Un Coroide Plesso epiteliali modello cellulare della Barriera Fluid Sangue umano-cerebrospinale per studiare l'infezione batterica dal lato basolaterale

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di generare un modello basato su cellule epiteliali del plesso coroideo della barriera sangue-liquido cerebrospinale umano. Permette lo studio delle infezioni batteriche dal lato basale-laterale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulle malattie infettive del sistema nervoso centrale, come ad esempio quali processi sono coinvolti durante le interazioni batteriche con l'epitelio del plesso coroideo.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'analisi delle interazioni dei patogeni con il lato nero laterale basale delle cellule epiteliali. Questo metodo può essere applicato anche ad altri studi, come ad esempio lo studio della trasmigrazione delle cellule immunitarie e delle cellule tumorali attraverso l'epitelio del plesso coroideo. Ho avuto l'idea di utilizzare il papilloma del plesso corcoideo umano, o cellule HIBCCP, per questo metodo quando ho letto il manoscritto del 2005 di Shibata et.al.

Descrizione della linea cellulare. Iniziare utilizzando una pinza sterile per posizionare inserti filtranti per colture cellulari con area di crescita quadrata di 0,33 centimetri, con pori di tre micron capovolti in pozzetti individuali di una piastra a dodici pozzetti. Quindi, con una pipetta sierologica, inondare il pozzetto con circa tre millilitri del terreno preriscaldato, aspirando l'eventuale soluzione in eccesso, fino a riempire appena il compartimento inferiore.

Quindi, aggiungere 100 micrometri di terreno di sottocoltura a 37 gradi integrato con il dieci percento di FCS sopra il filtro. Quando si aggiunge il terreno è molto importante evitare la generazione di bolle d'aria, poiché le bolle impediranno alle celle di essere alimentate a sufficienza. Quando il fluido è stato aggiunto a tutti gli inserti, coprire la piastra e trasferire gli inserti in un incubatore a CO2 al cinque percento a 37 gradi Celsius.

Ora, lavare un pallone di celle HIBCPP con dieci millilitri di PVS, due volte con roteazione. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere tre millilitri di tripsyn EDTA allo 0,25% alle cellule e agitare il pallone. Quindi, incubare le cellule per una ventina di minuti.

Al termine dell'incubazione, verificare che le celle siano state sollevate dal fondo del pallone e che presentino una forma rotonda. Le cellule non si staccano completamente l'una dall'altra e si trovano spesso negli agglomerati. Risospendere la coltura con 17 millilitri di terreno per fermare la reazione e trasferire la sospensione in una provetta da 50 millilitri.

Quindi, far girare le celle e risospendere il pellet in un volume appropriato di terreno per il conteggio. Quindi, diluire le cellule a una concentrazione di una volta dieci per sesta cellula per millilitro e capovolgere la provetta per distribuire uniformemente le cellule. Quindi, aggiungere 80 microlitri di celle sulla parte superiore di ciascun inserto del filtro.

Quando tutti gli inserti sono stati seminati, coprire la piastra e rimetterla nell'incubatrice per la coltura notturna. Il giorno successivo, aggiungere un millilitro di terreno a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Quindi, utilizzando una pinza, sollevare ciascun inserto e scartare il fluido all'interno, posizionando gli inserti con il lato destro rivolto verso l'alto nei singoli pozzetti della piastra a 24 pozzetti.

Quando gli inserti del filtro vengono capovolti dalla piastra a 12 pozzetti a quella a 24 pozzetti, fare attenzione a non toccare la membrana del filtro con le celle che crescono sopra. Riempire gli inserti con 0,5 millilitri di terreno fresco e rimettere la piastra nell'incubatrice. Trasferire gli inserti in una nuova piastra a 24 pozzetti con terreno fresco ogni due giorni, sostituendo così il terreno nello scomparto superiore.

Per misurare la resistenza elettrica transepiteliale, o TEER, delle cellule, immergere prima le punte degli elettrodi di un volt-ohmmetro di tessuto epiteliale in etanolo all'80%. Dopo 15 minuti, rimuovere l'elettrodo dall'etanolo per consentire all'elettrodo di asciugarsi. Quindi, metti le punte in un'aliquota di subcoltura per altri 15 minuti.

Quando l'elettrodo si è bilanciato, posizionare il braccio più lungo in modo che tocchi la parte inferiore dello scomparto inferiore di un pozzetto della piastra di coltura cellulare e il braccio più corto in modo che raggiunga lo scomparto dell'inserto del filtro. Misurare i valori di resistenza degli inserti filtranti per colture cellulari in terreno senza cellule per ottenere i valori del bianco. Quindi, misurare il TEER di ciascuno degli inserti seminati.

Dopo la misurazione, riposizionare l'elettrodo in etanolo all'80% per 15 minuti, quindi riporlo in una provetta asciutta. Quando i valori TEER degli inserti seminati HIBCPP superano i 70 ohm per centimetro quadrato, rinnovare il terreno utilizzando un terreno di coltura fresco integrato con cinque microgrammi per millilitro di insulina e l'uno per cento di FCS e rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari durante la notte. Per determinare la permeabilità paracellulare delle colture in inserto, aggiungere 50 microgrammi per millilitro di FITC-inulina appena preparata in siero fresco a bassa coltura nel vano filtrante superiore di ciascun inserto e rimettere le cellule nell'incubatore.

Quando le colture hanno raggiunto un TEER di circa 500 ohm per centimetro quadrato, infettare le cellule con una sospensione batterica di interesse a una molteplicità di infezione di dieci, e rimettere le cellule nell'incubatore per il periodo di coltura appropriato. Quindi, lavare le cellule tre volte trasferendo il filtro in un nuovo pozzetto con un millilitro di terreno privo di siero. Ogni volta, posizionare il terreno nel vano filtrante con 500 microlitri dello stesso mezzo, infine, determinare la concentrazione di inulina che è passata dal vano filtrante attraverso lo strato cellulare dopo l'infezione batterica raccogliendo campioni di terreno dal pozzetto inferiore di ciascun inserto filtrante per colture cellulari e misurando tutti i campioni in un lettore di micropiastre rispetto a dieci diluizioni standard di una e due FITC-inulina.

Le cellule HIBCCP mostrano specifiche funzioni di barriera che consentono loro di limitare i loro scambi molecolari in misura modesta. Ad esempio, le analisi immunofluorescenti della giunzione tipo associata alla proteina, ZO-1, Occludina e Claudina-1, rivelano un segnale ininterrotto nei siti di contatto cellula-cellula. Illustrare l'interconnessione delle cellule mediante filamenti continui di giunzioni strette.

Quando coltivate in condizioni appropriate, le cellule HIBCPP mostrano un elevato potenziale di membrana, che raggiunge fino a circa 500 ohm per centimetro quadrato senza trattamento, mantenendo le funzioni di barriera tipiche della barriera sangue-liquido cerebrospinale, come la formazione di un potenziale di membrana, nonché una bassa permeabilità per le macro molecole. Con l'aumentare delle concentrazioni di DMSO, tuttavia, i valori di TEER diminuiscono in modo dose-dipendente, con un calo significativo del valore di TEER osservato dopo il trattamento con citocalasina D. Inoltre, l'aggiunta del due percento in volume di DMSO, o citocalasina D, determina un corrispondente aumento significativo della permeabilità per il flusso di FITC-inulina.

Inoltre, l'infezione batterica delle cellule HIBCCP provoca una significativa invasione dello strato cellulare da parte di due ceppi batterici patogeni. MC58 e il suo mutante carente di capsule. Mentre si osserva solo un'invasione minore per il ceppo alfa 14 apatogeno.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non toccare la membrana del filtro dopo aver seminato le cellule, poiché lo strato di HIBCCP intatto verrà interrotto dal contatto. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come i saggi di trasmigrazione in vitro, per rispondere a ulteriori domande sui meccanismi di migrazione delle cellule immunitarie e tumorali attraverso le cellule epiteliali del plesso coroideo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della farmacologia per esplorare il trasferimento di substrati attraverso l'epitelio del plesso coroideo in vitro.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare un modello basato su cellule HIBCCP della barriera sangue-liquido cerebrospinale per l'infezione laterale basale con agenti patogeni. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni umani può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare sotto un cappuccio di sicurezza appropriato.