Un Coroide Plesso epiteliali modello cellulare della Barriera Fluid Sangue umano-cerebrospinale per studiare l'infezione batterica dal lato basolaterale

L'obiettivo generale di questo metodo è generare un modello basato su cellule epiteliali del plesso coroideo umano della barriera emato-encefalica liquorale. Permettendo lo studio delle infezioni batteriche a partire dal lato baso-laterale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo le malattie infettive del Sistema Nervoso Centrale, ad esempio quali processi sono coinvolti durante le interazioni batteriche con l'epitelio del plesso coroideo.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'analisi delle interazioni tra patogeni e il lato basolaterale nero delle cellule epiteliali. Questo metodo può essere applicato anche ad altri studi, ad esempio all'indagine sulla transmigrazione di cellule immunitarie e cellule tumorali attraverso l'epitelio del plesso coroideo. Ebbi per la prima volta l'idea di utilizzare le cellule di papilloma del plesso coroideo umano, o cellule HIBCCP, per questo metodo quando lessi il manoscritto del 2005 di Shibata et al.

che descrive la linea cellulare. Iniziare utilizzando pinzette sterili per posizionare inserti per coltura cellulare con area di crescita di 0,33 centimetri quadrati e pori di dimensione di tre micron, capovolti, in ciascun pozzetto di una piastra a dodici pozzetti. Successivamente, con una pipetta sierologica, riempire il pozzetto con circa tre millilitri di mezzo preriscaldato, aspirando la soluzione in eccesso, fino a quando il compartimento inferiore risulta appena riempito.

Successivamente, aggiungere 100 micrometri di mezzo di subcoltura a 37 gradi, integrato con il dieci percento di FCS, sopra il filtro. Durante l'aggiunta del mezzo è molto importante evitare la formazione di bolle d'aria, poiché le bolle impedirebbero un adeguato nutrimento delle cellule. Una volta aggiunto il mezzo a tutti gli inserti, coprire la piastra e trasferire gli inserti in un incubatore a 37 gradi Celsius con cinque percento di CO2.

Ora, lavare un flacone di cellule HIBCPP con dieci millilitri di PVS, due volte agitando. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere tre millilitri di tripsina 0,25 percento con EDTA alle cellule e agitare il flacone. Quindi, incubare le cellule per circa venti minuti.

Al termine dell'incubazione, verificare che le cellule si siano staccate dal fondo della fiasca e presentino una forma rotonda. Le cellule non si distaccano completamente l'una dall'altra e spesso si trovano in agglomerati. Ri-sospendere la coltura con 17 millilitri di mezzo per arrestare la reazione e trasferire la sospensione in un tubo da 50 millilitri.

Quindi, centrifugare le cellule e risospendere il pellet in un volume appropriato di mezzo per il conteggio. Successivamente, diluire le cellule fino a una concentrazione di un milione di cellule per millilitro e capovolgere il tubo per distribuire uniformemente le cellule. Quindi, aggiungere 80 microlitri di cellule sulla parte superiore di ciascun inserto filtrante.

Dopo aver seminato tutti gli inserti, coprire la piastra e riporla nell'incubatore per una coltura notturna. Il giorno successivo, aggiungere un millilitro di mezzo in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Quindi, utilizzando delle pinzette, sollevare ciascun inserto e scartare il mezzo al suo interno, posizionando gli inserti con la parte superiore rivolta verso l'alto in pozzetti singoli della piastra a 24 pozzetti.

Quando si trasferiscono i supporti con filtro dalla piastra a 12 pozzetti alla piastra a 24 pozzetti, fare attenzione a non toccare la membrana del filtro con le cellule che crescono sulla superficie superiore. Riempire i supporti con 0,5 millilitri di mezzo fresco e reinserire la piastra nell'incubatore. Trasferire i supporti in una nuova piastra a 24 pozzetti contenente mezzo fresco ogni due giorni, sostituendo così il mezzo nel compartimento superiore.

Per misurare la resistenza elettrica transepiteliale, o TEER delle cellule, immergere prima le punte dell'elettrodo di un volt-ohmmetro per tessuti epiteliali nell'etanolo all'80 percento. Dopo 15 minuti, rimuovere l'elettrodo dall'etanolo per permettere all'elettrodo di asciugarsi. Successivamente, posizionare le punte in un'aliquote di mezzo di subcoltura per altri 15 minuti.

Una volta che l'elettrodo ha raggiunto l'equilibrio, posizionare il braccio più lungo in modo che tocchi il fondo del compartimento inferiore di una pozzetta della piastra per colture cellulari, e il braccio più corto in modo che entri nel compartimento del filtro inserito. Misurare i valori di resistenza dei filtri per colture cellulari in mezzo privo di cellule per ottenere i valori di bianco. Successivamente, misurare il TEER di ciascun inserto seminato.

Dopo la misurazione, riposizionare l'elettrodo nell'etanolo all'80 percento per 15 minuti, seguito dallo stoccaggio in un tubo asciutto. Quando i valori di TEER degli inserti seminati con HIBCPP superano i 70 ohm per centimetro quadrato, rinnovare il mezzo con mezzo di coltura fresco integrato con cinque microgrammi per millilitro di insulina e uno percento di FCS, quindi reinserire la piastra nell'incubatrice per colture cellulari per tutta la notte. Per determinare la permeabilità paracellulari delle colture negli inserti, aggiungere 50 microgrammi per millilitro di FITC-inulina appena preparata in mezzo di coltura fresco a basso contenuto di siero nel compartimento superiore del filtro di ciascun inserto, quindi reinserire le cellule nell'incubatrice.

Quando le colture hanno raggiunto un valore di TEER di circa 500 ohm per centimetro quadrato, infettare le cellule con una sospensione batterica di interesse a una multiplicità di infezione di dieci e reinserire le cellule nell'incubatrice per il periodo di coltura appropriato. Successivamente, lavare le cellule tre volte trasferendo il filtro in una nuova pozzetta contenente un millilitro di mezzo privo di siero. Ogni volta, aggiungere il mezzo nel compartimento del filtro con 500 microlitri dello stesso mezzo. Infine, determinare la concentrazione di inulina che ha attraversato il compartimento del filtro attraverso lo strato cellulare dopo l'infezione batterica, raccogliendo campioni di mezzo dalla pozzetta inferiore di ciascun inserto per coltura cellulare con filtro e misurando tutti i campioni in un lettore per micropiastre confrontandoli con dieci diluizioni standard di FITC-inulina uno e due.

Le cellule HIBCCP mostrano specifiche funzioni di barriera che permettono loro di limitare in modo modesto gli scambi molecolari. Ad esempio, analisi di immunofluorescenza del tipo di giunzione associata alle proteine ZO-1, Occludina e Claudina-1 rivelano un segnale continuo nei siti di contatto tra cellula e cellula, illustrando l'interconnessione delle cellule mediante filamenti continui di giunzioni strette.

Quando coltivate in condizioni appropriate, le cellule HIBCPP mostrano un elevato potenziale di membrana, che raggiunge fino a circa 500 ohm per centimetro quadrato senza trattamento, mantenendo le tipiche funzioni di barriera della barriera emato-encefalica, come la formazione di un potenziale di membrana, nonché una bassa permeabilità per le macromolecole. Tuttavia, all'aumentare delle concentrazioni di DMSO, i valori di TEER diminuiscono in modo dose-dipendente, con una riduzione significativa simile osservata dopo il trattamento con Citocalasina D. Inoltre, l'aggiunta del due percento in volume di DMSO o di Citocalasina D determina un corrispondente aumento significativo della permeabilità al flusso di FITC-insulina.

Inoltre, l'infezione batterica delle cellule HIBCCP provoca un'invasione significativa dello strato cellulare da parte di due ceppi batterici patogeni, MC58 e il suo mutante privo di capsula, mentre per il ceppo apatogeno alpha 14 si osserva soltanto una lieve invasione.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di non toccare la membrana del filtro dopo aver seminato le cellule, poiché il contatto potrebbe alterare lo strato integro di HIBCCP. Al termine di questa procedura, altri metodi come saggi di trasmissione *in vitro* possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande sui meccanismi di migrazione delle cellule immunitarie e tumorali attraverso le cellule epiteliali del plesso coroideo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della farmacologia per esplorare il trasferimento di substrati attraverso l'epitelio del plesso coroideo *in vitro*.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare un modello cellulare HIBCCP della barriera emato-encefalica per l'infezione basolaterale con agenti patogeni. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni umani può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come ad esempio lavorare sotto una cappa di sicurezza adeguata, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.