Name: Aggregate ottimizzazione Dimensione in pozzetti per sospensione a base cardiaco differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Scopri un metodo robusto per la differenziazione cardiaca di cellule staminali pluripotenti umane utilizzando micropozzetti per generare aggregati di dimensioni controllate. Questa tecnica riduce l'eterogeneità culturale e migliora i risultati di differenziazione.

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Ringraziamo il Dr. Peter Zandstra, nel cui laboratorio è stato sviluppato questo protocollo, e i dottori Mark Gagliardi e Gordon Keller che hanno fornito assistenza nello stabilire i metodi iniziali su cui si basava questo processo. Lo sviluppo del protocollo è stato supportato da una borsa di studio per laureati in Scienze e Tecnologia dell'Ontario a C.B. e da una sovvenzione della Heart and Stroke Foundation dell'Ontario a Peter Zandstra.

1. Preparazione dei Componenti medie <ol><li> Preparare Wash Medium. Per 100 ml di DMEM / F12, aggiungere 1 ml di 100x penicillina / streptomicina (Pen / Strep), 1 ml di 100x L-glutammina, e 5 ml di sostituzione del siero. </li><li> Preparare la chimica definita basale cardiaca induzione medio in base alle istruzioni del produttore. </li><li> Preparare i seguenti reagenti azionari per i supporti che verranno utilizzati in questo protocollo. <ol><li> Acido L-ascorbico: Preparare una soluzione stock di 5 mg per ml in 4 ° C, acqua distillata ultrapura sterile in una provetta conica. <ol><li> Lasciare questa soluzione su ghiaccio e agitare la provetta periodicamente fino il soluto è completamente sciolto. Filtro-sterilizzare la soluzione Acido Ascorbico con un filtro siringa da 0,22 micron. </li><li> Preparare 1 ml della soluzione di acido ascorbico e memorizzare questi aliquote a -20 ° C. Utilizzare una un&#39;aliquota appena scongelato ogni mezzo di tempo è preparato. </li></ol></li><li> Il giorno di preparazione medio, Diluire 13 ml di monotioglicerolo (MTG) in 1 ml di Basal Cardiac induzione Medium. Eliminare inutilizzato, MTG diluito. </li><li> Preparare 1 ml aliquote di transferrina (30 mg / ml) per conservare a -20 ° C. Conservare aliquote scongelato a 4 ° C per un massimo di 3 mesi. </li><li> Preparare 4 mM di acido cloridrico (HCl) contenente 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA). In una cappa aspirante, aggiungere 30 ml di soluzione 6,0 N HCl a 50 ml di acqua distillata ultra-pura. Filtro-sterilizzare la soluzione con un filtro a siringa da 0,22 micron. Aggiungere 2 ml di soluzione di BSA 25% alla soluzione 50 ml di HCl. </li><li> Preparare tampone fosfato (PBS) contenente 0,1% di BSA. Aggiungere 20 ml di soluzione di BSA 25% per ml di PBS. </li><li> Preparare umana proteina morfogenetica 4 (4-BMP) soluzione di riserva (10 ng / ml). Sciogliere 10 mg liofilizzato BMP-4 in 1 ml di 4 soluzione tampone mM HCl contenente 0,1% BSA. Preparare 50 ml aliquote per conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare umana Fibroblast Growth Factor 2 soluzione madre (bFGF)(10 ng / ml). Sciogliere 10 mg liofilizzato bFGF in 1 ml di tampone fosfato (PBS) contenente 0,1% di BSA. Preparare 50 ml aliquote per conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare fattore umano di crescita dell&#39;endotelio vascolare (VEGF) soluzione madre (5 ng / ml). Sciogliere 5 mcg VEGF liofilizzato in 1 ml di PBS contenente 0,1% BSA. Preparare 50 ml aliquote per conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare Activin Una soluzione madre (10 ng / ml). Sciogliere 10 mg liofilizzati Activin A in 1 ml di PBS contenente 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA). Preparare 50 ml aliquote per conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare inibitore di Wnt Production-2 (2-IWP) soluzione di riserva (10 mm). Sciogliere 2 mg IWP-2 in 429 ml dimetilsolfossido (DMSO). Preparare 10 ml aliquote per conservare a -80 ° C. </li></ol></li><li> Preparare completa cardiaco induzione media. Per 100 ml di basale cardiaca induzione media, aggiungere 1 ml di 100x Pen / Strep, 1 ml di 100x L-glutammina, 500 ml di transferrina, 1ml di acido ascorbico appena scongelato, e 300 ml di MTG. Eliminare medio inutilizzato. </li></ol> 2. Preparazione del micropiastre NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica. <ol><li> Aggiungere 0,5 ml di soluzione di risciacquo (componente kit) a ciascun pozzetto che verrà utilizzato sulla piastra. Per garantire che i contatti soluzione l&#39;intera superficie interna ciascun micropozzetto, centrifugare la piastra a 840 g per 2 minuti. </li><li> Incubare la piastra per 30 a 60 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare la soluzione di risciacquo dai pozzi. Lavare ciascun pozzetto due volte come segue: Aggiungere 1 ml di PBS a ciascun pozzetto, centrifugare la piastra a 840 xg per 2 minuti, quindi aspirare il PBS. </li></ol> 3. La formazione di HPSC aggregati nel micropiastre NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica. <ol><li> Lavatoio medio a bagnomaria C 37 °. NOTA: il volume richiesto = 1 ml x numero di pozzi di HpSC che sarà dissociato. </li><li> Dissociarsi hPSCs a singole cellule NOTA: Questi passaggi descrivono la dissociazione delle cellule in coltura su 6 pozzetti - i volumi di reagente possono essere scalati proporzionalmente per i diversi formati di cultura. <ol><li> Aspirare il terreno di coltura di ogni cultura HPSC bene per la dissociazione. Lavare ogni pozzetto con 1 ml di enzima dissociazione e quindi aspirare immediatamente l&#39;enzima dissociazione da ogni pozzetto. NOTA: residua enzimatica dissociazione dovrebbe essere sufficiente per dissociare le cellule. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C per 3 min. </li><li> Aggiungere 1 ml di Wash medio di ogni bene e dissociarsi meccanicamente le cellule dalla superficie di coltura tissutale pipettando Medium Wash con una micropipetta P1000 sulla superficie coltura di tessuti. Se la dissociazione sembra essere ciuffi incompleti e cellule rimangono, passare la sospensione attraverso un filtro a questo punto. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 ml e conservareil tubo in incubatrice mentre il conteggio delle cellule è effettuata nella fase successiva. </li><li> Eseguire un numero di celle: <ol><li> Prelevare 10 ml di sospensione cellulare raccolte nel passaggio precedente. Aggiungere 30 ml di Trypan Blue e mescolare bene la sospensione pipettando. </li><li> Trasferire 10 ml di cellule Trypan Blue-macchiato a ciascuna camera di un emocitometro e visualizzare al microscopio invertito con l&#39;obiettivo 10X. Contare le cellule. </li></ol></li><li> Dai risultati di conteggio delle cellule, calcolare quanti pozzi possono essere seminati in 1,2 x 10 6 cellule per pozzetto della micropiastra. Calcola aggregazione medio richiesto per seminare le cellule a 1 ml per bene. </li><li> Preparare mezzo di aggregazione. Per 10 ml di completo cardiaco induzione medio, aggiungere 0,5 ml di soluzione madre BMP4 (concentrazione finale = 0,5 ng / ml) e Y-27632 ROCK Inhibitor (concentrazione finale = 10 micron). </li><li> Rimuovere il tubo conico contenente le hPSCs dal termostato e centrifuge la provetta a 200 xg per 5 min. Aspirare il mezzo di lavaggio e risospendere le cellule in terreno aggregazione ad una densità di 1,2 x 10 6 cellule per ml. </li><li> Aspirare la soluzione di lavaggio PBS da ciascun pozzetto della micropiastra. Usando una micropipetta P1000, distribuire uniformemente e semi di 1 ml di sospensione cellulare a ciascun pozzetto nella piastra. Per seminare un gran numero di pozzi, vortice periodicamente la sospensione cellulare per evitare la sedimentazione. </li><li> Centrifugare la piastra a 200 xg per 5 min. Osservare la lastra sotto il microscopio per confermare cellule sono filata a fondo di ciascun pozzetto. </li><li> Incubare la piastra per 24 ore a 37 ° C in 5% CO 2, 5% O 2 (ipossica) incubatore. </li></ol></li></ol> 4. cardiaca induzione Stage 1 <ol><li> Un giorno dopo l&#39;aggregazione (giorno 1), preparare il volume richiesto di Fase 1 di media induzione (per un piatto ben 24, volume = 1 ml x numero di pozzi). Per 1 ml di completoinduzione a media cardiaca, aggiungere 1 ml di BMP4 soluzione madre (concentrazione finale = 10 ng / ml), 0,5 ml di soluzione madre bFGF (concentrazione finale = 5 ng / ml), e 0,6 ml di Activin A (concentrazione finale = 6 ng / ml). Posizionare il mezzo a bagnomaria C 37 ° per almeno 15 min. </li><li> Rimuovere la piastra di micropozzetti dal termostato. Gli aggregati sotto il microscopio. Rispetto al immediatamente aggregazione post-centrifuga, essi dovrebbero apparire intatta con bordi arrotondati (più rotondo e meno quadrata rispetto al giorno precedente). </li><li> Rimuovere il surnatante senza disturbare gli aggregati all&#39;interno dei pozzetti: <ol><li> Tenere la micropiastra orizzontale livello (es., Non inclinarlo). Per ciascun pozzetto nella piastra, inserire la punta di una micropipetta P1000 alla superficie del terreno di coltura e contro il bordo del pozzo. </li><li> Lentamente rimuovere il supporto, facendo attenzione a non disturbare gli aggregati al fondo dei pozzetti. Dopo aver ridotto tegli livello medio di circa 1 a 2 mm dalla superficie dei pozzetti strutturato, inclinare lentamente la piastra di raccogliere media su un lato del pozzo (quando il volume è sufficientemente bassa, movimento fluido è molto ridotto ed è più facile evitare aggregati sempre sollevata dalle loro singoli pozzetti). Lentamente pipettare il supporto rimanente nel pozzo. </li></ol></li><li> Per aggiungere fresco Fase 1 induzione Media garantendo al tempo stesso gli aggregati rimangono nei loro singoli pozzetti: Disegna 1 ml della Fase 1 di media ad induzione con una micropipetta P1000. Tenere la punta della pipetta contro il bordo interno del pozzo e dispensare lentamente il mezzo contro la parete interna del pozzo. Ripetere l&#39;operazione per i pozzetti rimanenti. </li><li> Riportare la piastra per l&#39;incubatore in condizioni di ipossia per 3 giorni. </li></ol> 5. cardiaca induzione Fase 2 <ol><li> Il giorno 4, posto lavaggio medio (volume = numero di pozzetti x 2 ml) in un bagno di acqua a 37 ° C per almeno 15 min. </li><li> Preparare il volume necessario di Fase 2 induzione media (volume = numero di pozzi x 1 ml): per ml di completo cardiaco induzione medio, aggiungere 2 ml di soluzione di VEGF magazzino (concentrazione finale = 10 ng / ml) e 0,5 ml IWP-2 soluzione madre (concentrazione finale = 5 micron). Posizionare il preparato mezzo induzione Fase 2 in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per almeno 15 min. </li><li> Usando una pipetta da 5 ml sierologica, raccogliere gli aggregati da ciascun pozzetto della micropiastra e raccogliere la sospensione di aggregazione in un tubo da 15 ml (raccogliere fino a 10 pozzetti per 15 ml di tubo). </li><li> Lasciare gli aggregati di stabilirsi per 15 minuti in un incubatore ipossico. NOTA: Questo passaggio è importante separare singole cellule e detriti cellulari dagli aggregati intatte. </li><li> Aspirare il surnatante con cura e risospendere gli aggregati in 10 ml di Wash medio pre-riscaldato per rimuovere le citochine induttivi residui (ad esempio, Activin A è una molecola di segnalazione potente, anche a bassissima concentrations). </li><li> Centrifugare gli aggregati a 50 xg per 2 min. Aspirare il surnatante. Risospendere gli aggregati in pellet nel pre-riscaldato a induzione 2 Media. </li><li> Trasferire la sospensione aggregato ad una piastra 24 pozzetti attacco ultra-bassa (ULA) a 1 ml per bene. Osservare gli aggregati al microscopio più uniforme, gruppi di cellule strette. Incubare in condizioni di ipossia fino al giorno 6. </li></ol> 6. cardiaco induzione Fase 3 <ol><li> Il giorno 6, preparare il volume necessario di Fase 3 induzione media (volume = numero di pozzi x 1 ml). Per 1 ml di Complete cardiaco induzione medio, aggiungere 2 ml soluzione VEGF magazzino (concentrazione finale = 10 ng / ml), e 0,5 ml di soluzione madre bFGF (concentrazione finale = 5 ng / ml). Posizionare preparati induzione a media Fase 3 in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per almeno 15 min. </li><li> Utilizzare una pipetta 5 ml sierologica per trasferire gli aggregati a 15 ml provette coniche, mettendo in comune fino a 10 ml di aggregaziones per provetta. </li><li> Lasciare 10 minuti per gli aggregati di stabilirsi. Aspirare il surnatante e risospendere gli aggregati nella Fase 3 di induzione medio pre-riscaldato. Usando una pipetta da 5 ml sierologica, ridistribuire gli aggregati in un 24-pozzetti ULA a 1 ml per bene. </li><li> Il giorno 10, preparare il volume necessario di Fase 3 induzione media (volume = numero di pozzi x 1 ml) come da Passo 6.1. </li><li> Utilizzare un 5 ml pipetta sierologica per trasferire gli aggregati a 15 ml provette coniche, mettendo in comune fino a 10 ml di aggregati per provetta. </li><li> Lasciare 10 minuti per gli aggregati di stabilirsi. Aspirare il surnatante e risospendere gli aggregati nella Fase 3 induzione media. Usando una pipetta da 5 ml sierologica, ridistribuire gli aggregati in un 24-pozzetti ULA a 1 ml per bene. </li><li> Incubare in condizioni di ipossia per due giorni. Il giorno 12, inizierà incubando le cellule a livelli di ossigeno normossia per il resto del periodo di coltura (37 ° C, 20% O 2, 5% CO 2). NOTA:Dopo questo punto di tempo, le cellule non sono coltivate in condizioni di ipossia. </li><li> Ripetere questo completo cambio medio (i punti 6.2 e 6.3) ogni 4 giorni, a partire giorno 14 fino alla raccolta delle cellule (in genere, le concentrazioni di cardiomiociti di picco si osservano dopo giorno 14 di differenziazione). </li></ol> 7. flusso Analisi Citometria di cardiaca Troponina T (cTnT) Espressione Frequenza di uscita Micropiastra Cultura <ol><li> Dissociare il aggregati come segue: <ol><li> Utilizzare un 5 ml pipetta sierologica per trasferire 1 e di aggregati di un tubo da 15 ml. Centrifugare gli aggregati a 50 xg per 2 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di fresco disciolto soluzione 1 mg / ml Collagenasi tipo II agli aggregati. Trasferire la sospensione di aggregazione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Incubare gli aggregati di Collagenasi di tipo II notte a temperatura ambiente. </li><li> Il giorno seguente, utilizzare una micropipetta P1000 a dissociarsi delicatamente gli aggregatiin una sospensione singola cella omogenea. Se gli aggregati non facilmente dissociano, risolvere gli aggregati, aspirare il surnatante, e incubare gli aggregati in 700 ml di dissociazione enzimatica per 1-2 minuti a temperatura ambiente. Delicatamente pipetta gli aggregati 1 a 2 volte con una micropipetta P1000 a dissociarsi. </li><li> Diluire l&#39;enzima di dissociazione: Aggiungere 700 ml di Wash mezzo contenente 14 ml di 1 mg / ml di soluzione DNAsi. Prelevare 10 microlitri di eseguire una conta cellulare e centrifugare la sospensione rimanente utilizzando una microcentrifuga da banco a 300 xg per 2 min. </li></ol></li><li> Eseguire un numero di celle: Colorare il campione di conteggio 10 microlitri con un uguale volume di Trypan Blue e contare con un emocitometro. </li><li> Rimuovere il tubo di 1,5 ml microcentrifuga contenente le restanti cellule dal microcentrifuga. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule, ad una concentrazione di 200.000 a 500.000 cellule per 100 ml, in Hanks Balanced Salt Solution contenente2% siero fetale bovino (HF). </li><li> Per ogni condizione, trasferire 100 l di sospensione cellulare per pozzetto a 2 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (un pozzo sarà macchiato con l&#39;anticorpo cTnT e l&#39;altro sarà il controllo anticorpo secondario). </li><li> Centrifugare la piastra a 300 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante con una micropipetta multicanale. </li><li> Fissare le cellule: Aggiungere 200 ml di soluzione di fissaggio (componente del kit) per pozzetto e incubare la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare la piastra a 300 xg per 2 min. Utilizzare una micropipetta multicanale di ritirare con attenzione il surnatante dai pozzetti. Smaltire il surnatante in un contenitore per rifiuti paraformaldeide. </li><li> Lavare le cellule fissate due volte: Aggiungere 200 ml di HF in ogni pozzetto. Centrifugare la piastra a 300 xg per 2 min. Aspirare il surnatante, e ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta. Cellule fisse possono essere conservate per un massimo di una settimana in alta frequenza a 4 ° C. </li><li> Permeabilize le cellule: <ol><li> Centrifugare la piastra a 300xg per 2 min. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione permeabilizzazione (componente del kit) per ciascun pozzetto ed incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Centrifugare la piastra a 300 xg per 2 minuti e aspirare il surnatante. </li></ol></li><li> Preparare una master mix di anti-cTnT in HF alla concentrazione ottimale per un dato numero di lotto (La diluizione ottimale deve essere determinata per titolazione e in genere varia da 1: 500 a 1: 2.000). </li><li> Per ogni condizione (2 pozzi per condizione), aggiungere 100 ml di master mix per un bene (campione colorato) e 100 ml di HF pianura verso l&#39;altro bene (controllo anticorpo secondario). Incubare le cellule a 4 ° C per 30 min. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 2 min. Aspirare il surnatante e aggiungere 200 ml di HF per pozzetto. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta. </li><li> Preparare una master mix dell&#39;anticorpo secondario. Trasferire un volume di HF che corrisponde a 100 l per ogni bene (controllo anticorpo secondario ecTnT-macchiato) da trattare. Aggiungere 1 ml di anticorpo secondario di capra anti-topo-APC per 200 ml di HF (diluizione 1: 200). </li><li> Colorare i campioni. Aggiungere 100 ml di soluzione colorante in ogni pozzetto (sia il controllo anticorpo secondario e pozzi anti-cTnT-macchiati). Incubare le cellule al buio a 4 ° C per 30 min (mantenere placca coperta o al buio dopo l&#39;aggiunta di anticorpo secondario fluorescente per evitare photobleaching). </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 2 min. Aspirare il surnatante e aggiungere 200 ml di HF per pozzetto. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta. </li><li> Trasferire i campioni da 5 ml flusso fondo tondo citometro tubi di analisi ed eseguire citometria a flusso per il segnale nel canale APC utilizzando i protocolli standard per lo strumento 19. </li></ol>

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</ol>

M.U. ha un interesse finanziario nella tecnologia dei micropozzetti sottostante.

È stato osservato che la differenziazione cardiaca efficiente di cellule staminali pluripotenti è un processo altamente variabile. Mentre non è sorprendente che diverse linee cellulari presentano diverse inclinazioni di capacità di differenziazione specifici tipi cellulari, è stato osservato che cardiaca efficienza differenziazione oscilla drasticamente tra replica eseguito usando la stessa linea cellulare 6. Il protocollo qui descritto affronta una delle principali fonti di questa variabilità controllando direttamente il numero di cellule di ingresso per ogni aggregato. Per ridurre ulteriormente la variabilità tra le esecuzioni, si raccomanda che le linee HPSC adattati per singolo passaging cellule sono utilizzati, in quanto questa forma di HPSC sviluppo e il mantenimento dei risultati nelle popolazioni pluripotenti più coerenti rispetto alle frequenze di espressione di marcatori pluripotenza (ad esempio, Oct4, Nanog, Tra-1-60, ecc.). Il protocollo come scritto qui specifica una dimensione complessiva di 1000 cellule per Oinduzione cardiaco ptimal dalla linea di cellule staminali embrionali HES-2. Per applicare questo protocollo per diverse linee cellulari, è fondamentale che una schermata iniziale dimensione aggregata essere effettuata per determinare la dimensione aggregata ottimale delle cellule line-specifica. Anche se non influisce direttamente le procedure da seguire qui, ricordiamo al lettore che i cambiamenti nella dimensione degli aggregati e della densità delle cellule generale dovrebbero influenzare l&#39;apporto di ossigeno. Questo può diventare una considerazione rilevante in applicazioni a valle. Inoltre, la morte cellulare per apoptosi è una preoccupazione durante la dissociazione hPSCs a singole cellule. Pertanto, è fondamentale per garantire che inibitore ROCK è presente durante l&#39;aggregazione delle cellule forzata nei pozzetti. Infine, è fondamentale che il giorno 4 di differenziazione aggregati sono ben lavati per rimuovere tracce Activin A, presente nella induzione 1 Medium, prima risospensione in induzione 2 Medium. Dopo il giorno 4 di differenziazione, Activin A promuove la differenziazione endoderma a scapito della mesoinduzione derma 20. L&#39;applicazione principale di questa tecnica è quello di schermare formati aggregati che promuovono differenziazione cardiaca efficiente. Tuttavia, uno dei limiti della tecnica attuale è che esso è impegnativo per la produzione su scala cardiaca a livelli clinicamente rilevanti utilizzando micropiastre. Scale up di differenziazione cardiaca è tipicamente effettuata in condizioni di coltura di massa in bioreattori sospensione agitata 21. Pertanto, una volta che il sistema di micropozzetti è stato utilizzato per determinare gli intervalli accettabili di granulometria all&#39;induzione cardiaca efficiente, il passo successivo per scalare è determinare velocità bioreattore girante che possono generare la dimensione aggregata cella desiderata. Una delle differenze significative di questa tecnica rispetto ad altri metodi per la differenziazione cardiaca aggregate basato è che consente indagini dirette in modulando gli effetti di segnalazione endogena in aggregati nonchéla co-coltura di tipi induttivi / inibitori di tessuto con le hPSCs nell&#39;aggregato 13. Questi tipi di indagini possono informare lo sviluppo dei processi di produzione su larga scala cardiaco.

In colture cellulari in vitro può essere eseguita in un certo numero di modalità, ma viene in genere effettuata sia in condizioni aderenti bidimensionali o in condizioni di sospensione tridimensionali che ricapitolano più pienamente nei sistemi in vivo. Di conseguenza vi è una tendenza crescente in molti campi di ricerca per sviluppare metodi robusti per generare costrutti tessuti tridimensionali. Negli scenari in cui tipi e processi cellulari richiedono un supporto matrice extracellulare (ECM) superficiali e adesione segnali, tridimensionale coltura può essere attivata tramite costrutti ponteggi, dove le cellule sono coltivate su o in un esogeno supporto matrice 1. Cellule e processi che non richiedono l&#39;adesione ad una matrice di supporto può essere effettuata in sospensione come sistemi unscaffolded composti principalmente o esclusivamente di cellule (che può quindi procedere a generare le proprie matrici endogeni) 2,3. Qui, vi presentiamo un protocollo per cardiaco differenziazione of cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs - le cellule staminali in grado di diventare qualsiasi tipo di cellula del corpo, sia da fonti embrionali o altri) di dimensioni controllate, uniforme, aggregati unscaffolded. Differenziazione delle hPSCs come aggregati di sospensione è afflitto da grandi variazioni nella dimensione aggregata sia all&#39;interno di una corsa e tra corse. Questa variabilità è una conseguenza del metodo tipicamente impiegato per generare questi aggregati, che comporta la dissociazione meccanica di colonie di cellule. Per ridurre questa variabilità, un certo numero di approcci sono stati impiegati per controllare il numero di cellule per aggregato nonché diametro complessivo e uniformità. Gli esempi includono formazione di aggregati in provette da microcentrifuga 4 o come gocce appeso 5, micropatterning definiti bidimensionali colonie HPSC 6 che possono poi essere trasferiti alla sospensione, o centrifugazione di cellule in U o piastre multi-e V-bottom 7,8, 9. Tuttavia, tutti questi approaches sono limitati dalla loro basso rendimento della produzione di aggregati. Sistemi che basati impiegano un approccio simile ai sistemi piastra V-bottom, ma la dimensione più piccola dei pozzetti (in questo protocollo ciascuno avente una larghezza di 400 micron) permette la generazione di un numero maggiore di aggregati uniformi da un&#39;unica cultura pozzetti (diametro standard di ~ 15,5 mm contenenti ~ 1.200 micropozzetti) di quella che sarebbe generato da una piastra di V-parte inferiore intero 10. La formazione di aggregati Ben-based è stato utilizzato in una serie di impostazioni tra cui la differenziazione di hPSCs a ectodermica 11, endodermico 12, 13 e mesodermiche extraembrionali 14 destino; condrogenesi da cellule staminali mesenchimali 15; generazione di supporti uniformi di screening tossicologico 16; e ricerche di mechanobiology 17. Una sfida importante per lo sviluppo di protocolli di produzione robuste per la produzione di cardiom HPSC di derivazioneyocytes è stata la mancanza di riproducibilità in cardiaca efficienza differenziazione tra corse. Abbiamo precedentemente dimostrato che questa variabilità può essere attribuita alla eterogeneità nella popolazione a partire HPSC, che comprende sia le cellule auto-rinnovamento hPSCs e differenziante che esprimono geni associati con endoderma e neurali differenziazione 6,18. I segnali secrete da queste cellule differenzianti impatto induzione cardiaco. In particolare, endoderma extraembryonic promuove l&#39;induzione cardiaco, mentre progenitori neurali inibiscono l&#39;induzione cardiaco. Su HPSC aggregazione, cellule all&#39;interno del differenziata complessiva e organizzare in modo che hPSCs indifferenziati sono circondate da uno strato di cellule endoderma extraembrionali che si sviluppano sulla superficie aggregata 13. Controllando dimensione aggregata, siamo in grado di modulare il rapporto tra cellule endoderma cardiache che inducono a hPSCs indifferenziate (superficie in rapporto al volume) e ottimizzare questo rapporto per l&#39;induzione cardiaca massima 13.

<table><tbody><tr>Cabina <td></td><td></td><td></td><td>di sicurezza biologica</td></tr><tr><td>Pipetta di sicurezza Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sierologiche (da 5 a 25 ml)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspiratore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td></td><td></td><td></td>aspiratore o Pasteur</tr> Tubi <tr><td>conici</td><td></td><td></td><td></td>da 15 e 50 ml</tr><tr><td>Cappa</td><td></td><td></td><td></td>aspirante</tr><tr><td>0,22 & micro; m filtro</td><td></td><td></td><td></td>per siringa</tr><tr><td>5% CO2, 5% O2, e incubatore per colture cellulari a umidità controllata...</td><td></td><td></td><td>Incubatore ipossico (a basso contenuto di ossigeno)</td></tr><tr><td>5% CO2, 20% O2, e incubatore per colture cellulari a umidità controllata&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga a bassa velocità con rotore a secchiello oscillante dotato di portapiatti&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettatori P2, P20, P200 e P1000 e punte associate&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito con obiettivi di fase 4X, 10X e 20X&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti con attacco ultrabasso (ULA)&nbsp;</td><td>Corning/Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr>Provette <td></td><td></td><td></td><td>per microcentrifuga da 1,5 ml</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td></td><td></td><td></td>da banco</tr><tr><td>Acido L-Ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata ultrapura sterile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &deg; C congelatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>Tossico; L'aliquotazione di MTG è fortemente consigliata per ridurre al minimo l'ossidazione dovuta all'apertura ripetuta. Le aliquote possono essere conservate a 4 gradi; C per un massimo di 3 mesi, -20 gradi C è consigliato per la conservazione a lungo termine.</td></tr><tr><td>StemPro-34 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10639-011</td><td>Terreno di induzione cardiaca basale; L'integratore è conservato a -20 gradi C e il mezzo basale a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R& D Technologies</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Technologies</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R& D Technologies</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Technologies</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Reagenti Direct</td><td>57-G89</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15561</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td> Dimetilsolfossido <td>corrosivo</td></tr><tr><td>(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12660</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicillina/Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>100x L-glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Sostituzione del siero knockout</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563</td><td>Emocitometro</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> enzimatico di dissociazione <tr><td>Trypan Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 piastre</td><td>StemCell Technologies</td><td>27845</td><td>piastre per micropozzetti</td></tr><tr><td>Soluzione di risciacquo Aggrewell</td><td>StemCell Technologies</td><td>7010</td><td>Soluzione di risciacquo per micropozzetti</td></tr><tr><td>Y-27632 Inibitore ROCK</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti (per colorazione FACS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente di permeabilizzazione intraprep</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM2389</td><td>Kit con 2 parti: soluzione di fissazione e soluzione di permeabilizzazione; </td></tr><tr><td>Neomarcatori</td> <td>di anticorpi tossici cTnT</td><td>MS-295</td><td></td></tr><tr><td>capra anti-topo-IgG APC anticorpoThermoFisher</td><td>Molecular Probes</td><td>A865</td><td></td></tr><tr><td>provette per citometria a flusso di fondo rotondo da 5 ml</td><td>FACS dipendente dalla</td><td></td><td></td> macchina</tr></tbody></table>

aggregate ottimizzazione dimensione in pozzetti per sospensione a base cardiaco differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

La differenziazione cardiaca delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) viene tipicamente effettuata in aggregati di cellule in sospensione. La formazione convenzionale di aggregati di hPSC comporta la dissociazione delle colonie cellulari in grumi più piccoli, con il controllo delle dimensioni dei grumi grossolanamente controllato mediante pipettaggio della sospensione cellulare fino a raggiungere la dimensione del grumo desiderata. Una delle principali sfide della differenziazione cardiaca convenzionale basata su aggregati di hPSC è che l'eterogeneità della coltura e la disorganizzazione spaziale portano a una resa cardiomiocitaria variabile e inefficiente. Noi e altri abbiamo precedentemente riportato che la dimensione dell'aggregato di cellule staminali embrionali umane (hESC) può essere modulata per ottimizzare l'efficienza dell'induzione cardiaca. Abbiamo affrontato questa sfida impiegando un approccio scalabile basato su micropozzetti per controllare i parametri fisici della formazione degli aggregati, in particolare le dimensioni e la forma degli aggregati. Il metodo che descriviamo qui consiste nell'aggregazione forzata di numeri definiti di hPSC in micropozzetti e nella successiva coltura di questi aggregati in condizioni che dirigono l'induzione cardiaca. Questo protocollo può essere facilmente scalato a seconda delle dimensioni e del numero di pozzetti utilizzati. Utilizzando questo metodo, possiamo ottenere costantemente risultati di coltura con frequenze di cardiomiociti superiori al 70%.

aggregati dimensioni controllate di hPSCs possono efficacemente essere formati usando il sistema microtiter, dipendente soltanto dalla concentrazione di cellule e la superficie micropozzetto. Dopo una breve centrifugazione, i numeri appropriati di cellule (1.000 in questo protocollo) sono riunite in ciascun pozzetto (Figura 1A). È importante sottolineare che queste cellule ristabilire connessioni intracellulari entro 24 ore, e non dovrebbero più riempire il pozzo, ma appaiono come aggregati compatti con bordi lisci (Figura 1B). Questi aggregati forniscono i materiali di partenza per un&#39;ulteriore differenziazione verso un destino cardiaco. Se le cellule non riescono a formare ammassi stretti, questo suggerisce possibile morte cellulare dopo dissociazione e riaggregazione, e l&#39;idoneità delle concentrazioni singole passaging cellulare e inibitore ROCK per una particolare linea cellulare dovrebbe essere esaminato. I seguenti tre giorni in pozzetti mostrano piccolo cambiamento nella morfo aggregatalogia, anche se alcuni la crescita è evidente. Quando viene rimosso dai pozzetti, aggregati dovrebbero mantenere il loro turno, la morfologia fitto ed essere di dimensioni simili l&#39;uno all&#39;altro (Figura 1C). Cultura in ULA piastre da 24 pozzetti permetterà l&#39;ulteriore espansione e la crescita cellulare. Di giorno 8, dopo l&#39;esposizione prima alla segnalazione Activin, e l&#39;inibizione Wnt, gli aggregati inizieranno ad apparire come aggregati più grandi e più luminosi (Figura 1D). Durante questo periodo, considerevole detriti cellulari sarà evidente al fondo di ogni pozzetto e rimosso permettendo aggregati di stabilirsi prima di rimuovere media. Di tanto in tanto, molti aggregati si fonderanno insieme. Questo non inibisce la differenziazione degli altri aggregati nel pozzo, anche se queste &quot;aggregati super&quot; tendono a non mostrare i cambiamenti morfologici osservati con aggregati più piccole e sono meno probabilità di subire differenziazione completa. &quot;Jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; risultati differenziazione Continua a notevoli cambiamenti morfologici agli aggregati con una maggiore dimensione e la comparsa delle regioni fibrosi organizzati. Di giorno 12, aggregati contraenti possono essere osservati. Questi saranno sempre costituiti da grandi cellule trasparenti e spesso includono una vasta matrice extracellulare di fuori dell&#39;aggregato (Figura 2). Mentre le contrazioni aggregati a livello indicano una differenziazione di successo, espressione marcatore cardiaco può anche essere osservato in aggregati che non appaiono a contrarsi. Dopo la dissociazione di aggregati e immunomarcatura, la maggioranza delle cellule sarà positivo per la cTnT marcatore cardiomiociti mediante citometria di flusso (Figura 3). L&#39;espressione di questo marcatore è stabile nelle cellule e può essere osservato in aggregati più tardi il giorno 19 di differenziazione. 1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Timeline di HPSC differenziato verso un destino cardiaco Subito dopo l&#39;aggregazione, le cellule quasi riempire ciascun pozzetto (A).. Il giorno dopo, gli aggregati appaiono condensati e liscia (B). Questa morfologia persiste anche quando gli aggregati vengono rimossi dai pozzetti e piastrate in piastre e (C). Di giorno 8, aggregati iniziano ad espandersi e appaiono di colore più chiaro (D). Barra di scala:. 250 micron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig2.jpg" /> Figura 2: Aggregati Inizia contraente da Giorno 12 di differenziazione Dopo sei giorni in Cardiac induzione Stage 3 Media, sono state osservate forti contrazioni a livello aggregato (pannello superiore:. Rilassarsizione, pannello centrale: contrazione). Il pannello inferiore è derivato da sottraendo i pannelli superiori e medie, con la maggior parte delle differenze significative appaiono come nero o bianco (punte di freccia). Barra di scala:. 250 micron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig3.jpg" /> Figura 3:. Immunomarcatura per cardiaca Troponina T differenziata hPSCs Al giorno 17, la maggior parte delle cellule sono positivi per la troponina cardiaca T mediante citometria di flusso (istogramma pieno). Anche dimostrato sono cellule colorate con anticorpo secondario da solo (istogramma vuoto). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

I metodi convenzionali per avviare la differenziazione cardiaca basato sospensione aggregato di pluripotenti umane deriva cellule (hPSCs) sono afflitti con la cultura eterogeneità rispetto alle dimensioni e la forma di aggregazione. Qui, descriviamo un metodo affidabile per la differenziazione cardiaca utilizzando i pozzetti di generare dimensione controllata HPSC aggrega coltivate in condizioni cardiache di promozione.

Aggregate ottimizzazione Dimensione in pozzetti per sospensione a base cardiaco differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

Prima di tutto, centrifugare una sospensione di cellule staminali pluripotenti umane singole, o HPSC, a 200 × g per cinque minuti. Al termine della centrifugazione, aspirare il mezzo di lavaggio e risospendere le cellule nel mezzo di aggregazione, a una densità di 1,2 × 10⁶ cellule per millilitro. Successivamente, seminare un millilitro della sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a micropozzetti preparata, distribuendo uniformemente le cellule.Per seminare un elevato numero di pozzetti, vortexare periodicamente la sospensione cellulare per evitare il sedimentazione. Dopo la semina, centrifugare la piastra a 200 ×g per cinque minuti. Al termine della centrifugazione, osservare la piastra al microscopio per verificare che le cellule siano sedimentate sul fondo di ogni micropozzetto.Quindi, incubare la piastra per 24 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore ipoxico con 5% CO₂, 5% O₂. Un giorno dopo l'aggregazione, esaminare gli aggregati al microscopio. Rispetto agli aggregati immediatamente dopo la centrifugazione, dovrebbero apparire integri con bordi lisci.Rimuovere il soprannatante tenendo orizzontalmente la piastra a micropozzi e posizionando la punta di una micropipetta P-1000 sulla superficie del mezzo di coltura, appoggiandola al bordo del pozzetto. Quindi, rimuovere lentamente il mezzo, avendo cura di non disturbare gli aggregati sul fondo dei micropozzi. Dopo aver ridotto il livello del mezzo a circa uno o due millimetri dalla superficie testurizzata dei micropozzi, inclinare lentamente la piastra ed aspirare lentamente il mezzo rimanente dal pozzetto.Aggiungere un millilitro di mezzo di induzione frescamente preparato e preriscaldato del primo stadio, tenendo la punta della pipetta contro il bordo interno della pozzetta ed erogando molto lentamente il mezzo contro la parete interna della pozzetta. Rimettere la piastra nell'incubatrice in condizioni ipossiche per tre giorni. Al quarto giorno, utilizzare una pipetta sierologica da cinque millilitri per raccogliere gli aggregati da ogni pozzetta della piastra a micropozzette.Raccogliere fino a 10 pozzetti di sospensione di aggregati in un tubo conico da 15 millilitri. Lasciare sedimentare gli aggregati per 15 minuti in un incubatore ipossico. Dopo la sedimentazione, aspirare con attenzione il soprannatante e risospendere gli aggregati in dieci millilitri di mezzo di lavaggio preriscaldato, per rimuovere le citochine induttive residue.Centrifugare gli aggregati a 50 ×g per due minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare il soprannatante e risospendere gli aggregati pellettizzati nel mezzo di induzione pre-riscaldato della fase due. Trasferire la sospensione di aggregati in una piastra a 24 pozzetti con superficie ultra-liscia, utilizzando un millilitro per pozzetto.Osservare gli aggregati al microscopio come grappoli cellulari compatti e uniformi. Incubare in condizioni ipossiche fino al sesto giorno. Al sesto giorno, raccogliere fino a 10 millilitri di aggregati per ogni provetta conica da 15 millilitri, come in precedenza.Dopo che gli aggregati si sono depositati, aspirare il soprannatante e risospendere gli aggregati nel mezzo di induzione pre-riscaldato della fase tre. Utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, distribuire gli aggregati in una piastra da 24 pozzetti con superficie ultra-bassa di adesione, con un millilitro per pozzetto. Eseguire un completo cambio di mezzo al giorno 10 della coltura.Al giorno 12, trasferire le cellule in condizioni di coltura normossiche con 20% di ossigeno e 5% di anidride carbonica per il resto del periodo di coltura. Dopo 12 giorni di differenziamento, corrispondenti a sei giorni in mezzo di induzione cardiaca di terzo stadio, sono state osservate contrazioni forti a livello dell'intero aggregato. Al giorno 17, il 74,8% delle cellule risulta positivo per la troponina T cardiaca, mediante citometria a flusso, come indicato dalla porzione piena dell'istogramma.Sono mostrate anche cellule colorate solo con l'anticorpo secondario, indicate dalla sezione non riempita dell'istogramma. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante lavare accuratamente gli aggregati al quarto giorno, per rimuovere tracce di citochine, in particolare activina-A, che promuove la differenziazione in endoderma, a discapito dell'induzione cardiaca. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la coltura a temperatura controllata di tipi cellulari induttivi all'interno dell'aggregato, per rispondere ad altre domande, ad esempio in che modo il segnale paracrino proveniente dai tessuti embrionali vicini influenza la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane verso la linea cardiaca.

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Biologia dello sviluppo

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) hanno la capacità intrinseca di differenziare e di auto-organizzarsi in schemi dei tessuti distinti; anche se questo richiede la presentazione di gradienti spaziali ambientali. Presentiamo stencil micropatterning come metodo semplice e robusto per generare gradienti biochimici e meccanici per controllare modelli differenziazione HPSC.

Stencil micropatterning di cellule staminali umane pluripotenti per Probing spaziale Organizzazione di differenziazione Fates

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di singole cellule con una piattaforma microfluidica, che utilizza un nuovo concetto di progettazione di micropozzetti per consentire l'isolamento di singole cellule ad alta efficienza e la coltura clonale a lungo termine.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Qui, presentiamo un protocollo di differenziazione dei cardiomiociti robusto, veloce e scalabile per cellule staminali pluripotenti umane (hPSC). I cardiomiociti derivati utilizzando questo metodo su larga scala possono fornire un numero sufficiente di cellule per il loro uso efficace nella modellazione delle malattie cardiovascolari umane, nello screening di farmaci ad alto rendimento e potenzialmente in applicazioni cliniche.

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Questo protocollo descrive un sistema di coltura dinamica per produrre aggregati di dimensioni controllate delle cellule staminali pluripotenti umane e stimolare ulteriormente la differenziazione negli organoidi cerebellari in condizioni chimicamente definite e senza alimentatori utilizzando un bioreaettore monouso.

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Qui, descriviamo una metodologia facile da usare per generare array di microtessuti cardiaci auto-assemblati 3D composti da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti preseferenziate indotte dall'uomo, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali. Questa tecnica user-friendly e a bassa richiesta cellulare per generare microtessuti cardiaci può essere implementata per la modellazione della malattia e le prime fasi dello sviluppo del farmaco.

Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali

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Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

L'obiettivo di questo protocollo è spiegare e dimostrare lo sviluppo di un modello microfluidico tridimensionale (3D) di tessuto cardiaco umano altamente allineato, composto da cardiomiociti derivati da cellule staminali co-coltivati con fibroblasti cardiaci (FF) all'interno di un idrogel biomimetico a base di collagene, per applicazioni nell'ingegneria dei tessuti cardiaci, nello screening dei farmaci e nella modellazione delle malattie.

Sviluppo di tessuto cardiaco umano organizzato in 3D all'interno di una piattaforma microfluidico

Qui viene presentato un insieme di protocolli per la generazione e la crioconservazione di sferoidi cardiaci (CS) da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo coltivati in un formato multidimensionale ad alto rendimento. Questo modello tridimensionale funziona come una solida piattaforma per la modellazione delle malattie, gli screening ad alto rendimento e mantiene la sua funzionalità dopo la crioconservazione.

Generazione, screening ad alto rendimento e biobanca di sferoidi cardiaci derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Gli organoidi sono diventati strumenti preziosi per la modellazione delle malattie. La matrice extracellulare (ECM) guida il destino cellulare durante la generazione degli organoidi e l'utilizzo di un sistema che assomiglia al tessuto nativo può migliorare l'accuratezza del modello. Questo studio confronta la generazione di organoidi intestinali umani derivati da cellule staminali pluripotenti indotte in ECM di origine animale e idrogel privi di xeno.

Studio comparativo di matrici di membrana basale per il mantenimento di cellule staminali umane e la generazione di organoidi intestinali

Questo protocollo presenta un metodo per generare organoidi vascolari utilizzando cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione di organoidi vascolari da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Scopri un metodo robusto per la differenziazione cardiaca di cellule staminali pluripotenti umane utilizzando micropozzetti per generare aggregati di dimensioni controllate. Questa tecnica riduce l'eterogeneità culturale e migliora i risultati di differenziazione.

Aggregate ottimizzazione Dimensione in pozzetti per sospensione a base cardiaco differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti (Video) | JoVE Journal

Aggregate ottimizzazione Dimensione in pozzetti per sospensione a base cardiaco differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti

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