Rilevamento Cortex Frammenti Durante la germinazione delle spore batteriche

L'obiettivo generale di questo protocollo passo-passo è quantificare l'abbondanza di frammenti di corteccia o di zuccheri riducenti durante la germinazione batterica delle spore. Questo metodo descriverà in dettaglio i passaggi necessari per rilevare la presenza di frammenti di corteccia o zuccheri riducenti durante la germinazione delle spore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la maggior parte dei laboratori dispone dei reagenti e delle attrezzature necessarie per completare con successo il protocollo.

Inizia questa procedura posizionando un tubo di spore di Clostridium difficile in un blocco riscaldante e incubandolo a 65 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, posizionare la provetta sul ghiaccio. La soluzione di germinazione è specifica per la specie di spora batterica oggetto di studio.

Per saggiare la germinazione delle spore di C.difficile, utilizziamo una soluzione di Tris 10 millimolari a pH 7,5 con 150 millimolari di cloruro di sodio, 100 millimolari di glicina e 10 millimolari di acido taurocolico in acqua deionizzata. Preparare un millilitro di soluzione di germinazione per campione più un ulteriore millilitro. Prima di iniziare il saggio, trasferire un millilitro della soluzione di germinazione in una provetta da microcentrifuga e metterla da parte.

Questo servirà come spazio vuoto per il rilevamento dei frammenti di corteccia. Successivamente, alla soluzione di germinazione, aggiungere spore a un OD600 di circa 3,0 e vorticare brevemente. Questa quantità di spore funziona bene per moderare il rilascio di frammenti di corteccia durante la germinazione delle spore di C.difficile.

Immediatamente dopo aver aggiunto le spore, rimuovere un campione da 1,2 millilitri in una nuova provetta da microcentrifuga e inserirlo nella centrifuga. Quindi centrifugare a temperatura ambiente per un minuto a 14.000 volte G.Questo è il punto di tempo zero. Dopo la centrifuga, trasferire un millilitro di surnatante in una provetta fresca da due millilitri con tappo a vite e congelarla a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Ripetere il processo di prelievo delle aliquote, rotazione e congelamento a intervalli regolari fino a quando il campione non è stato raccolto per ogni punto temporale. A causa del tempo necessario per la centrifugazione e il campionamento, durante questa procedura non è possibile ottenere punti temporali inferiori a due minuti, quindi questi campioni vengono prelevati una volta ogni due minuti per 14 minuti. Durante la preparazione dei campioni di corteccia, nel caso in cui sia necessario monitorare l'acido dipicolinico, rimuovere un campione separato da 100 microlitri e distribuirlo in una provetta da microcentrifuga con ghiaccio.

Preparare anche i campioni per generare una curva standard con le seguenti quantità di N-acetilglucosamina. Zero, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 e 5.000 nanomoli nella soluzione di germinazione. Dopo aver raccolto un campione per ogni punto temporale, rimuovere i campioni dal congelatore e liofilizzarli insieme al bianco e ai campioni con curva standard.

Quindi conservare tutti i campioni a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Il giorno del saggio, risospendere i campioni liofilizzati, compresi i campioni di controllo e i campioni con curva standard, in 120 microlitri di acido cloridrico con fenolo e beta-mercaptoetanolo. Quindi, trasferire tutti i campioni risospesi in provette fresche con tappo a vite da due millilitri.

Quindi incubarli in un bagno d'acqua a ricircolo a 95 gradi Celsius per quattro ore. Dopo l'incubazione, posizionare i campioni sul ghiaccio fino a quando non si sono raffreddati. Quindi aggiungere 120 microlitri di idrossido di sodio a tre molari per neutralizzarli.

Quindi, aggiungere 80 microlitri di una soluzione satura di bicarbonato di sodio e 80 microlitri di una soluzione di anidride acetica al 5% a ciascun campione e agitarlo. Quindi incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo l'incubazione, trasferire nuovamente i campioni nel bagno d'acqua a 95 gradi Celsius per esattamente tre minuti.

Si noti che questo passaggio è sensibile al tempo e tempi più lunghi possono influire sullo sviluppo del segnale a valle. Togliere i campioni dal bagnomaria e raffreddarli con ghiaccio. Aggiungere 400 microlitri di tetraborato di potassio al 6,54% tetraidrato a ciascun tubo e vortice.

Incubare i campioni in un bagno d'acqua a ricircolo a 95 gradi Celsius per esattamente sette minuti. Questo passaggio è anche sensibile al tempo. Rimuovere i campioni e metterli sul ghiaccio per cinque minuti.

Mentre i campioni sono in ghiaccio, preparare il reagente colorante. Sciogliere 0,320 grammi di DMAB in 1,9 millilitri di acido acetico glaciale. Si noti che questo reagente è sensibile al tempo, alla temperatura e alla luce e non deve essere preparato in anticipo.

Dopo che il DMAB si è completamente sciolto, aggiungere 100 microlitri di acido cloridrico normale 10 e agitare il campione. Quindi aggiungere cinque millilitri di acido acetico glaciale e vorticare di nuovo. Per la reazione colorimetrica, trasferire 100 microlitri di ciascuna corteccia raffreddata o campione di controllo in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Aggiungere 700 microlitri della soluzione colorante appena preparata a ciascun campione. Trasferire immediatamente i campioni in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e incubare i campioni per 20 minuti esatti. Dopo l'incubazione, trasferire 200 microlitri di ciascun campione in una piastra trasparente a 96 pozzetti.

I campioni dovrebbero essere di colore giallo all'inizio, ma passeranno al viola se è presente lo zucchero riducente, che indica la presenza di corteccia. Qui, molti dei campioni non mostrano un colore viola visibile. Tuttavia, i campioni di 250, 500 e 5.000 nanomoli appaiono visivamente diversi dal nanomole zero del controllo negativo.

Utilizzando un lettore di piastre, determinare l'assorbanza a 585 nanometri. Se misurato in un diametro esterno di 585 nanometri, il segnale generato dai campioni standard si adatta meglio a una regressione lineare. Questa tabella mostra i risultati tipici utilizzando gli standard di N-acetilglucosamina.

Questi dati sono stati poi utilizzati per generare la curva standard mostrata qui. È stato eseguito un saggio di germinazione in condizioni di promozione della germinazione con tampone di germinazione integrato con 100 millimolari di glicina e 10 millimolari di acido taurocolico. In condizioni di non germinazione, solo 100 millimolari di glicina.

In assenza di acido taurocolico, le spore di C.Difficile non germinano e c'è poco cambiamento nella presenza di frammenti di corteccia nella soluzione. Tuttavia, in presenza sia di acido taurocolico che di glicina, le spore di C.difficile germinano e rilasciano frammenti di corteccia nella soluzione. Questo viene assorbito come aumento dell'OD585 nel tempo dei campioni reagiti.

La quantità di frammenti di corteccia rilasciati durante questo test è stata calcolata utilizzando una curva standard. Come si può vedere qui in questo saggio, la maggior parte della corteccia è stata idrolizzata o rilasciata entro 15 minuti di esposizione post-germinazione. Ciò suggerisce che la maggior parte delle spore è germogliata in questo lasso di tempo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare frammenti di corteccia o zuccheri riducenti in una soluzione di germinazione durante la germinazione delle spore batteriche. Durante il tentativo di questa procedura, è importante prestare molta attenzione ai tempi di reazione in modo che il test si sviluppi correttamente.