Cutanea denervazione chirurgica: Un metodo per il test il requisito per i nervi in ​​modelli murini di malattia della pelle

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare l'influenza dei nervi sulla pelle normale e patologica. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nella normale biologia della pelle, ad esempio se i nervi cutanei influenzano l'omeostasi e la malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile confrontare campioni di pelle intatta e denervata dello stesso animale.

La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale in quanto i nervi possono essere difficili da riconoscere e rimuovere con danni minimi ai tessuti circostanti. Per prima cosa, anestetizzare il topo e verificare che abbia raggiunto il piano corretto di sedazione utilizzando un pizzico di punta. Inoltre, conferma che il topo mostra una respirazione e un battito cardiaco normali.

Ora metti l'animale su un cuscinetto riscaldante in un'area chirurgica asettica. Utilizzando un tagliacapelli elettrico, rimuovere con cura i peli dal lato dorsale dove verrà eseguita la biopsia. Quindi pulire l'area rasata con Betadyne e salviettine imbevute di alcol.

Assicurati che tutti i ritagli di capelli siano stati rimossi dal sito. Ora delinea il sito della biopsia usando un pennarello nero. Per ottenere sezioni longitudinali dei follicoli piliferi, il bordo più lungo della biopsia deve essere eseguito in direzione da anteriore a posteriore parasetidale alla linea mediana dorsale.

Utilizzando un bisturi, eseguire un'escissione a tutto spessore senza danneggiare la fascia muscolare sottostante. Il sanguinamento è in genere minimo. Il campione bioptico deve includere l'epidermide, il derma, il grasso sottocutaneo e il pannicolo carnoso.

Appiattire il campione di pelle asportata su un tovagliolo di carta asciutto, con il derma rivolto verso il basso. Tagliare via il tovagliolo di carta in eccesso e conservare il campione su TBS freddo per un massimo di un'ora se è necessario raccogliere altri campioni. Tornando al topo, suturare il sito della biopsia utilizzando 60 punti di sutura di nylon a circa tre millimetri di distanza.

Quindi monitora il topo in una gabbia di recupero fino a quando non riprende conoscenza. Usa gli analgesici in conformità con la cura degli animali designata dall'istituto e segui le loro linee guida se il topo appare angosciato. Entro sette-10 giorni dall'intervento, rimuovere i punti di sutura.

Procedere con l'elaborazione delle biopsie per l'istologia o la colorazione dell'intera montatura. Anestetizzare l'animale, radere l'intera pelle dorsale e pulire l'area in modo simile alla procedura di biopsia. Ora fai un'incisione usando un bisturi sterile lungo la linea mediana dorsale dalla base del collo a circa mezzo centimetro sopra la coda.

Usando una pinza smussata sterile, ritrarre delicatamente la pelle sul lato sinistro lontano dal fianco per visualizzare il tessuto sottostante dai cuscinetti adiposi scapolari vicino al collo fino a poco sopra l'arto posteriore. Ora identifica il nervo cutaneo dorsale con un microscopio ottico da dissezione. Questi appaiono come filamenti bianchi che viaggiano caudalmente attraverso la fascia traslucida della parete del tronco prima di fare curve strette ed entrare nel tessuto connettivo sciolto sotto la pelle.

Successivamente, utilizzando una pinza ultrafine, rimuovere il nervo esclusivamente dal lato sinistro dell'animale situato nei siti anatomici da T3 a T12 strappandoli da dove i loro segmenti si piegano sulla parete del tronco fino ai loro siti di ingresso nella pelle. Orientare il forcipe verticalmente e afferrare i nervi a circa mezzo centimetro sotto i loro siti di curvatura. Una volta afferrato, tirare verso l'alto per far allungare i nervi e separarsi dal tessuto circostante per rimuoverli.

Evitare di danneggiare i vasi sanguigni adiacenti. Assicurati di mantenere il tessuto umido durante tutta la procedura applicando periodicamente gocce di soluzione salina ancora allo 0,9%. Continuare a rimuovere tutti i nervi che si estendono dalla parete del tronco alla pelle, ma non interrompere i nervi all'interno della fascia densa della parete del tronco.

Quindi, rimuovere eventuali nervi dal lembo cutaneo esposto. Queste fibre comprendono i rami distali del nervo cutaneo dorsale e appaiono come filamenti ramificati bianchi situati sporadicamente all'interno del tessuto connettivo sul lato dermico del lembo cutaneo. Per rimuovere questi rami sottili, posizionare la pinza all'incirca parallela alla superficie dermica, afferrare il nervo e strappare verso l'alto.

Rimuovi tutti i nervi visibili in questo modo. Non perforare i vasi sanguigni e la pelle. Durante questa fase, è importante evitare di rompere i vasi sanguigni vicini.

Se trovi un nervo con un vaso sanguigno adiacente, seguilo eventualmente fino a un'area dove non c'è un vaso adiacente e rimuovilo strappandolo. Ora, allenta la pelle sul lato destro dell'incisione della linea mediana dorsale, ma non rimuovere alcun nervo. Questo servirà come controllo operativo fittizio controlaterale.

Infine, suturare l'animale e monitorare il post-operatorio come prima. Successivamente, per confermare la perdita stabile dei nervi, settimane dopo l'intervento chirurgico, pungere delicatamente l'area denervata utilizzando un ago ipodermico sterile. Nota se l'animale risponde, in genere rabbrividendo o girando la testa.

Se l'area della pelle è stata denervata in modo stabile, l'animale mostrerà poca o nessuna risposta. Raccogliere biopsie cutanee dall'area di assenza di risposta e dal lato fittizio controlaterale per campioni sperimentali e di controllo abbinati. Dalle biopsie, è importante campionare più sezioni istologiche per identificare potenziali differenze nell'abbondanza della cupola tattile o nella morfologia tra i campioni fittizi e denervati.

Il ceppo di topo glebe one cree ERT2 consente di indirizzare la ricombinazione genetica indotta dal tamoxifene alle aree della pelle che mostrano un'elevata attività della via del riccio, come gli epiteli della cupola tattile. Questi topi sono stati incrociati per indurre i topi reporter abolaxi a visualizzare gli epiteli della cupola tattile. I nodi sono cruciali per mantenere sia le normali cupole tattili che le celle di Merkel associate.

Ciò è dimostrato sperimentalmente dalla graduale perdita della normale morfologia della cupola tattile e dalla perdita di otto cellule depositate dalla cheratina dopo la denervazione. I nervi sono anche cruciali per promuovere la segnalazione del riccio nella cupola tattile monitorata dalle espressioni Glebe one cree ERE2 e dalla colorazione collettiva beta montata a casa sia dalla pelle fittizia che da quella denervata. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ablare chirurgicamente i nervi cutanei dorsali per verificare se questi nervi sono coinvolti nella normale funzione cutanea o se modulano la malattia.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in modo regolare e affidabile con il minimo stress per l'animale. Seguendo questa procedura, metodi come la colorazione con amminofluorescenza possono essere utilizzati per confermare se i nervi sono completamente ablati dalla pelle e se l'espressione genica è influenzata.