Aggregate ottimizzazione Dimensione in pozzetti per sospensione a base cardiaco differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti
25 settembre 2016
I metodi convenzionali per avviare la differenziazione cardiaca basato sospensione aggregato di pluripotenti umane deriva cellule (hPSCs) sono afflitti con la cultura eterogeneità rispetto alle dimensioni e la forma di aggregazione. Qui, descriviamo un metodo affidabile per la differenziazione cardiaca utilizzando i pozzetti di generare dimensione controllata HPSC aggrega coltivate in condizioni cardiache di promozione.
Innanzitutto, centrifugare una cellula staminale pluripotente umana a cellula singola, o sospensione HPSC, a 200 volte g per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare il mezzo di lavaggio e risospendere le cellule nel mezzo di aggregazione, ad una densità di 1,2 volte 10 per la sesta cellula per millilitro. Quindi, seminare un millilitro della sospensione cellulare in ciascun pozzetto sulla piastra a micropozzetti preparata e distribuire uniformemente le cellule.
Per seminare un gran numero di pozzetti, agitare periodicamente la sospensione cellulare per evitare che si depositi. Dopo la semina, centrifugare la piastra a 200 volte g per cinque minuti. Dopo la centrifuga, osservare la piastra al microscopio per confermare che le cellule siano state ruotate sul fondo di ciascun micropozzetto.
Quindi, incubare la piastra per 24 ore a 37 gradi Celsius in un'incubatrice ipossica al 5% C-O due, 5% O due. Un giorno dopo l'aggregazione, ispezionare gli aggregati al microscopio. Rispetto all'aggregazione post-centrifuga immediata, dovrebbero apparire integri con bordi lisci.
Rimuovere il surnatante tenendo la piastra per micropozzetti orizzontalmente e posizionando la punta di un micropipettor P-1000 sulla superficie del terreno di coltura e contro il bordo del pozzetto. Quindi, rimuovere lentamente il terreno, facendo attenzione a non disturbare gli aggregati sul fondo dei micropozzetti. Dopo aver ridotto il livello del terreno a circa uno o due millimetri dalla superficie testurizzata del micropozzetto, inclinare lentamente la piastra e aspirare lentamente il terreno rimanente dal pozzetto.
Aggiungere un milliletro di terreno di induzione preriscaldato di fase uno appena preparato tenendo la punta della pipetta contro il bordo interno del pozzetto e dosando molto lentamente il mezzo contro la parete interna del pozzetto. Rimettere la piastra nell'incubatrice in condizioni di ipossia per tre giorni. Il quarto giorno, utilizzare una pipetta sierologica da cinque millilitri per raccogliere gli aggregati da ciascun pozzetto della piastra a micropozzetti.
Raccogliere fino a 10 pozzetti di sospensione aggregata in una provetta conica da 15 millilitri. Lasciare riposare gli aggregati per 15 minuti in un'incubatrice ipossica. Dopo che gli aggregati si sono depositati, aspirare con cura il surnatante e risospendere gli aggregati in dieci millilitri di terreno di lavaggio preriscaldato, per rimuovere le citochine induttive residue.
Centrifugare gli aggregati a 50 volte g per due minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere gli aggregati pellettati in un mezzo di induzione preriscaldato di fase due. Trasferire la sospensione aggregata su una piastra di fissaggio ultra-bassa a 24 pozzetti a un millilitro per pozzetto.
Osservare gli aggregati al microscopio come ammassi di cellule strette uniformi. Incubare in condizioni di ipossia fino al sesto giorno. Il sesto giorno, raggruppare fino a 10 millilitri di aggregati per provetta conica da 15 millilitri come prima.
Dopo che gli aggregati si sono depositati, aspirare il surnatante e risospendere gli aggregati nel mezzo di induzione preriscaldato di stadio tre. Utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, ridistribuire gli aggregati in una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti, a un millilitro per pozzetto. Esegui un cambio medio completo il giorno 10 della cultura.
Il giorno 12, trasferire le cellule in condizioni di coltura normossica con il 20% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica per il resto del periodo di coltura. Dopo 12 giorni di differenziazione, che corrispondono a sei giorni nella fase di induzione cardiaca, sono state osservate tre contrazioni medie e forti a livello aggregato. Al giorno 17, il 74,8% delle cellule è positivo per la troponina T cardiaca, mediante citometria a flusso, come indicato dalla porzione riempita dell'istogramma.
Sono mostrate anche cellule colorate con il solo anticorpo secondario, mostrato dalla sezione non riempita dell'istogramma. Durante il tentativo di questa procedura, è importante lavare bene gli aggregati il quarto giorno, per rimuovere i livelli di tracce di citochine, in particolare l'activina-A, che promuove la differenziazione dell'endoderma, a scapito dell'induzione cardiaca. Seguendo questa procedura, altri metodi, come la coltura fredda di tipi di cellule induttive all'interno dell'aggregato, possono essere eseguiti per rispondere ad altre domande, come ad esempio come la segnalazione paracrina dai tessuti embrionali vicini influenzi la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane nel lignaggio cardiaco.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo robusto per la differenziazione cardiaca di cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) mediante l'uso di micropozzetti per generare aggregati con dimensioni controllate. Il metodo affronta i problemi di eterogeneità della coltura associati alle tecniche convenzionali.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia delle Cellule Staminali
- Differenziamento Cardiaco
- Ingegneria dei Tessuti
Sfondo
- Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) possono differenziarsi in vari tipi cellulari, inclusi i cardiomiociti.
- I metodi convenzionali spesso producono aggregati di dimensioni e forme variabili, influenzando negativamente i risultati del differenziamento.
- La tecnologia dei micropozzetti offre una soluzione per generare aggregati uniformi.
- Condizioni che favoriscono la differenziazione cardiaca sono essenziali per un efficace differenziamento.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per generare aggregati di hPSC con dimensioni controllate.
- Migliorare la coerenza dei risultati della differenziazione cardiaca.
- Facilitare ulteriori ricerche nell'ingegneria dei tessuti cardiaci.
Metodi Utilizzati
- Centrifugazione della sospensione di hPSC per formare aggregati.
- Utilizzo di piastre con micropozzetti per controllare la dimensione degli aggregati.
- Incubazione in condizioni ipossiche per favorire la differenziazione cardiaca.
- Cambi sequenziali del mezzo per indurre le fasi di differenziazione.
Risultati principali
- Sono stati formati aggregati uniformi e mantenuti per tutto il processo di differenziazione.
- È stata osservata una significativa espressione della troponina T cardiaca nelle cellule differenziate.
- La rimozione migliorata dei citochine induttive ha potenziato l'impegno verso la linea cardiaca.
- Sono state osservate contrazioni a livello dell'intero aggregato dopo 12 giorni di differenziazione.
Conclusioni
- Il metodo dei micropozzi fornisce un approccio affidabile per la differenziazione cardiaca delle hPSC.
- Aggregati controllati per dimensione portano a risultati di differenziazione più uniformi.
- Questa tecnica può essere applicata per approfondire lo studio dello sviluppo cardiaco e della modellizzazione delle malattie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il controllo della dimensione degli aggregati nella differenziazione cardiaca in sospensione affronta un collo di bottiglia fondamentale nella produzione di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane: l'eterogeneità della coltura che porta a rese variabili. Imponendo la formazione uniforme di aggregati mediante tecnologia a micropozzetti, questo metodo aumenta l'affidabilità predittiva degli esiti della differenziazione, favorendo la generazione di modelli preclinici scalabili e riproducibili. Ciò colloca l'approccio come uno strumento strategico per ridurre i rischi associati all'impegno della linea cardiaca nelle fasi iniziali della scoperta e dei percorsi traslazionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di vie di segnalazione dipendenti dalle dimensioni nell'induzione cardiaca, chiarificando i fattori meccanicistici della specificazione delle linee cellulari.
- Valore operativo: Riduce la variabilità nella formazione degli aggregati, migliorando la riproducibilità tra esperimenti e gruppi di lavoro.
- Valore predittivo: Consente la modellizzazione dose-risposta all'esposizione a morfogeni, standardizzando la geometria degli aggregati come variabile controllata.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce microtessuti uniformi adatti all'analisi mediante imaging ad alto contenuto e alla quantificazione di cardiomiociti basata sulla citometria a flusso.
- Scalabilità: Il formato a piastre con micropozzetti consente l'elaborazione in parallelo di molteplici condizioni o contesti genetici per screening comparativi.
- Output quantitativo: Permette una misurazione costante delle cellule positive per la troponina T cardiaca come parametro funzionale in studi di perturbazione indotta da composti chimici o modifiche genetiche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Sistema Rilevante per le Malattie: Genera aggregati cardiaci omogenei e scalabili per modellare cardiomiopatie ereditarie o cardiotoxicità indotta da farmaci.
- Continuità Translazionale: Collega la differenziazione nella fase di scoperta con la validazione preclinica fornendo materiale cellulare consistente tra diversi lotti.
- Riduzione del Rischio Meccanicistico: Minimizza le variabili di confondimento derivanti dall'eterogeneità della dimensione degli aggregati, aumentando la sicurezza nelle associazioni tra fenotipo e genotipo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo una differenziazione standardizzata delle hPSC, che alimenta applicazioni successive come la modellizzazione delle malattie, la farmacologia tossicologica e la valutazione di candidati per la medicina rigenerativa.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo ai segnali biofisici nel destino differenziativo cardiaco grazie al controllo preciso delle dimensioni e della forma degli aggregati.
- Screening: Consente di ottenere array di microtessuti riproducibili per lo screening di librerie di composti, riducendo il rumore derivante dalla variabilità dell'aggregazione.
- Analisi: Permette letture quantitative mediante citometria a flusso e imaging (ad esempio, troponina T cardiaca) con un migliore rapporto segnale-rumore grazie all'omogeneità della popolazione cellulare.
- Ricerca traslazionale: Fornisce una fonte scalabile di cardiomiociti per saggi funzionali preclinici, inclusi quelli di contrattilità ed elettrofisiologia.
- Riutilizzo aziendale: Le piastre con micropozzetti possono essere riutilizzate in diversi progetti e linee cellulari, favorendo una standardizzazione a livello di piattaforma nei protocolli di differenziamento delle cellule staminali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva negli esiti della differenziazione riducendo al minimo il rumore biologico derivante dalla variabilità delle dimensioni degli aggregati.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la produttività grazie alla formazione standardizzata e scalabile degli aggregati.
- Valore strategico: Aumenta la sicurezza nelle decisioni di proseguimento o interruzione dei programmi cardiaci precoci riducendo i falsi negativi dovuti a una differenziazione inefficiente.
- Impatto sul portafoglio: Permette un'allocazione delle risorse adeguata al rischio basata su metriche affidabili di resa in cardiomiociti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di hPSC, nella manipolazione di aggregati e nei sistemi di incubazione ipoxici.
- Dipende dall'accesso a piastre con micropozzi di dimensioni definite e superfici non aderenti.
- Necessita di protocolli standardizzati di cambio del mezzo per evitare il danneggiamento degli aggregati durante i passaggi di lavaggio.
- Richiede una validazione su diverse linee di hPSC per garantire che le relazioni tra dimensione ed efficienza di differenziazione siano costanti.
- È limitato dalla necessità di attrezzature specializzate (incubatori ipossici, piastre non aderenti) e di passaggi di lavaggio con citochine ottimizzati per prevenire differenziazioni non specifiche.
