La caratterizzazione delle proprietà meccaniche del multiscala cervello tessuti utilizzando microscopia a forza atomica, Impatto rientro, e Reometria

L'obiettivo generale di queste tecniche di caratterizzazione meccanica è quello di misurare le proprietà viscoelastiche dei tessuti biologici a diverse scale di lunghezza e velocità di carico. Questi metodi possono essere utilizzati per rispondere a domande chiave nell'ingegneria biologica. Ad esempio, in che modo il cervello si deforma sotto tassi di carico molto elevati, o in che modo malattie come la sclerosi multipla o l'autismo influenzano le proprietà meccaniche del tessuto cerebrale.

Il vantaggio principale di queste tecniche è che per i materiali con rigidità molto bassa e idratazione molto elevata, come un tessuto biologico, è possibile testare su un'ampia gamma di condizioni di carico e si può anche testare su un'ampia gamma di volumi di materiale, fino al livello di una singola cellula e fino al livello di un intero cervello. Le implicazioni di queste tecniche si estendono alla modellazione della risposta del cervello durante la lesione, che è importante per l'ingegneria delle strategie protettive. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle proprietà meccaniche del cervello, può essere applicato anche ad altri tessuti biologici conformi, come il cuore e il fegato.

Durante la caratterizzazione meccanica dei tessuti conformi, è fondamentale stabilire un contatto appropriato tra la sonda di misura e il tessuto. Caricare con cautela una sonda AFM con una costante nominale della molla di 0,03 newton per metro e una perlina di borosilicato di 20 micrometri di diametro nel supporto della sonda. Posiziona una fetta di cervello montata in una capsula di Petri su un riscaldatore montato su uno stadio AFM che è stato preriscaldato a 37 gradi Celsius.

Quindi aggiungere circa due millilitri di terreno preriscaldato. Quindi, aggiungere con cura una goccia di terreno sulla sonda AFM per proteggerla dalla rottura dovuta alla tensione superficiale quando viene abbassata nel mezzo che circonda la fetta di cervello. Quindi riposizionare la testa AFM sul tavolino e iniziare ad abbassare la testa fino a quando non è immersa nel mezzo.

Utilizzando il microscopio ottico, spostare il tavolino in modo che la regione di interesse sia al di sotto della sonda AFM calibrata, quindi abbassare la sonda AFM per entrare in contatto con la superficie del tessuto. Per condurre gli esperimenti di conformità allo scorrimento, costruire una funzione di forza applicata nell'editor di funzioni del software. La funzione consiste in una rampa di 0,1 secondi a un punto di impostazione di 5 nanonewton che viene mantenuta per 20 secondi seguita da una rampa di un secondo fino a zero nanonewton.

Il software registrerà i dati sull'indentazione della sonda AFM nel tessuto durante la funzione di forza applicata. Dopo aver eseguito l'esperimento di conformità allo scorrimento, condurre esperimenti di rilassamento della forza creando una funzione di indentazione applicata nel software. Eseguire questa funzione mentre il software raccoglie i dati sulla forza sperimentata dalla sonda AFM quando penetra nel tessuto.

Per iniziare i test di indentazione dell'impatto, abbinare una sonda sferica facendola scorrere sul pendolo utilizzando una pinzetta. Quindi fissare il perno del campione di quarzo fuso sulla piastra e avvitare la piastra nel tavolino di traslazione. Per consentire esperimenti di impatto dinamico su tessuti cerebrali idratati, eseguire prima la calibrazione delle cellule liquide.

Vai al menu Calibrazione nel software, seleziona Cella liquida e segui le istruzioni del software per entrare in contatto con il campione di quarzo fuso. Quindi, selezionare Normale per il tipo di penetratore e utilizzare il valore predefinito di 0,05 millinewton per il carico del penetratore. Quindi fare clic su continua per eseguire la calibrazione per la normale configurazione del penetratore.

Ora sposta indietro il tavolino di campionamento di almeno cinque millimetri e monta il braccio di leva. Ripetere la calibrazione della cella liquida nella nuova configurazione selezionando Cella liquida per il tipo di penetratore. Fare clic su Continua per ottenere il fattore di calibrazione della cella liquida.

Quindi, aumentare la spaziatura della piastra del condensatore. L'aumento della spaziatura della piastra del condensatore aumenterà la profondità massima misurabile necessaria quando si testano materiali altamente conformi. Con una chiave, ruotare i tre dadi che controllano la spaziatura della piastra del condensatore in senso orario con piccoli incrementi.

Dopo ogni giro completo in senso orario, selezionare Bridge Box Adjustment nel menu Maintenance (Manutenzione) e ottenere un buon test del pendolo. Continuare a regolare lentamente i dadi fino a quando la calibrazione della profondità non legge un valore di 70.000 nanometri per volt o superiore.

Quindi posizionare un nuovo finecorsa nella parte inferiore del pendolo che può essere acceso e spento tramite un alimentatore. Ritrarre il finecorsa originale che si trova dietro il pendolo per rimuovere una potenziale ostruzione del movimento del pendolo e consentire velocità di impatto più elevate e profondità di penetrazione più elevate in campioni conformi. Accendere l'alimentazione del solenoide e impostarlo su 10 volt.

Quindi, vai al menu Esperimento e seleziona Impatto e regola lo spostamento dell'impulso. Seguire le istruzioni del software per calibrare la distanza di oscillazione del pendolo. Quando l'impostazione della rientranza dell'impatto è completamente completa, aspirare il terreno e asciugare la fetta di cervello.

Quindi utilizzare un sottile strato di adesivo cianoacrilato per fissare il cervello affettato al perno del campione in alluminio. Quindi far scorrere la cella liquida sul secondo O-ring sul perno del campione e riempire la cella liquida con cinque millilitri di mezzo indipendente dall'anidride carbonica per immergere completamente il tessuto. Spostare la vasca nella direzione X negativa fino a quando la punta del braccio di leva non è posizionata correttamente sopra la vasca.

Quindi, spostarsi nella direzione Z positiva fino a quando la punta non è completamente immersa nel bagno e si trova davanti al campione. Utilizzando la finestra di controllo del tavolino del campione, fare un contatto con cautela e quindi allontanare il tavolino dalla superficie del campione di circa 30 micrometri. Nel menu Esperimento, fai clic su Impatto e configura un esperimento di impatto.

Scegli un carico impulsivo specifico che si riferisca direttamente alla velocità di impatto risultante in base alla calibrazione della distanza di oscillazione. E quindi eseguire l'esperimento pianificato. Quando il pendolo oscilla all'indietro e la superficie del campione continua a spostarsi sul piano di misurazione, spegnere il finecorsa inferiore.

Lo spostamento della sonda in funzione del tempo verrà registrato dal software. Attaccare la carta vetrata alla sonda di misurazione del diametro di 25 millimetri. Quindi, collegare il sistema termico e montare la sonda.

Infine, attacca un altro pezzo di carta vetrata alla piastra inferiore allineata con la piastra superiore. Calibrare il reometro secondo le istruzioni del produttore. Innanzitutto, azzerare la forza sulla sonda.

In secondo luogo, stabilire il contatto tra la sonda e la piastra inferiore. Quindi misurare l'inerzia della sonda. Infine, eseguire una regolazione del motore.

Quindi abbassare lentamente la piastra di misurazione. Quando la placca si trova entro un millimetro dal tessuto, abbassarla con incrementi di 0,1 millimetri fino a quando la placca non è completamente a contatto con la superficie superiore del tessuto e la forza normale misurata è del valore desiderato. Versare un piccolo volume di terreno sui bordi del campione per mantenere l'idratazione durante la procedura.

Abbassare la cappa termica. Quindi, fai clic su File, Nuovo e nella scheda Gel seleziona Frequency Sweep. Quindi fare clic sulla finestra di misurazione di una scansione di frequenza e fare doppio clic sulla casella di oscillazione.

Immettere la gamma di frequenza, la deformazione e il numero di punti. Infine, selezionare OK e fare clic su Avvia per avviare lo sweep di frequenza. Ecco le risposte rappresentative dell'indentazione e della forza rispetto al tempo sia per gli esperimenti di conformità allo scorrimento che di rilassamento della forza.

Utilizzando questi dati e la geometria del sistema, è possibile calcolare la conformità allo scorrimento e i moduli di rilassamento della forza per diverse regioni del cervello. L'indentazione d'impatto misura le proprietà meccaniche del tessuto ad alti tassi di carico concentrato spazialmente e temporalmente. I parametri di risposta all'impatto risultanti possono essere quantificati a diverse velocità di impatto, il che fornisce un mezzo per studiare le proprietà dipendenti dalla velocità del tessuto.

La reologia misura le proprietà viscoelastiche dipendenti dalla frequenza del tessuto bulk in termini di moduli di stoccaggio e perdita. Il modulo di accumulo è quasi un ordine di grandezza più grande del modulo di perdita alle basse frequenze, indicando che le proprietà elastiche dominano il comportamento del tessuto cerebrale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere il tessuto adeguatamente idratato o immerso in un fluido che aiuti il tessuto a mantenere la sua corretta struttura.

Lo sviluppo di queste tecniche dimostrate ha spianato la strada ai ricercatori dei materiali per progettare e ottimizzare i gel sintetici in grado di imitare la risposta meccanica del cervello. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come l'indentazione abilitata dal microscopio a forza atomica, l'indentazione da impatto e la reologia vengono utilizzate per caratterizzare le proprietà meccaniche viscoelastiche dei tessuti. Nell'interpretare i dati raccolti, è necessario ricordare l'assunto di base che il volume deformato del tessuto sia strutturalmente omogeneo ed elasticamente isotropo.

Questo non è necessariamente vero per tutti i tessuti biologici. Man mano che le tue domande sulla meccanica dei tessuti biologici diventano meglio definite, puoi scegliere uno o più di questi esperimenti meccanici per rispondere alla domanda alla scala di lunghezza o alla scala temporale di interesse appropriata.