Aggregate ottimizzazione Dimensione in pozzetti per sospensione a base cardiaco differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti

Innanzitutto, centrifugare una cellula staminale pluripotente umana a cellula singola, o sospensione HPSC, a 200 volte g per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare il mezzo di lavaggio e risospendere le cellule nel mezzo di aggregazione, ad una densità di 1,2 volte 10 per la sesta cellula per millilitro. Quindi, seminare un millilitro della sospensione cellulare in ciascun pozzetto sulla piastra a micropozzetti preparata e distribuire uniformemente le cellule.

Per seminare un gran numero di pozzetti, agitare periodicamente la sospensione cellulare per evitare che si depositi. Dopo la semina, centrifugare la piastra a 200 volte g per cinque minuti. Dopo la centrifuga, osservare la piastra al microscopio per confermare che le cellule siano state ruotate sul fondo di ciascun micropozzetto.

Quindi, incubare la piastra per 24 ore a 37 gradi Celsius in un'incubatrice ipossica al 5% C-O due, 5% O due. Un giorno dopo l'aggregazione, ispezionare gli aggregati al microscopio. Rispetto all'aggregazione post-centrifuga immediata, dovrebbero apparire integri con bordi lisci.

Rimuovere il surnatante tenendo la piastra per micropozzetti orizzontalmente e posizionando la punta di un micropipettor P-1000 sulla superficie del terreno di coltura e contro il bordo del pozzetto. Quindi, rimuovere lentamente il terreno, facendo attenzione a non disturbare gli aggregati sul fondo dei micropozzetti. Dopo aver ridotto il livello del terreno a circa uno o due millimetri dalla superficie testurizzata del micropozzetto, inclinare lentamente la piastra e aspirare lentamente il terreno rimanente dal pozzetto.

Aggiungere un milliletro di terreno di induzione preriscaldato di fase uno appena preparato tenendo la punta della pipetta contro il bordo interno del pozzetto e dosando molto lentamente il mezzo contro la parete interna del pozzetto. Rimettere la piastra nell'incubatrice in condizioni di ipossia per tre giorni. Il quarto giorno, utilizzare una pipetta sierologica da cinque millilitri per raccogliere gli aggregati da ciascun pozzetto della piastra a micropozzetti.

Raccogliere fino a 10 pozzetti di sospensione aggregata in una provetta conica da 15 millilitri. Lasciare riposare gli aggregati per 15 minuti in un'incubatrice ipossica. Dopo che gli aggregati si sono depositati, aspirare con cura il surnatante e risospendere gli aggregati in dieci millilitri di terreno di lavaggio preriscaldato, per rimuovere le citochine induttive residue.

Centrifugare gli aggregati a 50 volte g per due minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere gli aggregati pellettati in un mezzo di induzione preriscaldato di fase due. Trasferire la sospensione aggregata su una piastra di fissaggio ultra-bassa a 24 pozzetti a un millilitro per pozzetto.

Osservare gli aggregati al microscopio come ammassi di cellule strette uniformi. Incubare in condizioni di ipossia fino al sesto giorno. Il sesto giorno, raggruppare fino a 10 millilitri di aggregati per provetta conica da 15 millilitri come prima.

Dopo che gli aggregati si sono depositati, aspirare il surnatante e risospendere gli aggregati nel mezzo di induzione preriscaldato di stadio tre. Utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, ridistribuire gli aggregati in una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti, a un millilitro per pozzetto. Esegui un cambio medio completo il giorno 10 della cultura.

Il giorno 12, trasferire le cellule in condizioni di coltura normossica con il 20% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica per il resto del periodo di coltura. Dopo 12 giorni di differenziazione, che corrispondono a sei giorni nella fase di induzione cardiaca, sono state osservate tre contrazioni medie e forti a livello aggregato. Al giorno 17, il 74,8% delle cellule è positivo per la troponina T cardiaca, mediante citometria a flusso, come indicato dalla porzione riempita dell'istogramma.

Sono mostrate anche cellule colorate con il solo anticorpo secondario, mostrato dalla sezione non riempita dell'istogramma. Durante il tentativo di questa procedura, è importante lavare bene gli aggregati il quarto giorno, per rimuovere i livelli di tracce di citochine, in particolare l'activina-A, che promuove la differenziazione dell'endoderma, a scapito dell'induzione cardiaca. Seguendo questa procedura, altri metodi, come la coltura fredda di tipi di cellule induttive all'interno dell'aggregato, possono essere eseguiti per rispondere ad altre domande, come ad esempio come la segnalazione paracrina dai tessuti embrionali vicini influenzi la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane nel lignaggio cardiaco.