La caratterizzazione delle proprietà meccaniche del multiscala cervello tessuti utilizzando microscopia a forza atomica, Impatto rientro, e Reometria

L'obiettivo generale di queste tecniche di caratterizzazione meccanica è misurare le proprietà viscoelastiche dei tessuti biologici a diverse scale di lunghezza e velocità di carico. Questi metodi possono essere utilizzati per rispondere a domande fondamentali nell'ambito dell'ingegneria biologica. Ad esempio, come si deforma il cervello sotto velocità di carico molto elevate, oppure come malattie come la sclerosi multipla o l'autismo influenzano le proprietà meccaniche del tessuto cerebrale.

Il principale vantaggio di queste tecniche consiste nel fatto che, per materiali con rigidità molto bassa e idratazione molto elevata, come i tessuti biologici, è possibile effettuare prove in un'ampia gamma di condizioni di carico, nonché su un'ampia gamma di volumi del materiale, arrivando fino al livello di una singola cellula e fino a quello di un intero cervello. Le implicazioni di queste tecniche si estendono alla modellizzazione della risposta del cervello durante un trauma, aspetto importante per lo sviluppo di strategie protettive. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle proprietà meccaniche del cervello, può essere applicato anche ad altri tessuti biologici compliant, come il cuore e il fegato.

Durante la caratterizzazione meccanica di tessuti complianti, stabilire un contatto appropriato tra la sonda di misurazione e il tessuto è fondamentale. Caricare con attenzione una sonda AFM con una costante elastica nominale di 0,03 newton per metro e una sfera in borosilicato di 20 micrometri di diametro nel supporto della sonda. Posizionare una sezione di cervello montata in una piastra di Petri su un riscaldatore montato sullo stage AFM, precedentemente riscaldato a 37 gradi Celsius.

Quindi aggiungere circa due millilitri di mezzo preriscaldato. Successivamente, aggiungere con attenzione una goccia di mezzo sulla sonda AFM per proteggerla dalla rottura dovuta alla tensione superficiale quando viene abbassata nel mezzo che circonda la fetta cerebrale. Quindi riposizionare la testa dell'AFM sulla piastra e iniziare ad abbassarla fino a quando non è immersa nel mezzo.

Utilizzando il microscopio ottico, spostare la piastra in modo che la regione di interesse si trovi al di sotto della sonda AFM calibrata, quindi abbassare la sonda AFM fino al contatto con la superficie del tessuto. Per eseguire gli esperimenti di compliance in creep, creare una funzione di forza applicata nell'editor di funzioni del software. La funzione consiste in una rampa di 0,1 secondi fino a un valore impostato di 5 nanonewton, mantenuto per 20 secondi, seguita da una rampa di un secondo fino a zero nanonewton.

Il software registrerà i dati sull'indentazione della sonda AFM nel tessuto durante la funzione di forza applicata. Dopo aver eseguito l'esperimento di compliance in condizioni di fluage, effettuare esperimenti di rilassamento della forza creando una funzione di indentazione applicata nel software. Eseguire questa funzione mentre il software raccoglie i dati sulla forza subita dalla sonda AFM mentre si imprime nel tessuto.

Per iniziare i test di indentazione per impatto, posizionare una sonda sferica facendola scivolare sul pendolo mediante pinzette. Quindi fissare il campione di quarzo fuso sul supporto e avvitare il supporto sullo stadio traslazionale. Per consentire esperimenti di impatto dinamico su tessuti cerebrali idratati, eseguire innanzitutto la calibrazione della cella liquida.

Vai al menu Calibrazione nel software, seleziona Cella Liquida e segui le indicazioni del software per effettuare il contatto con il campione di quarzo fuso. Successivamente, seleziona Normale per il Tipo di indentatore e utilizza il valore predefinito di 0,05 millinewton per il Carico dell'indentatore. Quindi clicca su continua per eseguire la calibrazione della configurazione dell'indentatore normale.

Ora spostare indietro la piastra del campione di almeno cinque millimetri e montare il braccio della leva. Ripetere la calibrazione della cella liquida nella nuova configurazione selezionando "Cella liquida" come tipo di indentatore. Fare clic su Continua per ottenere il fattore di calibrazione della cella liquida.

Successivamente, aumentare la distanza tra le piastre del condensatore. L'aumento della distanza tra le piastre del condensatore incrementerà la profondità massima misurabile, il che è necessario quando si testano materiali altamente compliant. Con una chiave inglese, ruotare in senso orario di piccoli incrementi le tre viti che regolano la distanza tra le piastre del condensatore.

Dopo ogni giro completo in senso orario, selezionare Regolazione Bridge Box nel menu Manutenzione ed eseguire un test del pendolo soddisfacente. Continuare a regolare lentamente i dadi finché la Calibrazione Profondità Approssimativa indica un valore di 70.000 nanometri per volt o superiore.

Quindi posizionare un nuovo fermo limite nella parte inferiore del pendolo, che possa essere attivato e disattivato tramite un'alimentazione elettrica. Ritirare il fermo limite originale posizionato dietro il pendolo per eliminare un eventuale ostacolo al movimento del pendolo e consentire velocità d'impatto più elevate, nonché profondità di penetrazione maggiori in campioni deformabili. Accendere l'alimentatore per il solenoide e impostarlo a 10 volt.

Successivamente, andare al menu Esperimento e selezionare Impatto e Regolazione dello Spostamento dell'Impulso. Seguire le istruzioni del software per calibrare la distanza di oscillazione del pendolo. Quando la configurazione dell'indentazione da impatto è completamente terminata, aspirare il mezzo e asciugare la sezione cerebrale.

Quindi utilizzare uno strato sottile di adesivo a base di cianoacrilato per fissare il cervello tagliato al supporto campione in alluminio. Successivamente, far scorrere la cella liquida sopra la seconda guarnizione O-ring sul supporto campione e riempire la cella liquida con cinque millilitri di mezzo indipendente dal biossido di carbonio, in modo da immergere completamente il tessuto. Spostare il bagno nella direzione negativa dell'asse X finché la punta sul braccio della leva non sia correttamente posizionata sopra il bagno.

Successivamente, spostarsi nella direzione positiva dell'asse Z fino a quando la punta è completamente immersa nel bagno ed è posizionata di fronte al campione. Utilizzando la finestra di controllo dello stage del campione, effettuare con attenzione il contatto, quindi ritirare lo stage dalla superficie del campione di circa 30 micrometri. Dal menu Esperimento, fare clic su Impatto e configurare un esperimento di impatto.

Scegliere un carico d'urto specifico che sia direttamente correlato alla velocità d'impatto risultante in base alla calibrazione della distanza di oscillazione. Quindi eseguire l'esperimento programmato. Quando il pendolo torna indietro e la superficie del campione continua a muoversi verso il piano di misurazione, spegnere l'interruttore di finecorsa inferiore.

Lo spostamento della sonda in funzione del tempo verrà registrato dal software. Applicare della carta vetrata sulla sonda di misura con diametro di 25 millimetri. Successivamente, collegare il sistema termico e montare la sonda.

Infine, applicare un altro pezzo di carta vetrata sulla piastra inferiore, allineandolo con la piastra superiore. Calibrare il reometro seguendo le istruzioni del produttore. Prima di tutto, azzerare la forza sul sensore.

In secondo luogo, stabilire il contatto tra la sonda e la piastra inferiore. Successivamente, misurare l'inerzia della sonda. Infine, eseguire un'aggiustamento del motore.

Abbassare quindi lentamente la piastra di misurazione. Quando la piastra si trova a meno di un millimetro dal tessuto, abbassarla a incrementi di 0,1 millimetro fino a quando non è completamente a contatto con la superficie superiore del tessuto e la forza normale misurata raggiunge il valore desiderato. Aggiungere una piccola quantità di mezzo lungo i bordi del campione per mantenere l'idratazione durante la procedura.

Abbassare il coperchio termico. Successivamente, fare clic su File, Nuovo e sotto la scheda Gel selezionare Analisi in frequenza. Quindi fare clic sulla misurazione della finestra, analisi in frequenza, e fare doppio clic sulla casella di oscillazione.

Immettere l'intervallo di frequenza, la deformazione e il numero di punti. Infine, selezionare OK e fare clic su Start per avviare la scansione di frequenza. Di seguito sono riportate le risposte rappresentative di indentazione e forza in funzione del tempo sia per gli esperimenti di compliance di creep che di rilassamento della forza.

Utilizzando questi dati e la geometria del sistema, è possibile calcolare i moduli di cedevolezza e di rilassamento della forza per diverse regioni del cervello. L'indentazione da impatto misura le proprietà meccaniche del tessuto a elevate velocità di carico concentrate spazialmente e temporalmente. I parametri risultanti della risposta all'impatto possono essere quantificati a diverse velocità d'impatto, fornendo un metodo per studiare le proprietà del tessuto dipendenti dalla velocità.

La reologia misura le proprietà viscoelastiche dipendenti dalla frequenza dei tessuti in massa in termini di modulo di immagazzinamento e modulo di perdita. Il modulo di immagazzinamento è quasi un ordine di grandezza superiore rispetto al modulo di perdita a basse frequenze, indicando che le proprietà elastiche dominano il comportamento del tessuto cerebrale. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale mantenere il tessuto adeguatamente idratato o immerso in un fluido che aiuti il tessuto a mantenere la sua struttura corretta.

Lo sviluppo di queste tecniche dimostrate ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei materiali per progettare e ottimizzare idrogeli sintetici in grado di imitare la risposta meccanica del cervello. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come la microscopia a forza atomica con indentazione, l'indentazione da impatto e la reologia vengano utilizzate per caratterizzare le proprietà meccaniche viscoelastiche dei tessuti. Quando si interpretano i dati raccolti, ricordare l'assunzione fondamentale secondo cui il volume del tessuto deformato è strutturalmente omogeneo e elasticamente isotropo.

Questo non è necessariamente vero per tutti i tessuti biologici. Man mano che le tue domande riguardo alla meccanica dei tessuti biologici diventano più precise, puoi scegliere uno o più di questi esperimenti meccanici per rispondere alla domanda alla scala di lunghezza o di tempo appropriata.