Metodo rapido con microsfere magnetiche per la purificazione efficiente dei neutrofili a bassa densità

Studiamo neutrofili a bassa densità all'interno delle cellule mononucleari del sangue periferico per caratterizzarne le funzioni e definire il loro ruolo nelle diverse malattie. I neutrofili a bassa densità sono rari nel sangue sano, ma aumentano notevolmente le malattie come il lupus eritematoso sistemico e il cancro. Per cominciare, aggiungere 10 unità per millilitro di eparina come anticoagulante in un tubo centrifuga conico da 15 millilitri.

Poi aggiungi due millilitri di 6% di destrano T500 in PBS. Ottieni 10 millilitri di sangue da un adulto sano volontario tramite venpuntura. In un altro tubo centrifuga fresco da 15 millilitri, aggiungi cinque millilitri di mezzo a gradiente di densità.

Con cura si pipetta il plasma senza toccare gli eritrociti e si sovrappone sopra il mezzo per formare due fasi separate. Centrifuga il tubo a 516 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Per isolare i PBMC, aspirare e scartare il plasma sopra la banda PBMC senza disturbare le cellule.

Raccogliere la banda della cella mononucleare tra il plasma e il mezzo, minimizzando la raccolta del mezzo. Aggiungere 20 millilitri di PBS al tubo contenente PBMC, poi centrifugare a 400 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aspira con cura il surnatante e raschia il tubo per separare il pellet.

Aggiungi 10 millilitri di PBS freddo per risospendere le cellule. Per isolare i neutrofili, si raschia il tubo per separare le cellule dopo aver pipetato il mezzo. Poi aggiungi 10 millilitri di PBS freddo.

Ora trasferisci le celle in un nuovo tubo centrifugo conico da 50 millilitri e centrifuga. Aspira il sovrandanante e raschia di nuovo il tubo. Ora pipetta 10 millilitri di soluzione ipotonica fredda nel tubo e mescola delicatamente.

Mescola delicatamente per esattamente un minuto. Aggiungi rapidamente 10 millilitri di soluzione ipertonica fredda per rendere la soluzione isotonica. Poi contare i neutrofili utilizzando una camera di Neubauer e assicurarsi che la purezza sia superiore al 95%. Centrifugare la sospensione per ottenere un pellet cellulare.

Poi risospendi il pellet in PBS freddo. Centrifugare le cellule mononucleari del sangue periferico a 400 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il soprandante, risospendere le celle in 120 microlitri di tampone a freddo.

Poi pipetta 35 microlitri di microsfere magnetiche CD66b alla sospensione cellulare. Incubare la miscela al buio a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Ora pipetta un millilitro di buffer a freddo sul tubo.

Centrifuga il tubo a 400 g per tre minuti. Raschia il tubo per separare il pellet cellulare dopo aver rimosso il surnatante. E risospendendo le celle in un millilitro di tampone di lavaggio.

Posiziona una colonna di separazione magnetica su un magnete. Aggiungi 0,5 millilitri di wash buffer alla colonna, permettendole di passare completamente. Trasferire un millilitro delle celle sospese sulla colonna e lasciare che il tampone passi goccia dopo goccia.

Dopo il lavaggio, trasferire la colonna in un tubo microcentrifuga. Poi pipetta un millilitro di tampone di lavaggio nella colonna. Ora inserisci lo sturalavandini sopra la colonna.

Applica delicatamente pressione per eluire le cellule. Poi rimuovi lo sturalavandini e posiziona la colonna su un nuovo tubo per microcentrifuga. Aggiungi un altro millilitro di buffer di lavaggio alla colonna.

Poi inserisci nuovamente lo sturalavandini e applica delicatamente pressione per eluire le cellule rimanenti. Centrifuga entrambi i tubi della microcentrifuga a 800 g per tre minuti. Risospendere i pellet cellulari da entrambi i tubi in un millilitro di PBS freddo.

Tieni la sospensione delle celle sul ghiaccio. Risospendere le cellule purificate in un tampone di marcatura composto dall'1% di siero bovino fetale in PBS. Trasferire 250 microlitri della sospensione in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Aggiungere i corrispondenti anticorpi contro le molecole di membrana dei neutrofili al tubo. Poi incubare le cellule per 30 minuti a quattro gradi Celsius, protette dalla luce. Ora pipetta un millilitro di PBS nel tube.

Fai girare il tubo in una microcentrifuga a 800 g per tre minuti. Aspira il soprandante. Tocca il tubo per rompere il pellet.

E risospendere le cellule a 0,5 millilitri di paraformaldeide all'1%. Poi mantenere le cellule a quattro gradi Celsius, protette dalla luce fino all'analisi tramite citometria a flusso. Analizza i campioni utilizzando la citometria a flusso, catturando 10.000 eventi per campione.

I neutrofili a bassa densità negli individui sani rappresentavano circa il 5% delle cellule mononucleari del sangue periferico, mentre il protocollo di isolamento magnetico descritto ha prodotto neutrofili a bassa densità con circa il 98% di recupero. I neutrofili esprimono i marcatori di membrana CD10, CD11b, CD15, CD62L e CD66b. I neutrofili a bassa densità purificati magneticamente esprimevano gli stessi marcatori di membrana dei neutrofili.

I neutrofili purificati a bassa densità presentavano un nucleo multilobulato e avevano dimensioni simili ai neutrofili. Sia i neutrofili che quelli a bassa densità generavano specie reattive di ossigeno in risposta alla stimolazione del PMA, con i neutrofili a bassa densità che producevano livelli più elevati rispetto ai neutrofili. I neutrofili a bassa densità rilasciavano trappole extracellulari neutrofile in risposta alla stimolazione della PMA, come dimostrato dalla colocalizzazione del DNA con elastasi e con citrullina.

Sia i neutrofili purificati che quelli a bassa densità rilasciavano NETs con cinetica e quantità simili dopo il trattamento PMA. Il nostro protocollo offre un modo rapido e riproducibile per ottenere neutrofili a bassa densità altamente puri e funzionali. Affrontiamo la mancanza di un protocollo standardizzato ed efficiente in termini di tempo per l'isolamento dei neutrofili a bassa densità dal sangue umano.

Questo protocollo non richiede alcuna formazione speciale per strumenti complessi, ed è anche più economico e veloce rispetto al FACS.