Rilevamento Cortex Frammenti Durante la germinazione delle spore batteriche

L'obiettivo generale di questo protocollo passo dopo passo è quantificare l'abbondanza di frammenti del cortex o di zuccheri riducenti durante la germinazione delle spore batteriche. Questo metodo illustrerà le fasi necessarie per rilevare la presenza di frammenti del cortex o di zuccheri riducenti durante la germinazione delle spore. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la maggior parte dei laboratori dispone dei reagenti e delle attrezzature necessarie per eseguire con successo il protocollo.

Iniziare questa procedura posizionando un tubo contenente spore di Clostridium difficile in un blocco riscaldante e incubandolo a 65 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, posizionare il tubo sul ghiaccio. La soluzione di germinazione è specifica per la specie di spora batterica in studio.

Per il saggio di germinazione delle spore di C.difficile, utilizziamo una soluzione di Tris 10 millimolare a pH 7,5 con 150 millimolari di cloruro di sodio, 100 millimolari di glicina e 10 millimolari di acido taurocolico in acqua deionizzata. Preparare un millilitro di soluzione di germinazione per ogni campione più un millilitro aggiuntivo. Prima di iniziare il saggio, trasferire un millilitro della soluzione di germinazione in una provetta da microcentrifuga e metterla da parte.

Questo servirà come controllo negativo per la rilevazione dei frammenti di cortex. Successivamente, aggiungere alla soluzione di germinazione spore fino a un OD600 di circa 3,0 e vortexare brevemente. Questa quantità di spore si è dimostrata ottimale per modulare il rilascio di frammenti di cortex durante la germinazione delle spore di C.difficile.

Immediatamente dopo aver aggiunto le spore, prelevare un campione di 1,2 millilitri e trasferirlo in un nuovo tubo da microcentrifuga, quindi inserirlo nella centrifuga. Centrifugare quindi per un minuto a temperatura ambiente a 14.000 × g. Questo è il punto zero del tempo. Al termine della centrifugazione, trasferire un millilitro del soprannatante in un tubo fresco da due millilitri con tappo a vite e congelarlo a -80 gradi Celsius.

Ripetere il processo di prelievo di aliquote, centrifugazione e congelamento a intervalli regolari fino a quando non sono stati raccolti campioni per ciascun punto temporale. A causa del tempo necessario per la centrifugazione e il campionamento, non è possibile ottenere punti temporali inferiori a due minuti durante questa procedura; pertanto, questi campioni vengono prelevati ogni due minuti per un totale di 14 minuti. Durante la preparazione dei campioni corticali, qualora fosse necessario monitorare l'acido dipicolinico, prelevare un'ulteriore aliquota di 100 microlitri e dispensarla in un tubo da microcentrifuga posto sul ghiaccio.

Preparare inoltre campioni per la generazione di una curva standard contenente le seguenti quantità di N-acetilglucosamina: zero, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 e 5.000 nanomoli in soluzione di germinazione. Dopo aver raccolto un campione per ciascun punto temporale, rimuovere i campioni dal congelatore e liofilizzarli insieme al bianco e ai campioni della curva standard.

Quindi, conservare tutti i campioni a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Nel giorno del saggio, risospendere i campioni liofilizzati, compresi i controlli e i campioni della curva standard, in 120 microlitri di acido cloridrico con fenolo e beta-mercaptoetanolo. Successivamente, trasferire tutti i campioni risospesi in nuove provette da due millilitri con tappo a vite.

Quindi incubarli in un bagnomaria a circolazione a 95 gradi Celsius per quattro ore. Dopo l'incubazione, posizionare i campioni sul ghiaccio fino a quando non si saranno raffreddati. Quindi aggiungere 120 microlitri di idrossido di sodio tre molare per neutralizzarli.

Successivamente, aggiungere 80 microlitri di una soluzione satura di bicarbonato di sodio e 80 microlitri di una soluzione al 5% di anidride acetica a ciascun campione ed eseguire un vortex. Quindi, incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire nuovamente i campioni nel bagnomaria a 95 gradi Celsius per esattamente tre minuti.

Si noti che questo passaggio è sensibile al tempo e tempi più lunghi possono influenzare lo sviluppo del segnale nelle fasi successive. Rimuovere i campioni dal bagno termico e raffreddarli in ghiaccio. Aggiungere 400 microlitri di tetraborato di potassio tetraidrato al 6,54% in ogni provetta e vortexare.

Incubare i campioni in un bagno d'acqua a circolazione a 95 gradi Celsius esattamente per sette minuti. Anche questo passaggio è sensibile al tempo. Rimuovere i campioni e posizionarli sul ghiaccio per cinque minuti.

Mentre i campioni sono sul ghiaccio, preparare il reagente colorimetrico. Sciogliere 0,320 grammi di DMAB in 1,9 millilitri di acido acetico glaciale. Si noti che questo reagente è sensibile al tempo, alla temperatura e alla luce e non deve essere preparato in anticipo.

Dopo che il DMAB si è completamente sciolto, aggiungere 100 microlitri di acido cloridrico 10 normali e vortexare il campione. Quindi aggiungere cinque millilitri di acido acetico glaciale e vortexare nuovamente. Per la reazione colorimetrica, trasferire 100 microlitri di ciascun campione di corteccia o controllo raffreddato in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Aggiungere 700 microlitri della soluzione cromogenica appena preparata a ciascun campione. Trasferire immediatamente i campioni in un bagno termostatato a 37 gradi Celsius e incubare i campioni esattamente per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire 200 microlitri di ciascun campione in una piastra trasparente a 96 pozzetti.

I campioni all'inizio dovrebbero essere di colore giallo, ma diventeranno viola in presenza di zuccheri riducenti, indicativi della presenza di corteccia. In questo caso, molti campioni non mostrano un colore viola visibile. Tuttavia, i campioni da 250, 500 e 5.000 nanomoli appaiono visivamente diversi rispetto al controllo negativo da zero nanomoli.

Utilizzando un lettore di piastre, determinare l'assorbanza a 585 nanometri. Quando misurata a una densità ottica di 585 nanometri, il segnale generato dai campioni standard si adatta meglio a una regressione lineare. Questa tabella mostra risultati tipici ottenuti con standard di N-acetilglucosamina.

Questi dati sono stati quindi utilizzati per generare la curva standard mostrata qui. È stato eseguito un saggio di germinazione in condizioni che promuovono la germinazione, utilizzando un buffer di germinazione integrato con 100 millimolar di glicina e 10 millimolar di acido taurocolico. In condizioni non germinative, solo 100 millimolar di glicina.

In assenza di acido taurocolico, le spore di C. difficile non germinano e non si osserva un significativo cambiamento nella presenza di frammenti di corteccia in soluzione. Tuttavia, in presenza sia di acido taurocolico che di glicina, le spore di C. difficile germinano e rilasciano frammenti di corteccia nella soluzione. Questo fenomeno si manifesta come un aumento dell'OD585 nel tempo nei campioni reagenti.

La quantità di frammenti di cortex rilasciati durante questo saggio è stata calcolata utilizzando una curva standard. Come si può osservare in questo saggio, la maggior parte del cortex è stata idrolizzata o rilasciata entro 15 minuti dall'esposizione al germinante. Ciò suggerisce che la maggior parte delle spore si è germinata in questo lasso di tempo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare frammenti corticali o zuccheri riducenti in una soluzione di germinazione durante la germinazione delle spore batteriche. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante prestare molta attenzione ai tempi di reazione affinché il saggio si sviluppi correttamente.