Valutazione visiva e microscopiche di Streptomyces mutanti inerente allo sviluppo

L'obiettivo generale delle seguenti tecniche è quello di formare ricercatori principianti a lavorare con Streptomyces e altre specie correlate nei laboratori didattici universitari e nelle aule delle scuole superiori. L'osservazione fenotipica è importante per i molti ricercatori che entrano nel campo della ricerca sugli Streptomyces. Questo video descrive i metodi per la propagazione, la conservazione e l'esame visivo e microscopico dei batteri.

I metodi di fenotizzazione qui descritti utilizzano Streptomyces coelicolor come modello. Tuttavia, i metodi sono applicabili a tutti i membri del grande genere e agli Actinomyces strettamente correlati. Il vantaggio principale di queste tecniche è che sono progettate per essere accessibili ai ricercatori alle prime armi in un'aula di scuola superiore o in un laboratorio di insegnamento universitario, nonché al personale di laboratorio esperto.

Dopo aver visto questo video e letto il protocollo di accompagnamento, i nuovi ricercatori dovrebbero essere in grado di manipolare i loro ceppi di Streptomyces, conservarli correttamente e iniziare esperimenti di caratterizzazione visiva. A dimostrare le procedure saranno Garret Kandell e Sean Kirk, studenti universitari di ricerca del mio laboratorio all'Università di Otterbein. Per iniziare, utilizzare un metodo standard, come il metodo della striscia di quadrante dimostrato in Saunders 2012 per striare i ceppi di Streptomyces su piastre di agar MS e la coltura in singole colonie.

Ogni quattro o sei giorni, raccogli una singola colonia e rimettila su un piatto fresco. Man mano che le colonie invecchiano, diventano inclini a mutazioni casuali. Dopo aver effettuato la mutagenesi secondo il protocollo di testo, prendere nota della morfologia della colonia per ciascun mutante rispetto al ceppo parentale wild type.

Quando si caratterizzano nuove specie di Streptomyces, confrontare il nuovo isolato con quello di una specie ben studiata notando la forma di base, la superficie della colonia, l'opacità, l'elevazione e la pigmentazione. Etichettare una piastra di agar MS e striare ceppi wild type e mutanti in modelli a cuneo. Fare attenzione che nessun ceppo tocchi un altro ceppo per evitare la contaminazione incrociata.

Notare la data e l'ora in cui le varietà sono striate sul piatto. Quindi incubare le piastre a 30 gradi Celsius. Ricordate che è estremamente importante proteggere sempre il campione di Streptomyces dalla contaminazione.

Utilizzate la vostra migliore tecnica sterile per tutte le fasi: apertura di piastre e provette per il minor tempo possibile. Posiziona le piastre di Petri coltivate su carta colorata o bianca per omogeneizzare lo sfondo. Scrivi sul foglio il nome del ceppo, la data, la temperatura di incubazione e il tempo dalla prima striatura della piastra.

Scatta foto digitali della piastra con le informazioni sulla varietà scritte sullo sfondo di carta in modo che la confusione sia minima. Sterilizzare le pinzette lavandole in etanolo al 70% e poi passandole attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen per far evaporare l'etanolo. Sterilizzare i vetrini coprioggetti lavandoli in etanolo al 70% e lasciandoli asciugare in una capsula di Petri sterile.

Successivamente, per preparare un vetrino coprioggetti per la crescita batterica, utilizzare una pinzetta sterile per raccogliere un vetrino coprioggetti sterile e posizionare il vetrino coprioggetti su una piastra di agar MS dove la crescita batterica è densa. Utilizzando una pinzetta, premere delicatamente sul retro del vetrino coprioggetti per garantire un trasferimento sufficiente delle spore batteriche e del micelio aereo. Prelevare il vetrino coprioggetti dalla piastra e posizionarlo con un angolo di 45 gradi con il materiale cellulare rivolto verso la superficie di un vetrino da microscopio contenente una goccia di 15 microlitri di glicerolo al 50%.

Lascia che il vetrino coprioggetti cada sul glicerolo che ridurrà le bolle d'aria. Per eseguire la microscopia a contrasto di fase a vari intervalli di tempo, posizionare il vetrino preparato sul tavolino del microscopio e aggiungere una goccia di olio da immersione al centro del vetrino coprioggetti. Ruotare l'obiettivo di fase 100x in posizione e impostare la torretta del condensatore sull'impostazione di fase corrispondente corretta.

Una volta che la lente dell'obiettivo è a contatto con l'olio, utilizzare solo la manopola di regolazione fine per mettere a fuoco l'immagine. Esamina diversi campi visivi per discernere differenze evidenti e coerenti tra i ceppi mutanti e il tipo selvatico. Come la capacità di formare spore, la dimensione e la forma delle spore e il numero complessivo di spore.

Utilizzando una pinzetta sterile, preparare un vetrino coprioggetti da una piastra di agar MS come prima, dove la crescita batterica è evidente, toccando delicatamente la parte posteriore del vetrino coprioggetti con le pinzette per garantire un trasferimento sufficiente di spore batteriche e filamenti aerei. Prelevare il vetrino coprioggetti dalla piastra e posizionarlo su cartoncino in modo che il lato con il materiale della cella sia rivolto verso l'alto per facilitare e manipolare il vetrino coprioggetti. Con metanolo ghiacciato, inondate il vetrino coprioggetti e lasciatelo riposare per cinque minuti.

Utilizzando PBS, lavare il vetrino coprioggetti due volte erogando delicatamente e rimuovendo la soluzione. Aggiungere 15 microlitri di una soluzione di ioduro di propidio da 10 microgrammi per millilitro e/o 10 microgrammi per millilitro di WGA-FITC a un vetrino. Posizionare il vetrino coprioggetti a faccia in giù su una goccia di macchia fluorescente.

Incubare i campioni in una stanza buia o scarsamente illuminata per 15 minuti. Le scorte di coloranti fluorescenti e campioni di macchie devono essere protette dalla luce. Si raccomanda ai ricercatori di utilizzare condizioni di scarsa illuminazione durante la preparazione dei campioni e di utilizzare una scatola scura per conservare i campioni una volta preparati.

Osservare i vetrini sotto una lente obiettiva 100x utilizzando un microscopio a contrasto di fase o DIC dotato di cubi di eccitazione per epifluorescenza per ioduro di propidio e FITC. Analizza le immagini secondo il protocollo di testo. Qui sono mostrati esempi di mutanti di Streptomyces derivanti dalla mutagenesi del trasposone.

Un micelio aereo di colore più chiaro può indicare un livello inferiore di pigmento grigio causato da un difetto nella sporulazione. Oppure la mancanza di un aspetto sfocato è indicativa di un blocco nella formazione di micelio aereo. Come si vede dalla microscopia a contrasto di fase, le colonie di S. coelicolor wild type producono tipicamente un micelio aereo entro circa due giorni di crescita.

E lunghe catene di spore entro tre giorni di crescita. I mutanti bianchi possono essere ritardati per la formazione delle spore, mostrare una riduzione dell'abbondanza di spore prodotte, produrre spore con difetti di forma e/o dimensioni o semplicemente produrre livelli più bassi del pigmento di spore grigio maturo. Mostrato qui utilizzando la DIC e la microscopia a fluorescenza con colorazione PI, la colorazione regolarmente distanziata per una catena di spore in un campione wild type viene confrontata con il modello di colorazione intermittente per due mutanti di inserzione di trasposoni che mostrano un difetto di segregazione cromosomica.

L'uso di WGA-FITC per colorare la parete cellulare del ceppo wild type S. venezuelae è presente come filamenti aerei lisci tra catene di spore. E mostra la serie laterale di setti di divisione che si vedono tipicamente durante la sporulazione. Lavorare con un organismo filamentoso è molto diverso dal lavorare con un noto batterio a forma di bastoncino.

I protocolli video qui riportati dovrebbero servire come risorsa importante per i nuovi ricercatori che entrano nel campo della ricerca sugli Streptomyces. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come iniziare a studiare le specie di Streptomyces e altri batteri correlati. Dopo questi esperimenti iniziali, una varietà di tecniche può essere utilizzata in un laboratorio di ricerca per saperne di più sui ceppi di Streptomyces.

Ad esempio, alcune delle tecniche avanzate potrebbero essere l'etichettatura delle proteine o l'analisi dell'espressione genica come la PCR in tempo reale e la sequenza di RNA. Gli esperimenti iniziali di fenotipizzazione vengono utilizzati per identificare e caratterizzare nuovi ceppi e discernere il ruolo tipico di un particolare gene. Questi metodi sono già stati utilizzati nei laboratori didattici universitari per identificare e caratterizzare un'ampia varietà di ceppi di Streptomyces.