospendare le cellule di macchia in 200 microlitri di buffer di colorazione citometria del flusso e analizzare le cellule per citometria del flusso secondo protocolli standard. Un tipico decorso clinico dell'EAE dovrebbe comportare una curva della malattia e un cambiamento del peso corporeo come illustrato.

I topi C57BL/6 immunizzati con MOG 35-55 di solito iniziano a sviluppare sintomi di malattia intorno al giorno 10-12 e raggiungono il picco della malattia intorno al giorno 15-21. Prima dell'inizio della malattia, il peso corporeo dei topi immunizzati aumenta gradualmente prima di diminuire in correlazione con l'aumento dei sintomi della malattia I topi dimostrano il peso corporeo più basso al picco dell'EAE, con il peso corporeo che si riprende leggermente man mano che i sintomi clinici diminuiscono. I topi di solito non si riprendono completamente tuttavia e in genere sviluppano una patologia della malattia cronica monofasica.

Come illustrato da questa analisi rappresentativa del flusso, le cellule Th1 e Th17 produttrici di gamma di interferone e produttrici di IL17 sono significativamente aumentate nei topi EAE. Il passo più importante è 3.10. L'operatore deve trasferire lo strato intermedio e la luce, essendo attentamente, prendere il minor numero possibile di altri strati.

Seguendo questi protocolli, possiamo ulteriori linfociti T per ulteriori analisi di trascrizione per studiare