Sviluppo di un multicellulare tridimensionale Organotipica Modello della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di descrivere lo sviluppo di un modello organotipico 3D multicellulare della mucosa intestinale umana coltivata in microgravità fornita da bioreattori a parete rotante. Questo metodo ha un ampio potenziale come strumento di scoperta sia in salute che in malattia. Comprese le interazioni con gli agenti patogeni, il traffico di antigeni e i processi infiammatori.

I principali vantaggi di questa tecnica sono l'imitazione della diversità fenotipica del gatto e l'uso dei bioreattori a vaso D-12 che consentono un'efficiente diffusione dei nutrienti e dell'ossigeno. Inizia svitando il tappo dalla porta di riempimento del recipiente di coltura e aggiungendo 50 millilitri del nostro PMI. Una volta che il recipiente è pieno, riposizionare il tappo e pulire il mezzo versato con etanolo al 70%.

Lasciare incubare il recipiente per almeno 15 minuti per una notte a temperatura ambiente. Quando si è pronti per continuare, utilizzare la porta di riempimento per scartare il terreno di coltura e aggiungere 30 millilitri del terreno di coltura 3D al recipiente. Riposizionare il tappo sulla porta di riempimento e, di nuovo, pulire il mezzo versato con etanolo al 70%.

Rimuovere dall'incubatrice i flaconi vicini a quelli confluenti contenenti cellule endoteliali della vena ombelicale umana e fibroblasti del colon umano e lavarli due volte con PBS. Quindi, staccare le cellule coprendole con una soluzione di tripsina allo 0,25% con tripsina EDTA allo 0,05%. Una volta che le cellule si sono staccate, raccoglierle in una provetta da 50 millilitri precaricata con 30 millilitri di DMEM contenente il 30% di FBS.

Centrifugare la provetta per 10 minuti per pellettare le cellule. Quindi, risospendere le cellule in 30 millilitri di DMEM contenente il 30% di FBS. Successivamente, diluire 20 microlitri di cellule risospese con 20 microlitri di colorante blu di tripano.

Caricare l'emocitometro con la miscela di cellule e contare la concentrazione di cellule vitali. Quindi, sospendi nuovamente ciascun tipo di cellula a 50-80 milioni di cellule per millilitro in DMEM contenente il 30% di FBS. Innanzitutto, posizionare il numero appropriato di inserti di coltura nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti.

Successivamente, preparare la miscela di collagene aggiungendo prima 10 DMEM, 10 terreni di ricostituzione, 200 millimolari di L-glutammina e FBS inattivato a caldo in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi aggiungere collagene bovino di tipo uno, laminina, collagene di tipo quattro, fibronectina, eparina solfato proteoglicano e infine aggiungere idrossido di sodio per neutralizzare il pH della soluzione. Se in qualsiasi momento la miscela sviluppa un aspetto acido di colore giallastro, aggiungere alcune gocce di idrossido di sodio sterile 1 normale per neutralizzare la miscela.

Chiudere il tubo e mescolare la soluzione capovolgendola più volte evitando la formazione di bolle. Quando non si mescola, tenere la soluzione sul ghiaccio per evitare che polimerizzi. Una volta miscelate, aggiungere le sospensioni cellulari al preparato di collagene e mescolare le provette capovolgendo delicatamente le provette più volte per evitare la formazione di bolle.

Quindi rimettili sul ghiaccio. Aggiungere da quattro a cinque millilitri della cellula contenente la soluzione di collagene in ciascun inserto e lasciare che il collagene gelifichi nel cappuccio con poco o nessun movimento per un'ora. Dopo un'ora, trasferire la piastra a sei pozzetti in un'incubatrice per una o due ore aggiuntive.

Quindi, riposizionare la piastra nella cappa di coltura tissutale e utilizzare un paio di pinze sterili e un bisturi per tagliare asetticamente la membrana dall'inserto. Staccare la cellula contenente il gel dalla membrana e quindi tagliare il gel staccato in piccoli quadrati. Aggiungere la piccola cellula contenente quadrati di collagene in uno dei recipienti preriempiti da 50 millilitri utilizzando la porta di riempimento.

Successivamente, preparare una sospensione di cellule epiteliali umane HCT-8 come descritto nel protocollo di testo allegato. Risospendere le cellule a una concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro in DMEM contenente il 30% di FBS. Quindi, aggiungere un millilitro della sospensione cellulare HCT-8 nel recipiente da 50 millilitri utilizzando la sua porta di riempimento.

Dopo aver aggiunto le cellule, aggiungere altri 20 millilitri di terreno di coltura 3D nel recipiente in modo che sia quasi pieno. Riposizionare il tappo e bagnare il bordo della porta di riempimento con etanolo al 70%. Quindi, posizionare una siringa da cinque millilitri contenente da tre a quattro millilitri di terreno di coltura 3D in una porta del recipiente e una siringa vuota da cinque millilitri nell'altra porta.

Rimuovere eventuali bolle visibili tirando nella siringa vuota mentre approssimativamente lo stesso volume di terreno viene iniettato attraverso l'altra siringa nel recipiente. Con tutta l'aria ora rimossa, posizionare i recipienti nel bioreattore, accendere l'alimentazione e impostare la velocità a 13-14 rotazioni al minuto. Regolare la velocità secondo necessità per evitare che le celle entrino in contatto con le pareti del vaso.

Coltivare le cellule in microgravità e cambiare il terreno di coltura ogni tre o quattro giorni. Per cambiare il terreno, utilizzare il metodo a doppia siringa per sostituire circa 30 millilitri del terreno utilizzato con un terreno di coltura 3D fresco. Dopo tre-cinque giorni in coltura, isolare le cellule mononucleate del sangue periferico come descritto nel protocollo di testo allegato.

Quindi rimuovere il recipiente dal bioreattore e aggiungere circa 20 milioni di cellule costituite da linfociti e monociti ai vasi attraverso la porta di riempimento. Rimetti i recipienti nel bioreattore e coltiva per altri quattro o sei giorni. Intorno al nono giorno della coltura, aggiungere altri 20 milioni di cellule costituite da linfociti e monociti nel vaso e continuare le colture per un massimo di altri 12 giorni.

Alla fine dell'esperimento, utilizzare una pipetta di trasferimento per raccogliere ogni piccolo frammento di gel, ora chiamato costrutto, e posizionarli nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti contenente 10 millilitri di tampone di formalina al 10%. Fissare i costrutti per tre ore a temperatura ambiente e poi procedere con i protocolli standard di inclusione, sezionamento e colorazione istologica. I metodi presentati in questo video producono un modello organotipico 3D multicellulare della mucosa intestinale umana.

Nella coltura in microgravità, le cellule diventano ben differenziate e formano caratteristiche ordinate, simili a villi entro il 20° giorno. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sei ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di attenersi a buone linee guida per le colture cellulari.

È fondamentale controllare sistematicamente la vitalità delle cellule, la contaminazione da micoplasma e i cambiamenti nel comportamento di crescita cellulare. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunoistochimica per identificare i marcatori di lignaggio e differenziazione cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare un modello organotipico 3D multicellulare della mucosa intestinale umana coltivata in microgravità.