Name: Un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri un metodo rapido per purificare cellule endodermali da cellule staminali embrionali umane usando separazione con microsfere magnetiche. Questa tecnica migliora le applicazioni di ricerca nello sviluppo endodermico.

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1. Differenziazione dei CES umana verso endoderma definitivo <ol><li> Coltivare cellule staminali embrionali umane (CES) in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Coat una nuova piastra di coltura cellulare 6 pozzetti con 1 ml di una matrice membrana basale e incubare la coltura-ware per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Per informazioni specifiche si prega di girare le istruzioni del rispettivo produttore. </li><li> Verificare che i CES umane coltivate hanno raggiunto l&#39;80% -90% di confluenza al microscopio con un ingrandimento basso (ad esempio, 4X). Aspirare il supporto dalle cavità succhiando via del mezzo con un bicchiere sterile Pasteur pipetta. Lavare le cellule una volta con una soluzione tampone fosfato (PBS). Per questo, aggiungere 2 ml di PBS a ciascun pozzetto dolcemente agitare la piastra e succhiare la soluzione per rimuovere le cellule morte e detriti cellulari. </li><li> Aggiungere 1 ml di reagente soluzione passaging senza enzima per dolce la dissociazione di gruppi di cellule. Incubare le cellule a 37 ° C und 5% di CO 2 fino a quando le cellule mostrano chiari segni di rottura in piccoli gruppi. NOTA: Il tempo di incubazione dipende dal reagente utilizzato. Per la soluzione passaging senza enzima citato nella sezione materiali, tempo di incubazione è di circa 7 min. </li><li> Aggiungere 1 ml DMEM / F-12 di media e disturbare gli altri aggregati di cellule in singole cellule pipettando su e giù con una punta della pipetta 1 ml. Usare questo per irrigare le cellule dalla superficie e trasferire le cellule a un tubo di centrifugazione. Per recuperare tutte le celle, lavare i pozzetti con 1 ml di DMEM / F-12 medio e aggiungere il mezzo al tubo di centrifugazione. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 minuti a 300 x g. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di ES terreno di coltura cellulare contenente 10 mM Rho-chinasi (ROCK) inibitore. </li><li> Contare le cellule al microscopio utilizzando un emocitometro e sementi 150.000 - 400.000 cellule per 6 pozzetti o in un altro layout di piastra, a seconda della linea cellulare utilizzata ES. Usa culture terreno contenente inibitore ROCK 10 pM di evitare l&#39;apoptosi e la cultura nelle cellule in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Circa 24 ore dopo la semina aspirare il terreno con uno sterile pipetta Pasteur di vetro e aggiungere 2 ml di terreno striscia di induzione primitiva. NOTA: Questo mezzo contiene concentrazioni finali di 1% glutamina, 0,2% FCS, 5 micron CHIR-99021 e 50 ng / ml activin A in avanzata RPMI-1640. Comunemente, usare 2 ml di terreno per la coltivazione in 6 pozzetti. </li><li> 48 ore dopo la semina, sostituire il mezzo per endoderma medio induzione. Coltivare le cellule in questo mezzo per altre 48 ore con cambio medio giornaliero. NOTA: Questo mezzo contiene 1% glutamina, 0,2% FCS e 50 ng / ml activina A in Advanced RPMI-1640. Le cellule che si sono impegnati verso l&#39;endoderma definitivo esprimono il marcatore di superficie CXCR4. La colorazione di CXCR4 può essere utilizzato per quantificare il numero di cellule disimpegnati. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. La colorazione di CXCR4 + endoderma definitivo cellule per l&#39;analisi in citometria a flusso <ol><li> Per la finale 24 hr ma almeno 1 ora prima della raccolta delle cellule aggiungono inibitore ROCK 10 pM al mezzo di coltura. </li><li> Coat coltura-ware cellule che verrà utilizzato per la ri-semina con una matrice di membrana basale, cioè, piastre da 12 pozzetti per analisi qPCR o la camera di vetrini per immunofluorescenza. Incubare le piastre o le diapositive per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il mezzo con uno sterile pipetta Pasteur di vetro dai pozzi delle cellule differenziate utilizzati per la colorazione e / o l&#39;ordinamento. </li><li> Aggiungere 1 ml di reagente soluzione passaging priva di enzimi per il dolce di dissociazione di gruppi di cellule. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 finché le cellule mostrano evidenti segni di rottura in piccoli gruppi. NOTA: Il tempo di incubazione dipende dal reagente utilizzato. Per la soluzione passaging senza enzima di cui al Materisezione als, tempo di incubazione è di circa 7 min. </li><li> Aggiungere 1 ml DMEM / F-12 di media e disturbare restante aggregati di cellule in singole cellule pipettando su e giù con una punta di 1 ml. Usare questo per irrigare le cellule dalla superficie e trasferire le cellule a un tubo di centrifugazione. Per recuperare tutte le celle, lavare i pozzetti con 1 ml di DMEM / F-12 medio w / o FCS e aggiungere il mezzo al tubo di centrifugazione. </li><li> Contare le cellule sotto il microscopio con un emocitometro. Le cellule provenienti da tre pozzetti di una piastra da 6 pozzetti dovrebbero portare a 10-15 x 10 6 cellule dopo tre giorni di differenziazione. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 300 x g. NOTA: Il numero esatto di cellule ottenute dipenderà dalla linea cellulare pluripotenti utilizzato per la differenziazione. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in tampone PEB contenente inibitore ROCK 10 micron. Utilizzare 100 ml di questo buffer per un massimo di 10 7 cellule. Aggiungere l&#39;inibitore ROCK 10 pM del giorno di staining. Utilizzare questo buffer per tutte le applicazioni a valle (di seguito PEB tampone + RI). NOTA: tampone PEB contiene 0,5% BSA e 2 mM EDTA in PBS. Se più celle devono essere macchiati, regolare il volume di accumulo di conseguenza. </li><li> Aggiungere 10 ml di un anticorpo CXCR4-APC per 10 7 cellule in 100 microlitri, questo rappresenta circa una diluizione di 1:10. NOTA: L&#39;utilizzo di un anticorpo APC-linked non è obbligatoria. Invece può essere sostituito a seconda delle microsfere utilizzate. Se più celle devono essere macchiati regolare il volume anticorpi conseguenza. </li><li> Mescolare capovolgendo delicatamente il tubo con le dita e incubare a 4 ° C in frigorifero per 15 minuti. Risospendere le cellule con 1-2 ml di tampone PEB. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 300 x g. </li><li> Aspirare il surnatante con un bicchiere sterile Pasteur pipetta e risospendere il pellet cellulare in 80 microlitri PEB per 10 7 cellule e aggiungere 20 microlitri anti-APC microsfere. NOTA: </sTrong&gt; Se più celle devono essere macchiato, regolare il volume micro-perline di conseguenza. </li><li> Mescolare capovolgendo delicatamente il tubo con le dita e incubare a 4 ° C in frigorifero per 15 minuti. Risospendere le cellule con 1-2 ml di PEB tampone + RI. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 300 x g. Aspirare il buffer. Risospendere in 500 microlitri di buffer PEB + RI. </li></ol> 3. La separazione magnetica di CXCR4 + cellule <ol><li> Posizionare una colonna magnetica di medie dimensioni in un campo magnetico come da istruzioni di fabbricazione. Pre-lavare la colonna con 500 microlitri di buffer PEB + RI. Applicare l&#39;intera sospensione cellulare alla colonna. Raccogliere il flusso attraverso le cellule come non tutti lo legherà alla colonna. Fare attenzione a non disturbare le colonne per il recupero ottimale delle cellule CXCR4 +. </li><li> Lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di buffer PEB + RI. Raccogliere il primo flusso attraverso e combinarlo con le cellule raccolte dal punto 3.1. Rimuovere la colonna magnetica dal campo magnetico e metterla in untubo di raccolta adatto. Aggiungere 1 ml di PEB tampone + RI sulla colonna. Per eluire le cellule premere con forza il pistone nella colonna. </li><li> Opzionale: Raccogliere tutte flusso attraverso campioni separatamente e 20 ml ciascuno di analizzare il numero di cellule CXCR4 + citometria a flusso. Il loro numero dovrebbe diminuire con ogni fase di lavaggio. NOTA: Almeno 2 x 10 4 praticabile, le cellule gated devono essere contati per ottenere risultati affidabili. </li><li> Ripetere i punti 3.1-3.3 con il flusso raccolte attraverso campione dal punto 3.1 e il primo flusso attraverso campione dal punto 3.2 con una nuova colonna. Non riutilizzare la colonna precedente. Utilizzando l&#39;aria stantuffo viene pressato nella colonna, che blocca. </li><li> Contare le cellule sotto il microscopio con un emocitometro. A seconda della efficienza della differenziazione fino a 6 x 10 6 cellule possono essere ordinati inizialmente e altre 1 x 10 6 cellule utilizzando una seconda colonna utilizzando 10 7 cellule per la procedura. </li&gt; <li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e con uno sterile Pasteur di vetro pipetta e risospendere le cellule in 1 ml di mezzo endoderma induzione dal punto 1.9 con l&#39;aggiunta di inibitore ROCK 10 micron. </li><li> Contare le cellule sotto il microscopio con un emocitometro. Seme le cellule ad una densità adeguata, vale a dire, ~ 4 x 10 5 cellule per pozzetto di una 12-pozzetti (app. 3,6 cm 2 di superficie) o ~ 1,5 x 10 5 cellule per pozzetto di un 8-ben camera-scivolo. </li></ol> 4. Opzionale: Analisi delle purificata Popolazione Endoderma definitiva <ol><li> Per immunofluorescenza fissare le cellule purificate dal punto 3.7 circa 24 ore dopo la semina con paraformaldeide al 4% e colorare per endoderma definitivo (DE) e / o proteine ​​marker pluripotenza. NOTA: comunemente usato DE marcatori includono Foxa2 e SOX17, marcatori pluripotenza comunemente usati includono Oct3 / 4, Nanog e SOX2 6, 8. </li><li> foanalisi R RT-qPCR, raccogliere le cellule purificate direttamente o 24 ore dopo la semina, estratto totale-RNA e reverse trascrivere cDNA dai campioni totale-RNA estratto. Utilizzare 10 ng cDNA come modello per reazione RT-qPCR (triplicato) per analizzare l&#39;espressione di DE e geni marcatori pluripotenza 6, 8. NOTA: i geni marcatori di uso comune sono menzionati al punto 4.1. condizioni del ciclo sono 5 min a 95 ° C e 40 cicli di 15 secondi a 95 ° C e 1 min a 60 ° C, seguita da analisi della curva di fusione. </li></ol>

<ol><li>Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Highly+Purified+Cardiomyocytes+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Small+Molecule-modulated+Differentiation+and+Subsequent+Glucose+Starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Sgodda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+hepatic+differentiation+strategies+for+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells.</a> Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).</li>
<li>Naujok, O., Burns, C., Jones, P. M., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-producing+surrogate+beta-cells+from+embryonic+stem+cells%3A+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet.</a> Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).</li>
<li>Katsirntaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+sublineage+specification+of+pluripotent+stem+cells%3A+effect+of+dexamethasone+plus+cAMP-elevating+agents+and+keratinocyte+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor.</a> Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).</li>
<li>Abranches, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+embryonic+stem+cells+in+vitro%3A+a+road+map+to+neurogenesis+in+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo.</a> PLoS One. 4 (7), e6286(2009).</li>
<li>Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+definitive+endoderm+from+human+embryonic+stem+cells+is+initially+independent+from+activin+A+but+requires+canonical+Wnt-signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling.</a> Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li>
<li>Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+and+efficient+protocol+for+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+into+the+definitive+endoderm+based+on+dispersed+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells.</a> Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).</li>
<li>Kim, P. T., Ong, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+definitive+endoderm+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells.</a> Results Probl Cell Differ. 55, 303-319 (2012).</li>
<li>Katoh, M., Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+analyses+of+CXCR4%3A+transcriptional+regulation+of+CXCR4+based+on+TGFbeta%2C+Nodal%2C+Activin+signaling+and+POU5F1%2C+FOXA2%2C+FOXC2%2C+FOXH1%2C+SOX17%2C+and+GFI1+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors.</a> Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>Bruin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+and+function+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+in+macroencapsulation+devices+following+transplant+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice.</a> Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).</li>
<li>Fu, W., Wang, S. J., Zhou, G. D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+undifferentiated+cells+during+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).</li>
<li>Hentze, H., Soong, P. L., Wang, S. T., Phillips, B. W., Putti, T. C., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells%3A+evaluation+of+essential+parameters+for+future+safety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies.</a> Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).</li>
<li>Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+in+the+development+of+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Risk factors in the development of stem cell therapy.</a> J Transl Med. 9, 29(2011).</li>
<li>Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+removal+of+undifferentiated+embryonic+stem+cells+from+differentiation+cultures+through+HSV1+thymidine+kinase+and+ganciclovir+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment.</a> Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).</li>
<li>Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W. H., Baker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+FACS+approach+isolates+hESC+derived+endoderm+using+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors.</a> PLoS One. 6 (3), 17536(2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

protocolli di differenziazione Attualmente utilizzati raramente si traducono in 100% di cellule differenziate. Per ragioni che devono ancora essere affrontate alcune cellule resistono il processo di differenziazione. A seconda della efficienza del protocollo differenziazione utilizzato e la propensione del CES linea un certo numero di cellule pluripotenti residue vengono comunemente osservato anche dopo differenziamento in endoderma definitiva. Queste cellule residue possono compromettere differenziazioni a valle o ulte...

Le cellule staminali pluripotenti come le cellule staminali embrionali (ESC) hanno la capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula del corpo umano. Così, in vitro protocolli di differenziazione possono essere utilizzati per generare numerosi tipi cellulari adulto come cardiomiociti 1, epatociti 2, cellule beta 3, epiteliale polmonare 4 o cellule neuronali 5. Questo rende CES uno strumento prezioso per il potenziale trattamento di diverse malattie degenerative 3. La differenziazione in vitro dei CES verso tessuti adulti del polmone, del fegato e del pancreas richiede una pseudo-gastrulazione in cellule che ricordano l&#39;endoderma definitivo (DE) 6. Poiché differenziazione valle verso i suddetti tipi di cellule somatiche è molto meno efficienti, una differenziazione endoderma ottimale è considerata limitante 7. Le cellule che si sono impegnati nei confronti della stirpe endoderma subiscono chacambiamenti racteristic nel loro profilo di espressione genica. Maestri pluripotenza geni regolatori sono giù regolati, mentre l&#39;espressione di altri fattori di trascrizione, come Foxa2, SOX17, HNF1B era, i membri della famiglia GATA e il recettore di superficie CXCR4 è altamente upregulated 6, 8, 9. CXCR4 è noto per essere transactivated da SMAD2 / 3, a valle della nodale di segnalazione / TGF-β e SOX17 a causa di specifici siti di legame nella sua regione del promotore 10. Così è un marcatore molto adatto utilizzato in una serie di relazioni 6, 8, 11-13. Questi cambiamenti di espressione riflette un evento di pseudo-gastrulazione, in cui i CES prima acquisire caratteristiche di una popolazione di cellule striscia simile primitiva e, successivamente, si impegnano nello strato germinale endoderma 6. Tuttavia, i protocolli di differenziazione sono raramente efficiente al 100% come poche cellule possono resistere al processo di differenziazione o differenziare verso altre linee non intenzionali 14. Queste cellule possono Influe negativamentence ulteriore differenziazione. Inoltre, le cellule indifferenziate residue porto grandi rischi per i successivi esperimenti di trapianto e possono dar luogo a teratomi 15-17. Per rimuovere queste cellule indesiderate precoce sul marcatore CXCR4 superficie può essere utilizzato per la purificazione di cellule che si sono impegnati verso la DE 18. Qui, descriviamo un metodo per la selezione positiva di + cellule CXCR4 da De culture differenziazione. Per questo, il marcatore CXCR4 superficie è vincolato da un anticorpo che poi a sua volta si lega a microsfere magnetiche. A differenza delle dure condizioni durante FACS ordinamento, le cellule DE-come magneticamente etichettati possono quindi facilmente essere purificati in un formato da banco utilizzando un metodo di purificazione delicato. Questo protocollo fornisce un metodo semplice per la rimozione delle popolazioni cellulari che oppone il processo di differenziazione DE.

<table><tbody><tr><td>Linea di cellule staminali embrionali umane Hues8</td><td>Dipartimento di cellule staminali e biologia</td><td></td> rigenerativa di Harvard <td>Linea cellulare adatta per la generazione dell'endoderma</td></tr><tr><td>Linea di cellule staminali embrionali umane Hes3</td><td>ES Cell International</td><td></td><td>Linea cellulare adatta e robusta per la generazione dell'endoderma</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td>Terreno di coltura ESC</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1860</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>CD184 (CXCR4)-APC, umano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-357</td><td></td></tr><tr><td>anti-APC MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Separatore OctoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>campo magnetico</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>Inibitore ROCK</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Activina A</td><td>Peprotech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di dissociazione cellulare delicato</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>7174</td><td>Senza enzimi soluzione di passaggio, alternativa: Tripsina/EDTA</td></tr><tr><td>Matrigel*</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>matrice di membrana basale * risolvere e conservare in aliquote a -80 &deg; C come indicato nel manuale dei fornitori. Dopo l'uso, scongelare con ghiaccio, diluire in 25 ml di knockout ghiacciato DMEM/F-12. Aggiungere 1 ml a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il matrigel e utilizzare immediatamente. </td></tr><tr><td>Colonne MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separatore MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Umano FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt</td><td>Life Tecnologie GSC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>umano REV ctctgatgaggaccgcttctg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 TaqMan assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00751752_s1</td><td></td></tr><tr><td>Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Umano POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg</td><td>Tecnologie di vita Umano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>POU5F1 REV ctgcagtgtgggtgtttcgggca</td><td>Tecnologie</td><td></td><td></td>di vita</tr><tr><td>Nanog umano FW ccgagggcagacatcc</td><td>Tecnologie</td><td></td><td></td>di vita</tr><tr><td>Nanog umano REV ccatccactgccacatcttct</td><td>Tecnologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>di vita Umano TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a</td><td>Life Technologies Human</td><td></td><td></td></tr><tr><td>G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t </td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FOXA2</td><td>MerckMillipore</td><td>07-633</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>R& Sistemi D</td><td>AF1924</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Le capacità di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti come le cellule staminali embrionali (ESC) permettono una potenziale applicazione terapeutica per le terapie di sostituzione cellulare. Terminally tipi di cellule differenziate potrebbero essere utilizzati per il trattamento di varie malattie degenerative. In vitro differenziazione di queste cellule verso tessuti del polmone, fegato e pancreas richiede come primo passo la generazione di cellule endodermico definitive. Questo passaggio è limitante per un&#39;ulteriore differenziazione verso tipi di cellule terminalmente maturate come le cellule beta produttrici di insulina, epatociti o altri tipi di cellule endoderma-derivati. Le cellule che si sono impegnati nei confronti della stirpe endoderma altamente esprimono una moltitudine di fattori di trascrizione come Foxa2, SOX17, HNF1B era, i membri della famiglia GATA, e il recettore CXCR4 superficiale. Tuttavia, i protocolli di differenziazione sono raramente efficiente al 100%. Qui, si descrive un metodo per la purificazione di una popolazione di cellule CXCR4 + dopo la differenziazionenella DE utilizzando microsfere magnetiche. Questa purificazione elimina inoltre le cellule di linee indesiderate. Il metodo di purificazione delicata è veloce e affidabile e può essere utilizzata per migliorare le applicazioni a valle e differenziazioni.

Su differenziazione CES subiscono drastici cambiamenti di espressione genica e proteica. La figura 1 illustra geni marcatori tipici che possono essere utilizzati per verificare una differenziazione endoderma successo. Obiettivi principali per l&#39;analisi di espressione genica sono GSC, Foxa2 e SOX17. In un parente analisi di espressione genica in particolare Foxa2 e SOX17 sono aumentate di&gt; 2.000 volte ...

Qui, si descrive un metodo per la purificazione delle cellule staminali embrionali differenziate umane che si sono impegnati verso l&#39;endoderma definitivo per il miglioramento delle applicazioni a valle e ulteriori differenziazioni.

Un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

L'obiettivo generale di questo metodo è purificare le cellule endodermiche generate da cellule staminali embrionali umane o cellule ES. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle cellule staminali riguardo alla differenziazione endodermica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che una popolazione cellulare di endoderma pura può essere ottenuta dopo la rimozione delle cellule indifferenziate.Prima di iniziare la procedura, ricoprire le piastre per colture cellulari a sei pozzetti con un millilitro di matrice della membrana basale per pozzetto. Lasciare in incubazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, per raccogliere le cellule staminali umane, aspirare il mezzo di coltura da una coltura di cellule staminali embrionali umane con una confluenza dell'80-90% utilizzando una pipetta di Pasteur in vetro sterile.E lavare le cellule con due millilitri di PBS per pozzetto. Agitare la piastra ed aspirare la soluzione salina per rimuovere le cellule morte e i detriti. Successivamente, dissociare delicatamente i cluster cellulari con un millilitro di reagente enzima-libero per il passaggio, a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, fino a quando le cellule mostrano chiari segni di frammentazione in cluster più piccoli.Dopo circa sette minuti, aggiungere un millilitro di mezzo DMMF12 nei pozzetti. Pipettare su e gi&ugrave; alcune volte con una punta da un millilitro per staccare gli aggregati cellulari rimanenti, ottenendo una sospensione di cellule singole. Utilizzando la stessa pipetta, trasferire le cellule in un tubo da centrifuga e risciacquare i pozzetti con un millilitro di mezzo DMMF12 fresco, raccogliendo i lavaggi nel tubo.Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere il pellet in cinque millilitri di mezzo di coltura per cellule ES integrato con inibitore della ROCK. Contare le cellule e seminare da 1,5 a 4 volte 10 alla quinta cellule per pozzetto su piastre rivestite con matrice della membrana basale, in mezzo di coltura supplementato con inibitore della ROCK per prevenire l'apoptosi. Incubare le cellule per circa 24 ore.E quindi utilizzare una pipetta di Pasteur sterile in vetro per sostituire il mezzo in ogni pozzetto con 2 millilitri di mezzo di induzione della stria primitiva. Dopo ulteriori 24 ore di coltura, sostituire il mezzo con mezzo di induzione dell'endoderma per un'incubazione di 48 ore con cambio giornaliero del mezzo. Nell'ultimo giorno di coltura e almeno un'ora prima del raccolto delle cellule, aggiungere inibitore fresco di ROCK al mezzo di coltura.Quindi utilizzare una pipetta di Pasteur sterile in vetro per aspirare il mezzo da ciascun pozzetto e dissociare le cellule con la soluzione enzimatica per il passaggio, come appena dimostrato. Quando si è ottenuta una sospensione di singole cellule, contare le cellule e centrifugarle. Assicurarsi che, da questo momento in avanti, tutti i mezzi e i tamponi contengano l'inibitore della ROCK per prevenire la morte cellulare.Altrimenti, non si attaccheranno correttamente dopo il ritiro. Ri-sospendere il pellet in 100 microlitri di tampone PEB, integrato con inibitore ROCK per 1 volta 10 alla settima cellule. Quindi aggiungere l'anticorpo CXCR4 APC alle cellule.Battere leggermente il tubo per mescolare. Dopo 15 minuti a 4 gradi Celsius, lavare le cellule in uno o due millilitri di tampone PEB e utilizzare una pipetta Pasteur sterile in vetro per aspirare il sopranatante. Ri-sospendere il pellet in 80 microlitri di tampone PEB per 1 × 10⁷ cellule e aggiungere 20 microlitri di microperle anti-APC alle cellule.Mescolare il campione con leggeri colpetti. Successivamente, incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con uno o due millilitri di tampone PEB integrato con inibitore ROCK.E risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone PEB fresco più inibitore. Per isolare le cellule CXCR4+ mediante separazione con microsferette magnetiche, posizionare una colonna magnetica di dimensioni medie su un magnete di dimensioni adeguate e prerisciacquare la colonna con 500 microlitri di tampone PEB più inibitore ROCK. Quando tutto il lavaggio è drenato dalla sommità della colonna, applicare l'intero volume cellulare marcato con microsferette magnetiche sulla colonna, raccogliendo il flusso in uscita in un tubo conico.Lavare la colonna con tre applicazioni di 500 microlitri di tampone PEB più inibitore ROCK. Successivamente, trasferire la colonna dal magnete in una provetta di raccolta adatta. Quindi far passare un millilitro di tampone PEB più inibitore ROCK attraverso la colonna per raccogliere le cellule CXCR4+.Facoltativamente, tutti i campioni del flusso passante possono essere raccolti separatamente e aliquote di 20 microlitri da ciascun campione possono essere utilizzate per determinare la percentuale di cellule CXCR4+ in ciascuna aliquota mediante citometria a flusso. Questa procedura può essere ripetuta con il primo flusso passante per raccogliere le cellule che non si sono legate alla colonna. Successivamente, unire tutti i campioni di cellule CXCR4+ raccolti e centrifugarli.Infine, risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di induzione dell'endoderma supplementato con inibitore ROCK e seminare le cellule alla densità appropriata in un contenitore per colture cellulari rivestito con matrice della membrana basale. Prima della loro differenziazione, le cellule staminali umane esprimono livelli elevati del marcatore di pluripotenza SOX2, mentre il marcatore dell'endoderma definitivo, FOXA2, non viene rilevato.Dopo la differenziazione, le cellule staminali embrionali subiscono cambiamenti drastici nell'espressione genica e proteica. Effettivamente, dopo quattro giorni in mezzo di differenziazione, SOX17 e FOXA2 vengono co-espressi in modo uniforme all'interno dei nuclei di molte delle ex cellule staminali embrionali, un segno distintivo dell'impegno verso l'endoderma definitivo. Alcune cellule resistono al processo di differenziazione, non esprimendo nessuna delle due proteine marcatrici.E infatti, mantengono l'espressione del marcatore di pluripotenza SOX2. In questo esperimento rappresentativo, al terzo giorno di differenziamento, circa il 60% delle cellule staminali embrionali raccolte esprimeva CXCR4, la cui purezza è stata arricchita a oltre l'85% dopo il sorting mediante microsfere magnetiche delle cellule pluripotenti e di altre linee indesiderate. Dopo aver seminato le cellule CXCR4+ purificate, vengono rilevate solo poche cellule SOX2+, mentre la maggior parte delle cellule seminate esprime FOXA2.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro due ore, se eseguita correttamente. Dopo aver seguito questa procedura, è possibile eseguire altre tecniche analoghe, come l'immunoistochimica o la QPCR, per rispondere a ulteriori domande sul processo di differenziazione. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come purificare le cellule dell'endoderma mediante il sorting con microsfere magnetiche.

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