Name: Progettazione di dispositivi microfluidici per lo studio Risposte cellulare in singolo o Coesistenza chimico / elettrico / Shear stress stimoli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Scopri la progettazione di dispositivi microfluidici in PMMA per studiare le risposte cellulari a stimoli chimici, elettrici e di shear stress in vitro. Questa piattaforma avanzata consente di replicare condizioni in vivo.

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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan nell'ambito del Contratto n. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), n. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun) e National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). Gli autori ringraziano anche il Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, per l'uso della sala di coltura cellulare.

1. Chip progettazione e fabbricazione <ol><li> Disegnare i modelli da ablazione su substrati PMMA e nastri doppio lato utilizzando software commerciale 24. <ol><li> Per studiare gli effetti di concentrazioni chimiche e sforzi di taglio, disegnare un pattern &quot;albero di Natale&quot; con una larghezza variabile alla sua estremità in ciascuna delle cinque aree culturali (Figure 1A e 1B). </li><li> Per studiare gli effetti delle concentrazioni chimiche e campi elettrici, disegnare un modello di &quot;albero di Natale&quot; con due canali fluidici più di ponti salini (Figura 2a e 2b). </li></ol></li><li> Scribe un modello individuale su un foglio di PMMA o un nastro a doppio lato caricando il file corrispondente nella incisione laser CO 2. <ol><li> Accendere il incisione laser, e controllare il suo collegamento al computer. Aprire il modello da ablated utilizzando il software commerciale. </li><li> Mettere un foglio PMMA o un nastro biadesivo on cima alla fase della punta per tracciare. Regolare il fuoco del laser CO 2, se necessario, utilizzando la barra di calibrazione e il visibile laser He-Ne. </li><li> Caricare il modello in scriber per l&#39;ablazione sul foglio PMMA o il nastro. </li><li> Sollevare il foglio di fantasia o nastro, rimuovere pezzi indesiderati, e pulire la superficie con soffiaggio di azoto. NOTA: Lo spessore della lastra PMMA è 1 mm, e quello del nastro biadesivo è 0,07 millimetri o 0,22 mm. </li></ol></li></ol> 2. assemblaggio di chip <ol><li> Con super colla, collegare gli adattatori acriliche (lunghezza x larghezza x altezza 10 mm x 10 mm x 5 mm, con filettature in mezzo) al livello più alto del chip allineando i filettature ei fori sulla parte superiore -La maggior parte strato. Queste schede servono come mezzo di ingressi / uscite e connettori ponte salino. </li><li> Assemblare il chip microfluidico all&#39;interno di una cappa a flusso laminare. </li><li> Montare il chip microfluidica stress chimico-shear (circuito integrato CSS). <ol><li> UNttach 3 fogli di lastre in PMMA tracciatura con 2 pezzi di descritto nastro biadesivo. (Figura 1A e 1B). </li><li> Aggiungere un altro pezzo di nastro biadesivo spessore 0,07 millimetri al fondo del chip e collegare il chip ad un diametro di 10 cm Petri. </li><li> Mettere il chip di assemblaggio nella camera a vuoto per una notte. </li></ol></li><li> Per montare il chip campo chimico-elettrico (circuito integrato CEF), allegare il foglio di PMMA ad un nastro biadesivo di spessore = 0,22 millimetri (Figura 2A e 2B). <ol><li> Attaccare il foglio di PMMA descritto e nastro biadesivo per un diametro di 10 cm Petri utilizzando questo stesso pezzo di nastro adesivo. </li></ol></li><li> Lasciare il chip montato all&#39;interno della cappa ed esporlo ai raggi UV per 30 minuti per la sterilizzazione. </li><li> Collegare gli ingressi a due siringhe da 3 ml con tubi di plastica e dita i dadi. Collegare l&#39;uscita di un tubo di scarico tramite un tubo di plastica ed un dado a bloccarlo. NOTA: Autoclavetutti i tubi e dadi a 121 ° C per 15 min prima dell&#39;uso. </li><li> Premere lentamente lo stantuffo della siringa per primi canali fluidici con PBS. Spingere siringhe avanti e indietro per rimuovere le bolle. </li><li> Mettere le fiches in un incubatore notte a 37 ° C sotto 5% di CO 2. NOTA: Questi due passaggi sono finalizzate a lavare il chip e rimuovere eventuali bolle rimanenti all&#39;interno del chip. </li><li> Prendere il chip fuori dell&#39;incubatore. </li><li> Preparare ponti salini agar per la generazione di campi elettrici nel chip CEF. <ol><li> Sciogliere 3% agarosio punto basso punto di fusione in tampone fosfato 1x salina tamponata (PBS) utilizzando un forno a microonde. </li><li> Iniettare la soluzione-phased agarosio nel canale ponte salino e inserire gli elettrodi prima soluzione si solidifica. </li><li> Posizionare elettrodi argento / argento cloruro nei dadi tubolari. </li></ol></li><li> Collegare le siringhe alle pompe siringa, e il flusso continuo del terreno di coltura (Dulbecco Modified Eagler17; s media, DMEM) nel canale fluidica per 10 minuti a una portata di 20 microlitri / min per sostituire PBS. </li></ol> 3. cellulare Preparazione e apparato sperimentale NOTA: Pre-caldo 1x PBS, terreno di coltura (DMEM più FBS), e tripsina in un bagno d&#39;acqua C 37 ° prima dell&#39;uso. <ol><li> Piastra 2 x 10 di cancro al polmone 5 celle CL1-5 25,26 in una capsula di Petri 10 centimetri fornito con DMEM più siero fetale bovino al 10% (FBS). Incubare le cellule all&#39;interno di un incubatore sotto 5% di CO 2 a 37 ° C fino al 90% di confluenza. </li><li> Aspirare il medio e lavare le cellule una volta con pre-riscaldato 1x PBS. Aggiungere 2 ml di tampone tripsina 0,05% per le cellule e attendere 2 a 3 min a 37 ° C per staccare le cellule. </li><li> Trasferire le cellule ad un 15 ml tubo di centrifugazione sterile e aggiungere 6 ml di mezzo di coltura nel tubo. invertire delicatamente il tubo per la miscelazione ed estrarre 5 microlitri del mezzo cella contenente per contare il numero di cellule in un hemocytometer. </li><li> Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 min. Sospendere 10 6 cellule in 1 ml di mezzo di coltura e posizionare il mezzo cella contenente in una siringa da 1 ml. </li><li> Infondere medio cella contenente nel chip microfluidico dalla presa e assicurarsi che la soluzione distribuisce attraverso tutte le cinque aree culturali. Incubare il chip all&#39;interno di un incubatore sotto 5% di CO 2 a 37 ° C per 2 ore. </li></ol> 4. Setup sperimentale <ol><li> Prendere il chip fuori dell&#39;incubatore e posizionarlo in cima ad un riscaldatore di vetro di ossido di indio e stagno trasparente (ITO). NOTA: Il vetro ITO è collegato ad un regolatore proporzionale-integrale-derivativa (PID) per mantenere la temperatura a 37 ± 0,5 ° C tramite feedback da un accoppiatore termica fissata saldamente tra il riscaldatore ITO e il chip. </li><li> Mettere il gruppo di chip-riscaldatore sulla cima di una fase XY motorizzato di un microscopio invertito per il monitoraggio migrazione cellulare o uno stadio XY fissoun microscopio a fluorescenza invertito per misurare la produzione di ROS. </li><li> Per generare differenti concentrazioni chimiche, riempire due siringhe con 5 ml di soluzioni chimiche di concentrazioni relative 0 e 1 (disciolti nel mezzo di coltura) e pompare nel chip a portate desiderate: nel chip CSS, ad un flusso di 0,3 ml / min per 1 ora; nel chip CEF, a una portata di 20 microlitri / min per i primi 20 min e una velocità di flusso di 20 ml / h per altri 120 minuti (tempo totale = 2 ore). </li><li> Nel chip CEF, per il monitoraggio della migrazione delle cellule, il programma lo stadio XY del microscopio per ripetere scattare foto, tramite una reflex digitale (DSLR), di certo campo di vista (FOV) all&#39;interno di aree culturali di ogni 15 min per 2 hr. </li><li> Per misurare la produzione di ROS, utilizzare l&#39;indicatore basato sulla fluorescenza 2&#39;-7&#39;-dichlorodihydrofluoresce diacetato (2&#39;-7&#39;-DCFDA). <ol><li> Preparare il brodo di 2&#39;-7&#39;-DCFDA a 10 mm di biologia molecolare grado disolfossido metilico (DMSO). Diluire DCFDA in DMEM senza siero solo (5 micron di DMEM). Il potenziale deacetilasi potrebbe aumentare i segnali di fondo e diminuire i segnali nelle cellule. </li><li> Dopo 1 h di shear stimolo stress nel chip CSS o dopo 2 ore di EF stimolo chip CEF, pompare 2&#39;-7&#39;-DCFDA (5 pM in DMEM) nel chip ad una portata di 20 microlitri / min per il primo 20 min e una velocità di flusso di 20 ml / h per altri 20 min. Per il lavaggio, pompa DMEM nel chip ad una portata di 20 l / h per 20 min. </li><li> Scatta foto, tramite una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD), di alcune FOV all&#39;interno di aree culturali per analizzare le intensità fluorescenti. </li></ol></li></ol> 5. I calcoli di concentrazioni chimiche, sforzi di taglio, e campi elettrici <ol><li> Sia il chip CSS e il chip CEF, calcolare le concentrazioni chimiche nelle cinque aree culturali. Ad esempio, iniettando H 2 O 2 di Conczioni 0 e 200 pM dalle due insenature, concentrazioni di 0, 25, 100, 175, e 200 pM vengono generati. NOTA: partendo dal presupposto che tutti i liquidi a flusso separato senza intoppi e in modo uniforme intorno alla forcella, le concentrazioni relative nelle cinque aree culturali sono 0, 1/8, 1/2, 7/8, e 1 rispettivamente. </li><li> Nel circuito integrato CSS, calcolare la sollecitazione di taglio (τ) in ciascuna delle aree di coltura usando <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq1.jpg" /> 27, in cui Q è la portata volumetrica, η è la viscosità fluidico, h è l&#39;altezza del canale, e w è la larghezza del canale. NOTA: Impostando Q = 0,3 ml / min a ciascun ingresso (Q = 0,12 ml / min in ciascuna area culturale), η = 0.0008 Pa · s per mezzo di coltura, h = 1 mm, w = 1 ~ 4 mm, la sollecitazione di taglio viene calcolata variare da 0,0048 Pa (regione larghezza di 4 mm) a 0,0192 Pa (regione di larghezza 1 mm). </li><li> Inil chip CEF, calcolare la forza EF entro ciascuna delle zone di coltura utilizzando E = I / (σA eff) (legge di Ohm), dove I è la corrente elettrica che scorre attraverso il canale fluidico, σ è la conducibilità elettrica del terreno di coltura, e A eff è l&#39;area della sezione trasversale effettiva del canale. NOTA: Utilizzando σ = 1,38 Ω -1 m -1 per mezzo di coltura e A eff = 0,22 millimetri 2 (larghezza = 1 mm ed altezza = 0,22 millimetri), la forza EF è calcolato per essere E (mV / mm) = I ( A) × 3.3 × 10 6. <ol><li> Come mostrato in figura 2D, trattare il circuito equivalente di cinque circuiti a sezione a C con quattro (8 + 35 + 8) segmenti e uno (5 + 35 + 5) segmento. NOTA: Analizzando questo circuito parallelo secondo la legge la tensione di Kirchhoff e la legge di Ohm, corrente che fluisce attraverso la cultura sono cinquecome, I 1 a I 5 dal basso verso l&#39;alto, sono calcolati a circa 0,49 I (zona 1), 0,25 mi (zona 2), 0,13 mi (zona 3), 0,08 mi (zona 4), ​​e 0,05 mi (area 5) rispettivamente, dove I è la totale corrente continua (cc). Con una corrente continua applicata di 0,157 mA, EF di 254, 130, 67, 41, e 26 mV / mm sono generate nei cinque aree culturali. NOTA: Per un&#39;analisi elettrico semplificato della rete microfluidica, tutti i segmenti fluidici sono considerate come resistori con resistenza proporzionale alla loro lunghezza. </li></ol></li></ol> Analisi 6. Dati Nota: L&#39;analisi dei dati viene effettuata utilizzando il software ImageJ. <ol><li> Analizzare la produzione di ROS. <ol><li> Eseguire il software ImageJ. Vai su &quot;File&quot; → Apri per caricare un&#39;immagine fluorescente da analizzare. </li><li> Vai a &quot;Immagine&quot; → &quot;Tipo&quot; → &quot;16 bit&quot; per cambiare l&#39;imetà per una scala di grigi. </li><li> Disegnare un poligono per racchiudere una cella. Vai a &quot;Analisi&quot; → &quot;Measure&quot; per misurare l&#39;intensità di fluorescenza media della cella. </li><li> Ripetere 6.1.3 per raccogliere intensità da almeno 50 cellule di tre esperimenti indipendenti, e calcolare l&#39;intensità media con errore standard della media (SEM). </li><li> Ripetere 6.1.1-6.1.4 per ogni condizione sperimentale. </li></ol></li><li> Analizzare Migrazione cellulare. <ol><li> Eseguire il software ImageJ. Vai su &quot;File&quot; → Apri per caricare un&#39;immagine scattata al tempo = 0 da analizzare. </li><li> Disegnare un poligono per racchiudere una cella. Vai a &quot;Analisi&quot; → &quot;Measure&quot; per misurare il centro di massa della cella come (x 1, y 1). </li><li> Ripetere 6.2.1- 6.2.2 per misurare il centro di massa della stessa cella (x 2, y 2) da un&#39;altra immagine prendere al tempo = t. </li><li> Calcolare il tasso di migrazione (in micron / ora) diquesta cella come <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq2.jpg" /> . </li><li> Ripetere 6.2.1-6.2.4 per raccogliere i tassi di migrazione da almeno 50 cellule di tre esperimenti indipendenti, e calcolare il tasso di migrazione media con errore standard della media (SEM). </li><li> Da 6.2.2 e 6.2.3, calcolare la direzionalità migrazione di questa cellula come coseno θ o <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq3.jpg" /> , Dove θ è l&#39;angolo tra il vettore della EF applicata (da positivo a negativo) e il vettore dall&#39;inizio alla posizione finale della cella (Figura 2G). </li><li> Ripetere 6.2.6 per raccogliere directedness migrazione da almeno 50 cellule di tre esperimenti indipendenti, e calcolare la direzionalità di migrazione media con errore standard della media (SEM). </li><li> Calcolare il tasso di migrazione media con SEM e la direzionalità di migrazione media con SEM per ogni condizione sperimentale. NOTA: A directednessdi +1 indica che tutte le cellule migrano verso il catodo, e un valore -1 indica che tutte le cellule migrano verso l&#39;anodo. La direzionalità di un gruppo di cellule in modo casuale in movimento è vicino a 0. </li></ol></li><li> Analizzare Allineamento celle. <ol><li> Eseguire il software ImageJ. Vai su &quot;File&quot; → &quot;Apri&quot; per caricare un&#39;immagine da analizzare. </li><li> Trattare la cella come un&#39;ellisse e tracciare una linea per indicare l&#39;asse longitudinale di una cella. Vai a &quot;Analisi&quot; → &quot;Measure&quot; per misurare l&#39;angolo β tra la linea e la direzione EF orizzontale. </li><li> Ripetere 6.3.2 per raccogliere β da almeno 50 cellule di tre esperimenti indipendenti, e calcolare il coseno media β con errore standard della media (SEM). </li><li> Ripetere 6.3.1-6.3.3 per ogni condizione sperimentale. NOTA: A cos β di +1 indica che tutte le celle siano allineati in parallelo alla applicata EF, e un valore 0 indica che tutte le cellule siano allineati perpendicularly al applicata EF. </li></ol></li></ol>

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<li>Chen, J. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+gene+expression+in+invasion+by+a+lung+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model.</a> Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).</li>
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<li>Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbulent+fluid+shear+stress+induces+vascular+endothelial+cell+turnover+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).</li>
<li>Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+process+stress+on+suspended+anchorage-dependent+mammalian+cells+as+an+indicator+of+likely+challenges+for+regenerative+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines.</a> Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).</li>
<li>Chin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cells+under+different+pulsatile+shear+stresses+and+glucose+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations.</a> Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).</li>
<li>Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+oral+squamous+cell+carcinoma+cells+in+a+multiple-electric-field+chip+with+uniform+flow+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field.</a> Biomicrofluidics. 6, 34116(2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

chip PMMA-based sono fabbricati con ablazione laser e la scrittura, che sono metodi meno costosi e più facili rispetto ai chip PDMS-based che richiedono più complicato litografia soft. Dopo aver progettato un chip microfluidica, la fabbricazione e l&#39;assemblaggio può essere fatto nel giro di 5 minuti. Ci sono alcuni passaggi critici che l&#39;attenzione dovrebbe essere prestata alla nello svolgimento dell&#39;esperimento. Il primo è la questione &quot;assemblaggio&quot;. Gli adattatori devono essere incollati corrett...

In cellule in vivo sono circondate da una varietà di biomolecole compreso matrice extracellulare (ECM), carboidrati, lipidi, e altre cellule. Essi funzionalizzare rispondendo agli stimoli micro-ambientali quali le interazioni con ECM e le risposte alle gradienti chimici di vari fattori di crescita. Tradizionalmente, studi cellulare in vitro sono condotti in piatti di coltura di cellule in cui il consumo di cellule e reagenti è grande e le cellule crescono in modo statico (non circolanti) ambiente. Recentemente, dispositivi micro-fabbricato integrati con componenti fluidici hanno fornito una piattaforma alternativa a studi su cellule in un modo più controllabile. Tali dispositivi sono in grado di creare una precisa microambiente di stimoli chimici e fisici riducendo al minimo il consumo di cellule e reagenti. Questi chip microfluidici possono essere fatte di substrati di vetro, silicio, polidimetilsilossano polimeri (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA) substrati, o polyethylenetereftalato (PET) substrati 1-3. dispositivi PDMS basati sono trasparenti, biocompatibili, e permeabile ai gas, che li rende adatti per colture cellulari a lungo termine e studi. substrati PMMA e PET sono economici e facili da lavorare con ablazione laser e la scrittura. dispositivi microfluidici dovrebbero fornire cellule con un micro-ambiente stabile e controllabile in cui le cellule sono soggette a differenti stimoli chimici e fisici. Ad esempio, i chip microfluidici sono utilizzati per studiare chemiotassi di cellule. Invece di metodi tradizionali che impiegano camera di Boyden e capillare di 4,5 questi dispositivi fluidici miniaturizzati in grado di generare precise gradienti chimici per lo studio dei comportamenti cellule &#39;1,6,7. Un altro esempio è quello di studiare la migrazione direzionale cellule &#39;in campi elettrici (EFS), un fenomeno chiamato electrotaxis. Comportamenti Electrotactic di cellule sono stati segnalati per essere collegato con la rigenerazione dei nervi 8, lo sviluppo embrionale 9,e ferita guarigione 10,11. E molti studi sono stati condotti per indagare il electrotaxis di vari tipi di cellule, tra cui le cellule tumorali 12,13, i linfociti 14,15, cellule leucemiche 11, e cellule staminali 16. Convenzionalmente, capsule di Petri e bicchieri di copertura sono utilizzati per la costruzione di camere di electrotactic per la generazione di EF 17. Tali configurazioni semplici pongono problemi di media evaporazione e EF imprecise, ma possono essere superati dai dispositivi microfluidici di canali fluidici chiuso, ben definiti 12,18,19. Per studiare sistematicamente risposte cellulari sotto precise stimoli chimici ed elettrici controllabili,, sarebbe di grande utilità per sviluppare dispositivi microfluidici grado di fornire cellule con stimoli multipli contemporaneamente. Ad esempio, Li et al. riferito un dispositivo microfluidica PDMS-based per la creazione di una o coesistenti gradienti chimici ed EFS 20. Kao et al. devfuggì un chip microfluidica simile a modulare la chemiotassi delle cellule tumorali del polmone da EF 6. Inoltre, per aumentare la produttività, Hou et al. progettato e fabbricato un chip multicanale-dual-campo elettrico PMMA per poter fornire le cellule con 8 diversi stimoli combinati, (concentrazioni 2 punti di forza EF x 4 chimici) essendo 21. Per aumentare ulteriormente il tutto e aggiungere lo stimolo sforzo di taglio, abbiamo sviluppato due dispositivi microfluidici PMMA-based per studiare le risposte cellulari sotto chimici singola o coesistenti / stimoli di stress / taglio elettrici. Segnalato da Lo et al. 22,23, questi dispositivi contengono cinque canali di coltura cellulare indipendenti soggetti a continuo fluido che scorre, imitando il sistema circolatorio in vivo. Nel primo chip (chip chimico-shear stress o il chip CSS), cinque concentrazioni relative di 0, 1/8, 1/2, 7/8 e 1 sono generati nelle regioni di coltura, e un gradiente di sforzo di taglio è produced all&#39;interno di ciascuno dei cinque aree culturali. Nella seconda piastrina (chip chimico-elettrico campo o il chip CEF), utilizzando un&#39;unica serie di elettrodi e 2 pompe a siringa, cinque resistenze EF si generano in aggiunta a cinque diverse concentrazioni chimiche all&#39;interno di queste aree di coltura. calcoli numerici e simulazioni sono eseguite per una migliore progettazione e funzionano questi chip, e cellule tumorali coltivate all&#39;interno di questi dispositivi sono soggetti a stimoli singoli o coesistenti per osservare le loro risposte rispetto alla produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS), il tasso di migrazione, e la direzione di migrazione. Questi chip sono dimostrati di essere risparmio di tempo,-throughput elevato e dispositivi affidabili per indagare come le cellule rispondono a stimoli diversi micro-ambientali.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>staccare la cellula dalla piastra</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>10 cm piastra di Petri per colture cellulari</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Bright-Line&nbsp; Ematocitometro</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td>Cell Count Equipment</td></tr><tr><td>PMMA</td><td>Adattatore</td> per <td>chip microfluidico</td><td>personalizzato</td></tr> personalizzato <tr><td>Chip</td><td>microfluidico</td><td>personalizzato personalizzato</td><td></td></tr><tr><td>0,07/0,22 mm nastro biadesivo</td><td>3M</td><td>8018/9088</td><td>Chip microfluidico</td></tr><tr><td>Basso punto di fusione agarosio</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>Ponte salino</td></tr><tr><td>2'-7'-diclorodiidrofluorescenza diacetato</td><td>Sigma</td><td>D6883</td><td>Misurazione intracellulare dei ROS</td></tr><tr><td>Vetro di ossido di indio e stagno (ITO)</td><td>Merck</td><td>300739</td><td>Riscaldatore Controllore</td></tr><tr><td>proporzionale-integrale-derivativo&nbsp;</td><td>JETEC Electronics Co.</td><td>TTM-J4-R-AB</td><td>Regolatore</td></tr><tr><td>di temperatura Accoppiatore termico</td><td>TECPEL</td><td>TPK-02A</td><td>Regolatore di temperatura</td></tr><tr><td>CO2 tracciatore laser</td><td>Strumenti laser & Technics Corp.</td><td>ILS2</td><td>Fabbricazione di chip microfluidici</td></tr><tr><td>Pompe a siringa</td><td>New Era</td><td>NE-300</td><td>Mezzo di pompaggio e sostanze chimiche nel chip</td></tr><tr><td>Alimentazione</td><td>Scienza principale</td><td>MP-300V</td><td>Alimentazione di correnti continue</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Monitoraggio della migrazione cellulare</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza invertito</td><td>Nikon</td><td>TS-100</td><td>Monitoraggio della migrazione cellulare e dei segnali di fluorescenza</td></tr><tr><td>Fotocamera DSLR</td><td>Canon</td><td>60D</td><td>Registrazione di immagini in campo chiaro&nbsp;</td></tr><tr><td>Fotocamera CCD</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi1</td><td>Registrazione di immagini fluorescenti&nbsp;</td></tr><tr><td>super colla</td><td>3M Scotch</td><td>7004</td><td>Fissaggio di adattatori a substrati PMMA</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk Inc.</td><td></td><td>Progettazione di chip microfluidici</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Dissoluzione DCFDA</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>Quantificazione delle intensità fluorescenti e della migrazione cellulare</td></tr></tbody></table>

progettazione di dispositivi microfluidici per lo studio risposte cellulare in singolo o coesistenza chimico / elettrico / shear stress stimoli

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

dispositivi microfluidici sono capaci di creare una precisa e controllabile cellulare microambiente di pH, temperatura, concentrazione salina, e altri stimoli fisici o chimici. Essi sono stati comunemente utilizzati per studi cellulari in vitro, fornendo in vivo come i dintorni. In particolare, come le cellule di risposta a gradienti chimici, campi elettrici, e sforzi di taglio ha attirato molti interessi in quanto questi fenomeni sono importanti per comprendere le proprietà e funzioni cellulari. Questi chip microfluidici possono essere fatte di substrati di vetro, silicio, polimeri polidimetilsilossano (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA), substrati o substrati di polietilentereftalato (PET). Di questi materiali, substrati PMMA sono economici e possono essere facilmente trattati con ablazione laser e la scrittura. Anche se alcuni dispositivi microfluidici sono stati progettati e fabbricati per la generazione multipla, coesistenti stimoli elettrici e chimici, nessuno di loro è stato consideratosufficientemente efficace nel ridurre le ripetizioni sperimentali, particolari a fini di screening. In questo rapporto, descriviamo la nostra progettazione e fabbricazione di due chip microfluidica PMMA-based per indagare le risposte cellulari, per la produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno e la migrazione, sotto chimici / stimoli di stress / shear elettrici singoli o coesistenti. Il primo chip genera cinque concentrazioni relative di 0, 1/8, 1/2, 7/8 e 1 nelle regioni di coltura, insieme con un gradiente di sforzo di taglio prodotta all&#39;interno di ciascuna di queste aree. Il secondo chip genera le stesse concentrazioni relativi, ma con cinque diversi punti di forza del campo elettrico creato all&#39;interno di ogni area culturale. Questi dispositivi non solo forniscono le cellule con un preciso, controllabile micro-ambiente, ma anche di aumentare notevolmente il throughput sperimentale.

Il stress chimico-taglio (CSS) Chip Il chip CSS è costituito da tre lastre in PMMA, ciascuno di 1 mm di spessore, collegati tra loro tramite due nastri biadesivi, ciascuno dello spessore 0,07 millimetri (Figura 1A e 1B). La struttura &quot;ad albero di Natale&quot; genera cinque concentrazioni relative di 0, 1/8, 1/2, 7/8, e 1 nelle cinque aree culturali. Progettando l&#39;area cultura come un...

I dispositivi microfabbricati integrati con componenti fluidici forniscono una piattaforma in vitro per studi cellulari che imitano il microambiente in vivo. Abbiamo sviluppato chip microfluidici a base di polimetilmetacrilato per lo studio delle risposte cellulari sotto stimoli di stress chimico/elettrico/di taglio singoli o coesistenti.

Progettazione di dispositivi microfluidici per lo studio Risposte cellulare in singolo o Coesistenza chimico / elettrico / Shear stress stimoli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Lo scopo generale di questa procedura è progettare e realizzare dispositivi microfluidici per osservare come le cellule rispondono a stimoli ambientali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in biologia cellulare e ingegneria biomedica, ad esempio come le cellule reagiscono a diversi stimoli ambientali, tra cui sostanze chimiche, sollecitazioni di taglio ed effetti di campo elettrico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i tubi possono essere facilmente realizzati e assemblati. Inoltre, questi dispositivi microfluidici possono riprodurre condizioni in vivo con capacità eccezionali. A dimostrare la procedura saranno Tzu-Yuan Chou, uno studente universitario del mio laboratorio, e Hsien-San Hou, un ricercatore post-dottorato del laboratorio del Dott. Julian Chung. Per iniziare, accendere lo sgorbiatore laser al biossido di carbonio e verificare la sua connessione al computer. Successivamente, caricare un modello pre-disegnato a forma di albero di Natale, simile a uno dei modelli mostrati qui, nello sgorbiatore. Poi, posizionare un foglio di PMMA o un pezzo di nastro adesivo doppia faccia sulla piattaforma dello sgorbiatore. Regolare il fuoco del laser al biossido di carbonio utilizzando la barra di calibrazione e il laser visibile all’elio-neon. Quindi, incidere il modello sul substrato. Al termine, prendere il substrato con il modello, rimuovere le parti indesiderate e utilizzare un flusso di azoto per pulire la superficie da eventuali detriti residui. Ripetere questo processo per ogni componente del chip. Assemblare il chip microfluidico per stimoli chimici e di taglio. A tale scopo, unire tre fogli di PMMA con il modello per stimoli chimici e di taglio utilizzando due pezzi di nastro adesivo inciso doppia faccia. Usare colla cianoacrilica per fissare degli adattatori in acrilico con filettature al centro allo strato superiore di PMMA del chip, allineando filettature e fori. Questi adattatori fungeranno da ingressi/uscite per il mezzo e da connettori per i ponti salini. Aggiungere quindi un ulteriore pezzo di nastro adesivo doppia faccia spesso 0,7 mm alla base del chip e fissare il chip a una piastra di Petri di diametro 10 cm. Una volta assemblato, inserire il chip in una camera a vuoto per tutta la notte. Ora assemblare il chip per campo chimico-elettrico. Fissare il foglio di PMMA inciso per il chip chimico-elettrico con nastro adesivo doppia faccia a una piastra di Petri di diametro 10 cm. Prima di utilizzare i chip, esporli a raggi UV per 30 minuti per sterilizzarli. Successivamente, collegare gli ingressi dei chip a siringhe da 3 ml riempite di PBS mediante tubi di plastica e raccordi a vite a tenuta manuale. Allo stesso modo, collegare le uscite a un tubo di scarico. Premere lentamente lo stantuffo della siringa per riempire i canali fluidici con PBS. Muovere avanti e indietro la siringa per rimuovere le bolle d’aria, quindi inserire i chip nell’incubatrice per tutta la notte. Per configurare i chip chimico-elettrici, riempire i raccordi tubolari con agarosio al 3% per creare i ponti salini. Successivamente, inserire gli elettrodi in argento/cloruro di argento nei raccordi tubolari. Coltivare cellule di carcinoma polmonare CL1-5 in D-MEM integrato con FBS al 10% fino al raggiungimento di una confluenza del 90%. Quindi aspirare il mezzo. Lavare le cellule una volta con PBS preriscaldato. Aggiungere 2 ml di soluzione tampone di tripsina allo 0,5% a una piastra di diametro 10 cm. Riposizionare le cellule a 37

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Progettazione di dispositivi microfluidici per lo studio Risposte cellulare in singolo o Coesistenza chimico / elettrico / Shear stress stimoli (Video) | JoVE Journal

Progettazione di dispositivi microfluidici per lo studio Risposte cellulare in singolo o Coesistenza chimico / elettrico / Shear stress stimoli

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