Name: Un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri un metodo rapido per purificare cellule endodermali da cellule staminali embrionali umane usando separazione con microsfere magnetiche. Questa tecnica migliora le applicazioni di ricerca nello sviluppo endodermico.

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1. Differenziazione dei CES umana verso endoderma definitivo <ol><li> Coltivare cellule staminali embrionali umane (CES) in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Coat una nuova piastra di coltura cellulare 6 pozzetti con 1 ml di una matrice membrana basale e incubare la coltura-ware per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Per informazioni specifiche si prega di girare le istruzioni del rispettivo produttore. </li><li> Verificare che i CES umane coltivate hanno raggiunto l&#39;80% -90% di confluenza al microscopio con un ingrandimento basso (ad esempio, 4X). Aspirare il supporto dalle cavità succhiando via del mezzo con un bicchiere sterile Pasteur pipetta. Lavare le cellule una volta con una soluzione tampone fosfato (PBS). Per questo, aggiungere 2 ml di PBS a ciascun pozzetto dolcemente agitare la piastra e succhiare la soluzione per rimuovere le cellule morte e detriti cellulari. </li><li> Aggiungere 1 ml di reagente soluzione passaging senza enzima per dolce la dissociazione di gruppi di cellule. Incubare le cellule a 37 ° C und 5% di CO 2 fino a quando le cellule mostrano chiari segni di rottura in piccoli gruppi. NOTA: Il tempo di incubazione dipende dal reagente utilizzato. Per la soluzione passaging senza enzima citato nella sezione materiali, tempo di incubazione è di circa 7 min. </li><li> Aggiungere 1 ml DMEM / F-12 di media e disturbare gli altri aggregati di cellule in singole cellule pipettando su e giù con una punta della pipetta 1 ml. Usare questo per irrigare le cellule dalla superficie e trasferire le cellule a un tubo di centrifugazione. Per recuperare tutte le celle, lavare i pozzetti con 1 ml di DMEM / F-12 medio e aggiungere il mezzo al tubo di centrifugazione. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 minuti a 300 x g. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di ES terreno di coltura cellulare contenente 10 mM Rho-chinasi (ROCK) inibitore. </li><li> Contare le cellule al microscopio utilizzando un emocitometro e sementi 150.000 - 400.000 cellule per 6 pozzetti o in un altro layout di piastra, a seconda della linea cellulare utilizzata ES. Usa culture terreno contenente inibitore ROCK 10 pM di evitare l&#39;apoptosi e la cultura nelle cellule in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Circa 24 ore dopo la semina aspirare il terreno con uno sterile pipetta Pasteur di vetro e aggiungere 2 ml di terreno striscia di induzione primitiva. NOTA: Questo mezzo contiene concentrazioni finali di 1% glutamina, 0,2% FCS, 5 micron CHIR-99021 e 50 ng / ml activin A in avanzata RPMI-1640. Comunemente, usare 2 ml di terreno per la coltivazione in 6 pozzetti. </li><li> 48 ore dopo la semina, sostituire il mezzo per endoderma medio induzione. Coltivare le cellule in questo mezzo per altre 48 ore con cambio medio giornaliero. NOTA: Questo mezzo contiene 1% glutamina, 0,2% FCS e 50 ng / ml activina A in Advanced RPMI-1640. Le cellule che si sono impegnati verso l&#39;endoderma definitivo esprimono il marcatore di superficie CXCR4. La colorazione di CXCR4 può essere utilizzato per quantificare il numero di cellule disimpegnati. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. La colorazione di CXCR4 + endoderma definitivo cellule per l&#39;analisi in citometria a flusso <ol><li> Per la finale 24 hr ma almeno 1 ora prima della raccolta delle cellule aggiungono inibitore ROCK 10 pM al mezzo di coltura. </li><li> Coat coltura-ware cellule che verrà utilizzato per la ri-semina con una matrice di membrana basale, cioè, piastre da 12 pozzetti per analisi qPCR o la camera di vetrini per immunofluorescenza. Incubare le piastre o le diapositive per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il mezzo con uno sterile pipetta Pasteur di vetro dai pozzi delle cellule differenziate utilizzati per la colorazione e / o l&#39;ordinamento. </li><li> Aggiungere 1 ml di reagente soluzione passaging priva di enzimi per il dolce di dissociazione di gruppi di cellule. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 finché le cellule mostrano evidenti segni di rottura in piccoli gruppi. NOTA: Il tempo di incubazione dipende dal reagente utilizzato. Per la soluzione passaging senza enzima di cui al Materisezione als, tempo di incubazione è di circa 7 min. </li><li> Aggiungere 1 ml DMEM / F-12 di media e disturbare restante aggregati di cellule in singole cellule pipettando su e giù con una punta di 1 ml. Usare questo per irrigare le cellule dalla superficie e trasferire le cellule a un tubo di centrifugazione. Per recuperare tutte le celle, lavare i pozzetti con 1 ml di DMEM / F-12 medio w / o FCS e aggiungere il mezzo al tubo di centrifugazione. </li><li> Contare le cellule sotto il microscopio con un emocitometro. Le cellule provenienti da tre pozzetti di una piastra da 6 pozzetti dovrebbero portare a 10-15 x 10 6 cellule dopo tre giorni di differenziazione. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 300 x g. NOTA: Il numero esatto di cellule ottenute dipenderà dalla linea cellulare pluripotenti utilizzato per la differenziazione. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in tampone PEB contenente inibitore ROCK 10 micron. Utilizzare 100 ml di questo buffer per un massimo di 10 7 cellule. Aggiungere l&#39;inibitore ROCK 10 pM del giorno di staining. Utilizzare questo buffer per tutte le applicazioni a valle (di seguito PEB tampone + RI). NOTA: tampone PEB contiene 0,5% BSA e 2 mM EDTA in PBS. Se più celle devono essere macchiati, regolare il volume di accumulo di conseguenza. </li><li> Aggiungere 10 ml di un anticorpo CXCR4-APC per 10 7 cellule in 100 microlitri, questo rappresenta circa una diluizione di 1:10. NOTA: L&#39;utilizzo di un anticorpo APC-linked non è obbligatoria. Invece può essere sostituito a seconda delle microsfere utilizzate. Se più celle devono essere macchiati regolare il volume anticorpi conseguenza. </li><li> Mescolare capovolgendo delicatamente il tubo con le dita e incubare a 4 ° C in frigorifero per 15 minuti. Risospendere le cellule con 1-2 ml di tampone PEB. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 300 x g. </li><li> Aspirare il surnatante con un bicchiere sterile Pasteur pipetta e risospendere il pellet cellulare in 80 microlitri PEB per 10 7 cellule e aggiungere 20 microlitri anti-APC microsfere. NOTA: </sTrong&gt; Se più celle devono essere macchiato, regolare il volume micro-perline di conseguenza. </li><li> Mescolare capovolgendo delicatamente il tubo con le dita e incubare a 4 ° C in frigorifero per 15 minuti. Risospendere le cellule con 1-2 ml di PEB tampone + RI. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 300 x g. Aspirare il buffer. Risospendere in 500 microlitri di buffer PEB + RI. </li></ol> 3. La separazione magnetica di CXCR4 + cellule <ol><li> Posizionare una colonna magnetica di medie dimensioni in un campo magnetico come da istruzioni di fabbricazione. Pre-lavare la colonna con 500 microlitri di buffer PEB + RI. Applicare l&#39;intera sospensione cellulare alla colonna. Raccogliere il flusso attraverso le cellule come non tutti lo legherà alla colonna. Fare attenzione a non disturbare le colonne per il recupero ottimale delle cellule CXCR4 +. </li><li> Lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di buffer PEB + RI. Raccogliere il primo flusso attraverso e combinarlo con le cellule raccolte dal punto 3.1. Rimuovere la colonna magnetica dal campo magnetico e metterla in untubo di raccolta adatto. Aggiungere 1 ml di PEB tampone + RI sulla colonna. Per eluire le cellule premere con forza il pistone nella colonna. </li><li> Opzionale: Raccogliere tutte flusso attraverso campioni separatamente e 20 ml ciascuno di analizzare il numero di cellule CXCR4 + citometria a flusso. Il loro numero dovrebbe diminuire con ogni fase di lavaggio. NOTA: Almeno 2 x 10 4 praticabile, le cellule gated devono essere contati per ottenere risultati affidabili. </li><li> Ripetere i punti 3.1-3.3 con il flusso raccolte attraverso campione dal punto 3.1 e il primo flusso attraverso campione dal punto 3.2 con una nuova colonna. Non riutilizzare la colonna precedente. Utilizzando l&#39;aria stantuffo viene pressato nella colonna, che blocca. </li><li> Contare le cellule sotto il microscopio con un emocitometro. A seconda della efficienza della differenziazione fino a 6 x 10 6 cellule possono essere ordinati inizialmente e altre 1 x 10 6 cellule utilizzando una seconda colonna utilizzando 10 7 cellule per la procedura. </li&gt; <li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e con uno sterile Pasteur di vetro pipetta e risospendere le cellule in 1 ml di mezzo endoderma induzione dal punto 1.9 con l&#39;aggiunta di inibitore ROCK 10 micron. </li><li> Contare le cellule sotto il microscopio con un emocitometro. Seme le cellule ad una densità adeguata, vale a dire, ~ 4 x 10 5 cellule per pozzetto di una 12-pozzetti (app. 3,6 cm 2 di superficie) o ~ 1,5 x 10 5 cellule per pozzetto di un 8-ben camera-scivolo. </li></ol> 4. Opzionale: Analisi delle purificata Popolazione Endoderma definitiva <ol><li> Per immunofluorescenza fissare le cellule purificate dal punto 3.7 circa 24 ore dopo la semina con paraformaldeide al 4% e colorare per endoderma definitivo (DE) e / o proteine ​​marker pluripotenza. NOTA: comunemente usato DE marcatori includono Foxa2 e SOX17, marcatori pluripotenza comunemente usati includono Oct3 / 4, Nanog e SOX2 6, 8. </li><li> foanalisi R RT-qPCR, raccogliere le cellule purificate direttamente o 24 ore dopo la semina, estratto totale-RNA e reverse trascrivere cDNA dai campioni totale-RNA estratto. Utilizzare 10 ng cDNA come modello per reazione RT-qPCR (triplicato) per analizzare l&#39;espressione di DE e geni marcatori pluripotenza 6, 8. NOTA: i geni marcatori di uso comune sono menzionati al punto 4.1. condizioni del ciclo sono 5 min a 95 ° C e 40 cicli di 15 secondi a 95 ° C e 1 min a 60 ° C, seguita da analisi della curva di fusione. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

protocolli di differenziazione Attualmente utilizzati raramente si traducono in 100% di cellule differenziate. Per ragioni che devono ancora essere affrontate alcune cellule resistono il processo di differenziazione. A seconda della efficienza del protocollo differenziazione utilizzato e la propensione del CES linea un certo numero di cellule pluripotenti residue vengono comunemente osservato anche dopo differenziamento in endoderma definitiva. Queste cellule residue possono compromettere differenziazioni a valle o ulte...

Le cellule staminali pluripotenti come le cellule staminali embrionali (ESC) hanno la capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula del corpo umano. Così, in vitro protocolli di differenziazione possono essere utilizzati per generare numerosi tipi cellulari adulto come cardiomiociti 1, epatociti 2, cellule beta 3, epiteliale polmonare 4 o cellule neuronali 5. Questo rende CES uno strumento prezioso per il potenziale trattamento di diverse malattie degenerative 3. La differenziazione in vitro dei CES verso tessuti adulti del polmone, del fegato e del pancreas richiede una pseudo-gastrulazione in cellule che ricordano l&#39;endoderma definitivo (DE) 6. Poiché differenziazione valle verso i suddetti tipi di cellule somatiche è molto meno efficienti, una differenziazione endoderma ottimale è considerata limitante 7. Le cellule che si sono impegnati nei confronti della stirpe endoderma subiscono chacambiamenti racteristic nel loro profilo di espressione genica. Maestri pluripotenza geni regolatori sono giù regolati, mentre l&#39;espressione di altri fattori di trascrizione, come Foxa2, SOX17, HNF1B era, i membri della famiglia GATA e il recettore di superficie CXCR4 è altamente upregulated 6, 8, 9. CXCR4 è noto per essere transactivated da SMAD2 / 3, a valle della nodale di segnalazione / TGF-β e SOX17 a causa di specifici siti di legame nella sua regione del promotore 10. Così è un marcatore molto adatto utilizzato in una serie di relazioni 6, 8, 11-13. Questi cambiamenti di espressione riflette un evento di pseudo-gastrulazione, in cui i CES prima acquisire caratteristiche di una popolazione di cellule striscia simile primitiva e, successivamente, si impegnano nello strato germinale endoderma 6. Tuttavia, i protocolli di differenziazione sono raramente efficiente al 100% come poche cellule possono resistere al processo di differenziazione o differenziare verso altre linee non intenzionali 14. Queste cellule possono Influe negativamentence ulteriore differenziazione. Inoltre, le cellule indifferenziate residue porto grandi rischi per i successivi esperimenti di trapianto e possono dar luogo a teratomi 15-17. Per rimuovere queste cellule indesiderate precoce sul marcatore CXCR4 superficie può essere utilizzato per la purificazione di cellule che si sono impegnati verso la DE 18. Qui, descriviamo un metodo per la selezione positiva di + cellule CXCR4 da De culture differenziazione. Per questo, il marcatore CXCR4 superficie è vincolato da un anticorpo che poi a sua volta si lega a microsfere magnetiche. A differenza delle dure condizioni durante FACS ordinamento, le cellule DE-come magneticamente etichettati possono quindi facilmente essere purificati in un formato da banco utilizzando un metodo di purificazione delicato. Questo protocollo fornisce un metodo semplice per la rimozione delle popolazioni cellulari che oppone il processo di differenziazione DE.

<table><tbody><tr><td>Linea di cellule staminali embrionali umane Hues8</td><td>Dipartimento di cellule staminali e biologia</td><td></td> rigenerativa di Harvard <td>Linea cellulare adatta per la generazione dell'endoderma</td></tr><tr><td>Linea di cellule staminali embrionali umane Hes3</td><td>ES Cell International</td><td></td><td>Linea cellulare adatta e robusta per la generazione dell'endoderma</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td>Terreno di coltura ESC</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1860</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>CD184 (CXCR4)-APC, umano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-357</td><td></td></tr><tr><td>anti-APC MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Separatore OctoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>campo magnetico</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>Inibitore ROCK</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Activina A</td><td>Peprotech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di dissociazione cellulare delicato</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>7174</td><td>Senza enzimi soluzione di passaggio, alternativa: Tripsina/EDTA</td></tr><tr><td>Matrigel*</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>matrice di membrana basale * risolvere e conservare in aliquote a -80 &deg; C come indicato nel manuale dei fornitori. Dopo l'uso, scongelare con ghiaccio, diluire in 25 ml di knockout ghiacciato DMEM/F-12. Aggiungere 1 ml a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il matrigel e utilizzare immediatamente. </td></tr><tr><td>Colonne MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separatore MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Umano FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt</td><td>Life Tecnologie GSC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>umano REV ctctgatgaggaccgcttctg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 TaqMan assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00751752_s1</td><td></td></tr><tr><td>Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Umano POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg</td><td>Tecnologie di vita Umano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>POU5F1 REV ctgcagtgtgggtgtttcgggca</td><td>Tecnologie</td><td></td><td></td>di vita</tr><tr><td>Nanog umano FW ccgagggcagacatcc</td><td>Tecnologie</td><td></td><td></td>di vita</tr><tr><td>Nanog umano REV ccatccactgccacatcttct</td><td>Tecnologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>di vita Umano TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a</td><td>Life Technologies Human</td><td></td><td></td></tr><tr><td>G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t </td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FOXA2</td><td>MerckMillipore</td><td>07-633</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>R& Sistemi D</td><td>AF1924</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Le capacità di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti come le cellule staminali embrionali (ESC) permettono una potenziale applicazione terapeutica per le terapie di sostituzione cellulare. Terminally tipi di cellule differenziate potrebbero essere utilizzati per il trattamento di varie malattie degenerative. In vitro differenziazione di queste cellule verso tessuti del polmone, fegato e pancreas richiede come primo passo la generazione di cellule endodermico definitive. Questo passaggio è limitante per un&#39;ulteriore differenziazione verso tipi di cellule terminalmente maturate come le cellule beta produttrici di insulina, epatociti o altri tipi di cellule endoderma-derivati. Le cellule che si sono impegnati nei confronti della stirpe endoderma altamente esprimono una moltitudine di fattori di trascrizione come Foxa2, SOX17, HNF1B era, i membri della famiglia GATA, e il recettore CXCR4 superficiale. Tuttavia, i protocolli di differenziazione sono raramente efficiente al 100%. Qui, si descrive un metodo per la purificazione di una popolazione di cellule CXCR4 + dopo la differenziazionenella DE utilizzando microsfere magnetiche. Questa purificazione elimina inoltre le cellule di linee indesiderate. Il metodo di purificazione delicata è veloce e affidabile e può essere utilizzata per migliorare le applicazioni a valle e differenziazioni.

Su differenziazione CES subiscono drastici cambiamenti di espressione genica e proteica. La figura 1 illustra geni marcatori tipici che possono essere utilizzati per verificare una differenziazione endoderma successo. Obiettivi principali per l&#39;analisi di espressione genica sono GSC, Foxa2 e SOX17. In un parente analisi di espressione genica in particolare Foxa2 e SOX17 sono aumentate di&gt; 2.000 volte ...

Qui, si descrive un metodo per la purificazione delle cellule staminali embrionali differenziate umane che si sono impegnati verso l&#39;endoderma definitivo per il miglioramento delle applicazioni a valle e ulteriori differenziazioni.

Un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

L'obiettivo generale di questo metodo è purificare le cellule endodermiche generate da cellule staminali embrionali umane o cellule ES. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle cellule staminali riguardo alla differenziazione endodermica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che una popolazione cellulare di endoderma pura può essere ottenuta dopo la rimozione delle cellule indifferenziate.Prima di iniziare la procedura, ricoprire le piastre per colture cellulari a sei pozzetti con un millilitro di matrice della membrana basale per pozzetto. Lasciare in incubazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, per raccogliere le cellule staminali umane, aspirare il mezzo di coltura da una coltura di cellule staminali embrionali umane con una confluenza dell'80-90% utilizzando una pipetta di Pasteur in vetro sterile.E lavare le cellule con due millilitri di PBS per pozzetto. Agitare la piastra ed aspirare la soluzione salina per rimuovere le cellule morte e i detriti. Successivamente, dissociare delicatamente i cluster cellulari con un millilitro di reagente enzima-libero per il passaggio, a 37 gradi Celsius e 5% di anid

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Biologia dello sviluppo

La capacità di cellule staminali embrionali umane per auto-rinnovarsi e differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo suggerisce che essi sono molto promettenti per le applicazioni mediche e come strumento di ricerca per affrontare questioni fondamentali per lo sviluppo e la malattia. Qui, mettiamo a disposizione una concisa, passo-passo il protocollo per la derivazione di cellule staminali embrionali umane da embrioni da immunosurgical isolamento della massa cellulare interna.

Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

Questo articolo si concentrerà sulla creazione di endoderma epatiche umane da popolazioni di cellule staminali embrionali.

Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

Nonostante gli sforzi volti a culture di transizione a feeder liberi condizioni, la derivazione e la cultura di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimangono in gran parte dipendente dal co-colture con alimentatori embrionali di topo (MEF). Qui vi mostriamo una nuova metodologia per la rapida rimozione di alimentatori da culture hESC prima della sperimentazione.

Fibroblast rimozione veloce da alta densità Culture staminali embrionali umane

Descriviamo l'uso degli anticorpi monoclonali TG30 (CD9) e GCTM-2 per il rilevamento combinato di antigeni di superficie cellulare tramite smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS) per l'identificazione e l'arricchimento di cellule staminali embrionali umane vive (hESC) utilizzando la selezione positiva e anche l'uso della selezione negativa per eliminare gli HESC da una popolazione a cellule miste.

Arricchimento ed eliminazione delle cellule staminali embrionali umane mediante rilevamento di antigeni di superficie cellulare utilizzando gli anticorpi monoclonali TG30 e GCTM-2

Questo protocollo dirige in modo efficiente topo staminali embrionali derivato dalle cellule endoderma definitivo per maturare delle vie aeree cellule epiteliali. Questa tecnica utilizza differenziazione 3-dimensionale impalcature polmone decellularized di indirizzare specifiche lignaggio del polmone, in un ambiente culturale privo di siero definito.

Generazione di cellule di topo Airway epiteliali ESC-derivati ​​dall&#39;uso di decellularized Lung Ponteggi

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) hanno la capacità intrinseca di differenziare e di auto-organizzarsi in schemi dei tessuti distinti; anche se questo richiede la presentazione di gradienti spaziali ambientali. Presentiamo stencil micropatterning come metodo semplice e robusto per generare gradienti biochimici e meccanici per controllare modelli differenziazione HPSC.

Stencil micropatterning di cellule staminali umane pluripotenti per Probing spaziale Organizzazione di differenziazione Fates

Presentato qui è un protocollo per la generazione di una coltura unicellulare di cellule staminali embrionali umane e la loro successiva differenziazione in cellule progenitrici neurali. Il protocollo è semplice, robusto, scalabile e adatto per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa.

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule funzionali simili a epatociti (HHC) completando continuamente Activin A e CHIR99021 durante la differenziazione hESC in endoderma definitivo (DE).

Un metodo efficiente per l'induzione di cellule simili a epatociti diretti da cellule staminali embrionali umane

Per evitare le limitazioni associate al passaggio enzimatico o meccanico di cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) coltivate su cellule feeder, abbiamo stabilito un metodo rapido, efficace, economico e ad alto rendimento per la raccolta di colonie hESC o hiPSC mantenute su uno strato di cellule feeder di fibroblasti prepuzi umani utilizzando la disadesione mediata da EDTA.

Passaggio rapido, economico e privo di enzimi di cellule staminali pluripotenti umane su cellule nutritrici mediante disadesione mediata dall'acido etilendiamminotetraacetico

Il presente protocollo mostra come differenziare le cellule CD3−/CD45+CD56+ con citotossicità lieve dalle cellule staminali umane a potenziale espanso (hEPSC) sia in condizioni di coltura 3D che 2D. Ciò consente la convalida fenotipica di routine senza la distruzione del complesso microambiente.

Generazione di cellule Natural Killer da cellule staminali umane espanse

Questo protocollo descrive la generazione di organoidi epatici endodermici (eHEPO) veloci e riproducibili. Con questo protocollo, gli eHEPO possono essere prodotti entro 2 settimane e ampliati a lungo termine (più di 1 anno) senza perdere la loro differenziazione e funzionalità.

Generazione di organoidi epatici endodermici funzionali

Scopri un metodo rapido per purificare cellule endodermali da cellule staminali embrionali umane usando separazione con microsfere magnetiche. Questa tecnica migliora le applicazioni di ricerca nello sviluppo endodermico.

Un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane

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