Un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di purificare le cellule endodermiche generate da cellule staminali embrionali umane o ES. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali sulla differenziazione endodermica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile ottenere una popolazione di cellule endodermiche pure dopo la rimozione delle cellule indifferenziate.

Prima di iniziare la procedura, rivestire sei piastre di coltura cellulare con un millilitro di matrice di membrana basale per pozzetto. Per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, per raccogliere le cellule ES umane, aspirare il terreno da una coltura di cellule staminali embrionali umane confluenti all'80-90% con una pipetta sterile in vetro Pasture

E lavare le cellule con due millilitri di PBS per pozzetto. Agitare la piastra e aspirare la soluzione salina per rimuovere le cellule morte e i detriti. Successivamente, dissociare delicatamente i cluster cellulari con un millilitro di reagente in soluzione di passaggio senza enzimi, a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando le cellule mostrano chiari segni di rottura in cluster più piccoli.

Dopo circa sette minuti, aggiungere un millilitro di terreno DMMF12 ai pozzetti. Pipettare su e giù alcune volte con una punta di pipetta da un millilitro per staccare gli aggregati cellulari rimanenti in una singola sospensione cellulare. Utilizzando la stessa pipetta, trasferire le cellule in una provetta da centrifugazione e sciacquare i pozzetti con un millilitro di terreno DMMF12 fresco, raccogliendo i lavaggi nella provetta.

Dopo aver fatto girare le cellule, risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno di coltura cellulare ES integrato con inibitore ROCK. Contare le cellule e seminare 1,5:4 volte 10 al quinto di cellule per pozzetto sulle piastre rivestite di matrice della membrana basale in terreno di coltura integrato con inibitore ROCK per prevenire l'apoptosi. Incubare le cellule per circa 24 ore.

E poi utilizzare una pipetta sterile di vetro Pasteur per sostituire il terreno in ogni pozzetto con 2 millilitri di terreno di induzione a striature primitive. Dopo altre 24 ore di coltura, sostituire il terreno con un terreno di induzione endodermico per un'incubazione di 48 ore con cambi giornalieri del terreno. L'ultimo giorno di coltura e almeno un'ora prima della raccolta delle cellule, aggiungere un nuovo inibitore ROCK al terreno di coltura.

Quindi utilizzare una pipetta sterile di vetro Pasteur per aspirare il terreno da ciascuno dei pozzetti e dissociare le cellule con un reagente di soluzione passante privo di enzimi, come appena dimostrato. Quando è stata ottenuta una sospensione a singola cellula, contare le cellule e centrifugarle. Assicurati che da questo punto in poi, tutto il terreno e i tamponi contengano l'inibitore ROCK per evitare che le cellule muoiano.

In caso contrario, non verranno fissati correttamente dopo il ritiro. Risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone PEB, integrato con inibitore ROCK per 1 volte 10 alla settima cellula. Quindi aggiungere l'anticorpo CXCR4 APC alle cellule.

Muovendo delicatamente il tubo per mescolare. Dopo 15 minuti a 4 gradi Celsius, lavare le cellule in uno o due millilitri di tampone PEB e utilizzare una pipetta sterile di vetro Pasteur per aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in 80 microlitri di tampone PEB per 1 volte 10 alla settima cella e aggiungere 20 microlitri di microsfere anti-APC alle cellule.

Mescolare il campione con un leggero colpo. Quindi incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con uno o due millilitri di tampone PEB integrato con inibitore ROCK.

E risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone PEB fresco più inibitore. Per isolare le celle CXCR4+ mediante separazione a biglie magnetiche, caricare una colonna magnetica di medie dimensioni su un magnete di dimensioni adeguate e pre-risciacquare la colonna con 500 microlitri di tampone PEB più inibitore ROCK. Quando tutto il lavaggio è stato drenato dalla parte superiore della colonna, applicare l'intero volume della cella etichettato con la microsfera magnetica alla colonna, raccogliendo il flusso in un tubo conico.

Lavare la colonna con tre applicazioni di 500 microlitri di tampone PEB più inibitore ROCK. Quindi trasferire la colonna dal magnete in una provetta di raccolta adatta. E immergere un millilitro di tampone PEB più l'inibitore ROCK attraverso la colonna per raccogliere le cellule CXCR4+.

Opzionalmente, tutti i campioni a flusso continuo possono essere raccolti separatamente e 20 aliquote da microlitri di ciascun campione possono essere utilizzate per determinare la percentuale di cellule CXCR4+ in ciascuna alouette mediante citometria a flusso. Questa procedura può essere ripetuta con il primo flusso per raccogliere le celle che non si sono legate alla colonna. Quindi raggruppare entrambi i campioni di CXCR4+ e centrifugarli.

Infine, risospendere il pellet in un millilitro di terreno di induzione endodermico integrato con l'inibitore ROCK e seminare le cellule alla densità appropriata in un contenitore di coltura cellulare rivestito di matrice di membrana basale. Prima della loro differenziazione, le cellule ES umane esprimono alti livelli del marcatore di pluripotenza SOX2. Considerando che, il marcatore endodermico definitivo, FOXA2, non viene rilevato.

Dopo la differenziazione, le cellule ES subiscono drastici cambiamenti nella loro espressione genica e proteica. Infatti, dopo quattro giorni in terreno di differenziazione, SOX17 e FOXA2 sono co-espressi uniformemente all'interno dei nuclei di molte delle ex cellule ES, un segno distintivo dell'impegno definitivo dell'endoderma. Alcune cellule resistono al processo di differenziazione, non esprimendo nessuna delle due proteine marcatrici.

E infatti, mantengono l'espressione del loro marcatore di pluripotenza SOX2. In questo esperimento rappresentativo, il terzo giorno di differenziazione, quasi il 60% delle cellule ES raccolte esprimeva CXCR4, la cui purezza è stata arricchita a oltre l'85% dopo lo smistamento con biglie magnetiche delle cellule pluripotenti e di altre cellule di lignaggio indesiderate. Dopo aver seminato le cellule CXCR4+ purificate, vengono rilevate solo poche cellule SOX2+, con la maggior parte delle cellule seminate che esprimono FOXA2.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro due ore, se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre operazioni come l'istochimica immunitaria o la QPCR per rispondere a ulteriori domande sul processo di differenziazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare le cellule dell'endoderma mediante smistamento magnetico delle sfere.