Un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane

L'obiettivo generale di questo metodo è purificare le cellule endodermiche generate da cellule staminali embrionali umane o cellule ES. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle cellule staminali riguardo alla differenziazione endodermica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che una popolazione cellulare di endoderma pura può essere ottenuta dopo la rimozione delle cellule indifferenziate.

Prima di iniziare la procedura, ricoprire le piastre per colture cellulari a sei pozzetti con un millilitro di matrice della membrana basale per pozzetto. Lasciare in incubazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, per raccogliere le cellule staminali umane, aspirare il mezzo di coltura da una coltura di cellule staminali embrionali umane con una confluenza dell'80-90% utilizzando una pipetta di Pasteur in vetro sterile.

E lavare le cellule con due millilitri di PBS per pozzetto. Agitare la piastra ed aspirare la soluzione salina per rimuovere le cellule morte e i detriti. Successivamente, dissociare delicatamente i cluster cellulari con un millilitro di reagente enzima-libero per il passaggio, a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, fino a quando le cellule mostrano chiari segni di frammentazione in cluster più piccoli.

Dopo circa sette minuti, aggiungere un millilitro di mezzo DMMF12 nei pozzetti. Pipettare su e giù alcune volte con una punta da un millilitro per staccare gli aggregati cellulari rimanenti, ottenendo una sospensione di cellule singole. Utilizzando la stessa pipetta, trasferire le cellule in un tubo da centrifuga e risciacquare i pozzetti con un millilitro di mezzo DMMF12 fresco, raccogliendo i lavaggi nel tubo.

Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere il pellet in cinque millilitri di mezzo di coltura per cellule ES integrato con inibitore della ROCK. Contare le cellule e seminare da 1,5 a 4 volte 10 alla quinta cellule per pozzetto su piastre rivestite con matrice della membrana basale, in mezzo di coltura supplementato con inibitore della ROCK per prevenire l'apoptosi. Incubare le cellule per circa 24 ore.

E quindi utilizzare una pipetta di Pasteur sterile in vetro per sostituire il mezzo in ogni pozzetto con 2 millilitri di mezzo di induzione della stria primitiva. Dopo ulteriori 24 ore di coltura, sostituire il mezzo con mezzo di induzione dell'endoderma per un'incubazione di 48 ore con cambio giornaliero del mezzo. Nell'ultimo giorno di coltura e almeno un'ora prima del raccolto delle cellule, aggiungere inibitore fresco di ROCK al mezzo di coltura.

Quindi utilizzare una pipetta di Pasteur sterile in vetro per aspirare il mezzo da ciascun pozzetto e dissociare le cellule con la soluzione enzimatica per il passaggio, come appena dimostrato. Quando si è ottenuta una sospensione di singole cellule, contare le cellule e centrifugarle. Assicurarsi che, da questo momento in avanti, tutti i mezzi e i tamponi contengano l'inibitore della ROCK per prevenire la morte cellulare.

Altrimenti, non si attaccheranno correttamente dopo il ritiro. Ri-sospendere il pellet in 100 microlitri di tampone PEB, integrato con inibitore ROCK per 1 volta 10 alla settima cellule. Quindi aggiungere l'anticorpo CXCR4 APC alle cellule.

Battere leggermente il tubo per mescolare. Dopo 15 minuti a 4 gradi Celsius, lavare le cellule in uno o due millilitri di tampone PEB e utilizzare una pipetta Pasteur sterile in vetro per aspirare il sopranatante. Ri-sospendere il pellet in 80 microlitri di tampone PEB per 1 × 10⁷ cellule e aggiungere 20 microlitri di microperle anti-APC alle cellule.

Mescolare il campione con leggeri colpetti. Successivamente, incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con uno o due millilitri di tampone PEB integrato con inibitore ROCK.

E risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone PEB fresco più inibitore. Per isolare le cellule CXCR4+ mediante separazione con microsferette magnetiche, posizionare una colonna magnetica di dimensioni medie su un magnete di dimensioni adeguate e prerisciacquare la colonna con 500 microlitri di tampone PEB più inibitore ROCK. Quando tutto il lavaggio è drenato dalla sommità della colonna, applicare l'intero volume cellulare marcato con microsferette magnetiche sulla colonna, raccogliendo il flusso in uscita in un tubo conico.

Lavare la colonna con tre applicazioni di 500 microlitri di tampone PEB più inibitore ROCK. Successivamente, trasferire la colonna dal magnete in una provetta di raccolta adatta. Quindi far passare un millilitro di tampone PEB più inibitore ROCK attraverso la colonna per raccogliere le cellule CXCR4+.

Facoltativamente, tutti i campioni del flusso passante possono essere raccolti separatamente e aliquote di 20 microlitri da ciascun campione possono essere utilizzate per determinare la percentuale di cellule CXCR4+ in ciascuna aliquota mediante citometria a flusso. Questa procedura può essere ripetuta con il primo flusso passante per raccogliere le cellule che non si sono legate alla colonna. Successivamente, unire tutti i campioni di cellule CXCR4+ raccolti e centrifugarli.

Infine, risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di induzione dell'endoderma supplementato con inibitore ROCK e seminare le cellule alla densità appropriata in un contenitore per colture cellulari rivestito con matrice della membrana basale. Prima della loro differenziazione, le cellule staminali umane esprimono livelli elevati del marcatore di pluripotenza SOX2, mentre il marcatore dell'endoderma definitivo, FOXA2, non viene rilevato.

Dopo la differenziazione, le cellule staminali embrionali subiscono cambiamenti drastici nell'espressione genica e proteica. Effettivamente, dopo quattro giorni in mezzo di differenziazione, SOX17 e FOXA2 vengono co-espressi in modo uniforme all'interno dei nuclei di molte delle ex cellule staminali embrionali, un segno distintivo dell'impegno verso l'endoderma definitivo. Alcune cellule resistono al processo di differenziazione, non esprimendo nessuna delle due proteine marcatrici.

E infatti, mantengono l'espressione del marcatore di pluripotenza SOX2. In questo esperimento rappresentativo, al terzo giorno di differenziamento, circa il 60% delle cellule staminali embrionali raccolte esprimeva CXCR4, la cui purezza è stata arricchita a oltre l'85% dopo il sorting mediante microsfere magnetiche delle cellule pluripotenti e di altre linee indesiderate. Dopo aver seminato le cellule CXCR4+ purificate, vengono rilevate solo poche cellule SOX2+, mentre la maggior parte delle cellule seminate esprime FOXA2.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro due ore, se eseguita correttamente. Dopo aver seguito questa procedura, è possibile eseguire altre tecniche analoghe, come l'immunoistochimica o la QPCR, per rispondere a ulteriori domande sul processo di differenziazione. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come purificare le cellule dell'endoderma mediante il sorting con microsfere magnetiche.