Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

Descriviamo una tecnica per utilizzare le cellule staminali embrionali murine per generare due o tre corpi embrionali tridimensionali. Abbiamo poi spiegato come indurre la differenziazione neuronale delle cellule del corpo embrionali di acido retinoico, e come analizzare il loro stato di differenziazione dal marcatore di cellule progenitrici immunofluorescenza e immunoblotting.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di analizzare l'espressione e la produzione di geni e marcatori proteici, rispettivamente, del differenziamento neurale di cellule staminali embrionali di topo. Questo metodo può aiutare a determinare il meccanismo responsabile dell'inibizione della differenziazione neurale da parte dell'età grezza delle DPA e portare a protocolli migliori per differenziare le cellule staminali in neuroni per scopi terapeutici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita il tracciamento del processo di differenziazione neurale a livello di emerina e proteina, anche mediante microscopia ottica.

A dimostrare la procedura sarà il Dr.Junning Yang, un ricercatore associato nel mio laboratorio. Inizia la formazione del corpo embrioide raccogliendo cellule staminali embrionali con lo 0,25% di tripsina-EDTA per due o cinque minuti a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Aggiungere il Dulbecco's Medium modificato di Iscove, o IMDM, con il 15% di FBS alle cellule di distacco e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri.

Centrifugare a 160 x G per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi contare le cellule utilizzando un emocitometro e preparare una sospensione da cinque x 10 a cinque cellule per millilitro in IMDM con acido retinoico 0,5 micromolare. Quindi, utilizzare una pipetta a otto canali e puntali da 200 microlitri per preparare gocce da 120 microlitri per piastra di Petri da 100 millimetri.

Capovolgere il piatto e riempire il coperchio capovolto con PBS per evitare che le gocce pendenti si secchino. Coltura a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, per tre o quattro giorni. Utilizzare puntali per pipette da 200 microlitri per raccogliere corpi embrioidi pendenti cresciuti per tre giorni.

Toccare un corpo embrioide con la punta di una pipetta e trasferirlo in un vetrino coprioggetti rivestito di fibra in una piastra a 24 pozzetti. Cambia il mezzo sulle colture ogni due o tre giorni. Quando si cambia il terreno, raccogliere il terreno utilizzato per l'analisi della secrezione proteica, se necessario.

Per rilevare le proteine secrete nel mezzo, trasferire 500 microlitri di terreno corporeo embrioide a filtri centrifughi cutoff da 10 kilodalton e centrifugare a 20.000 x G a quattro gradi Celsius. Esaminare il fluido rimasto all'interno dei filtri centrifughi ogni 15-20 minuti per evitare un eccessivo arricchimento. Interrompere la centrifugazione quando il volume del terreno rimanente è sceso a 25 microlitri.

Capovolgere il filtro e centrifugare a 160 x G a quattro gradi Celsius, quindi raccogliere il mezzo concentrato rimanente seguendo le istruzioni del produttore. Per una coltura 3D, raccogli corpi embrioidi cresciuti per quattro giorni come gocce sospese con puntali di pipette da 200 microlitri, come prima. Trasferire 30 corpi embrioidi in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri, quindi preparare la soluzione di gel di collagene diluendo volumi appropriati di soluzione di collagene e DMEM 5X, aggiungendo la soluzione di neutralizzazione e mescolando immediatamente bene.

Metti il gel di collagene sul ghiaccio. Quindi, pipettare un volume appropriato di soluzione di collagene refrigerato nella provetta contenente i corpi embrioidi, quindi pipettare delicatamente la sospensione del corpo embrioide nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti senza creare bolle. Trasferire immediatamente la piastra a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, per 60 minuti per avviare la polimerizzazione del collagene.

Trascorsi i 60 minuti, sovrapporre la piastra contenente i corpi embrioidi con IMDM. Per la dissociazione del corpo embrioide, raccogliere nuovamente i corpi embrioidi a goccia sospesi per quattro giorni con puntali per pipette da 200 microlitri. Questa volta, trasferiscili in una capsula di Petri batteriologica non adesiva contenente IMDM con il 15% di FBS e coltura a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, per altri quattro giorni.

Controlla i corpi embrioidi due volte al giorno per assicurarti che non si attacchino al fondo. Scuotere delicatamente il piatto per evitare l'attaccamento del corpo embrioide. Dopo quattro giorni, trasferire i corpi embrioidi in una provetta da centrifuga e centrifugare a 185 x G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante. Il volume della tavolozza non deve superare i 100 microlitri. Successivamente, pipettare un millilitro di collagenasi di tipo I allo 0,25%, integrato con il 20% di FBS in PBS nella provetta dei corpi embrioidi.

Incubare la miscela per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Pipettare delicatamente la sospensione utilizzando un puntale per pipetta da un millilitro ogni 20 minuti. Dopo l'incubazione, lavare delicatamente le cellule tre volte con PBS.

Se sono presenti aggregati cellulari, utilizzare un colino cellulare con una maglia da 100 micron per rimuoverli. Piastra le cellule su vetrini coprioggetti rivestiti di gelatina in IMDM, quindi incuba a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Lavare i corpi embrioidi 2D o 3D dissociati con PBS.

Quindi fissare con il quattro percento di paraformaldeide e PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le celle fissate tre volte con PBS per rimuovere i detriti di cellule galleggianti, aggiungere l'1% di tritone X-100 in PBS per permeabilizzare le celle per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio come prima, rimuovere l'ultimo lavaggio e bloccare con il 5% di BSA in PBS per 30 minuti.

Verso la fine dell'incubazione, preparare una diluizione di anticorpi primari in 1% BSA in PBS integrata con tritone X-100 allo 0,03%. Trascorsi i 30 minuti, sostituire la soluzione bloccante con la soluzione di anticorpi primari. Incubare per tre ore a temperatura ambiente, o durante la notte, a quattro gradi Celsius.

Dopo il lavaggio, applicare un anticorpo secondario in PBS e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Infine, montare i vetrini coprioggetto sui vetrini con un mezzo anti-sbiadimento per microscopia ottica. Questa immagine mostra l'emergere di germogli da un corpo embrioide generato da ESC, positivo per due copie del gene Syx, che codifica per un fattore di scambio guanina che attiva la GTPasi RhoA.

L'immagine è stata scattata dopo sei giorni di coltura 3D. Questo corpo embrioide formato da ESC Syx KnockOut dimostra un aumento della germinazione dopo lo stesso periodo di coltura. Qui, le immagini di fase dei bordi del corpo embrioide 2D mostrano che le cellule si sono espanse più velocemente dai knockout Syx che dal Syx wild-type.

Queste immagini di immunofluorescenza illustrano che il marcatore di differenziazione neurale, la nestina, mostrato in rosso, era più abbondante nelle cellule che si espandono da corpi embrioidi KnockOut 2D6 di sei giorni rispetto alle loro controparti Syx wild-type. Qui, le immagini di immunofluorescenza mostrano che i marcatori di differenziazione neurale Nestina e beta III Tubulina erano più abbondanti nelle cellule dissociate da corpi embrioidi 3D6 KnockOut di 13 giorni rispetto alle loro controparti Syx wild-type. Questa è una procedura che richiede molto tempo a causa della durata della crescita e della differenziazione del corpo embrioide.

Non solo richiede almeno otto giorni, ma in alcuni casi seguiamo la differenziazione fino a 24 giorni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di limitare la vitalità del diametro corporeo embrioide per garantire tassi di differenziazione simili lungo i corpi embrioidi.