Progettazione di dispositivi microfluidici per lo studio Risposte cellulare in singolo o Coesistenza chimico / elettrico / Shear stress stimoli
13 agosto 2016
I dispositivi microfabbricati integrati con componenti fluidici forniscono una piattaforma in vitro per studi cellulari che imitano il microambiente in vivo. Abbiamo sviluppato chip microfluidici a base di polimetilmetacrilato per lo studio delle risposte cellulari sotto stimoli di stress chimico/elettrico/di taglio singoli o coesistenti.
Lo scopo generale di questa procedura è progettare e realizzare dispositivi microfluidici per osservare come le cellule rispondono a stimoli ambientali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in biologia cellulare e ingegneria biomedica, ad esempio come le cellule reagiscono a diversi stimoli ambientali, tra cui sostanze chimiche, sollecitazioni di taglio ed effetti di campo elettrico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i tubi possono essere facilmente realizzati e assemblati. Inoltre, questi dispositivi microfluidici possono riprodurre condizioni in vivo con capacità eccezionali. A dimostrare la procedura saranno Tzu-Yuan Chou, uno studente universitario del mio laboratorio, e Hsien-San Hou, un ricercatore post-dottorato del laboratorio del Dott. Julian Chung. Per iniziare, accendere lo sgorbiatore laser al biossido di carbonio e verificare la sua connessione al computer. Successivamente, caricare un modello pre-disegnato a forma di albero di Natale, simile a uno dei modelli mostrati qui, nello sgorbiatore. Poi, posizionare un foglio di PMMA o un pezzo di nastro adesivo doppia faccia sulla piattaforma dello sgorbiatore. Regolare il fuoco del laser al biossido di carbonio utilizzando la barra di calibrazione e il laser visibile all’elio-neon. Quindi, incidere il modello sul substrato. Al termine, prendere il substrato con il modello, rimuovere le parti indesiderate e utilizzare un flusso di azoto per pulire la superficie da eventuali detriti residui. Ripetere questo processo per ogni componente del chip. Assemblare il chip microfluidico per stimoli chimici e di taglio. A tale scopo, unire tre fogli di PMMA con il modello per stimoli chimici e di taglio utilizzando due pezzi di nastro adesivo inciso doppia faccia. Usare colla cianoacrilica per fissare degli adattatori in acrilico con filettature al centro allo strato superiore di PMMA del chip, allineando filettature e fori. Questi adattatori fungeranno da ingressi/uscite per il mezzo e da connettori per i ponti salini. Aggiungere quindi un ulteriore pezzo di nastro adesivo doppia faccia spesso 0,7 mm alla base del chip e fissare il chip a una piastra di Petri di diametro 10 cm. Una volta assemblato, inserire il chip in una camera a vuoto per tutta la notte. Ora assemblare il chip per campo chimico-elettrico. Fissare il foglio di PMMA inciso per il chip chimico-elettrico con nastro adesivo doppia faccia a una piastra di Petri di diametro 10 cm. Prima di utilizzare i chip, esporli a raggi UV per 30 minuti per sterilizzarli. Successivamente, collegare gli ingressi dei chip a siringhe da 3 ml riempite di PBS mediante tubi di plastica e raccordi a vite a tenuta manuale. Allo stesso modo, collegare le uscite a un tubo di scarico. Premere lentamente lo stantuffo della siringa per riempire i canali fluidici con PBS. Muovere avanti e indietro la siringa per rimuovere le bolle d’aria, quindi inserire i chip nell’incubatrice per tutta la notte. Per configurare i chip chimico-elettrici, riempire i raccordi tubolari con agarosio al 3% per creare i ponti salini. Successivamente, inserire gli elettrodi in argento/cloruro di argento nei raccordi tubolari. Coltivare cellule di carcinoma polmonare CL1-5 in D-MEM integrato con FBS al 10% fino al raggiungimento di una confluenza del 90%. Quindi aspirare il mezzo. Lavare le cellule una volta con PBS preriscaldato. Aggiungere 2 ml di soluzione tampone di tripsina allo 0,5% a una piastra di diametro 10 cm. Riposizionare le cellule a 37
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Panoramica
Questo studio presenta dispositivi microfabbricati integrati con componenti fluidici che creano una piattaforma in vitro per lo studio delle cellule, riproducendo in modo accurato il micro-ambiente in vivo. La ricerca si concentra su chip microfluidici a base di polimetilmetacrilato progettati per indagare le risposte cellulari a diversi stimoli.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microfluidica
- Biologia cellulare
- Studi in vitro
Sfondo
- I dispositivi microfabbricati migliorano lo studio degli ambienti cellulari.
- I componenti fluidici permettono un controllo preciso delle condizioni sperimentali.
- Comprendere le risposte cellulari è fondamentale per varie applicazioni biologiche.
- Il polimetilmetacrilato è un materiale versatile per applicazioni microfluidiche.
Scopo dello studio
- Sviluppare una piattaforma per lo studio delle risposte cellulari in un ambiente controllato.
- Simulare le condizioni in vivo mediante l'uso della tecnologia microfluidica.
- Studiare gli effetti di stimoli chimici, elettrici e da stress di taglio sulle cellule.
Metodi Utilizzati
- Progettazione e fabbricazione di chip microfluidici utilizzando polimetilmetacrilato.
- Integrazione di componenti fluidici per un controllo sperimentale migliorato.
- Applicazione di diversi stimoli per valutare le risposte cellulari.
- Sperimentazione in vitro per simulare condizioni in vivo.
Risultati principali
- Sviluppo con successo di chip microfluidici per studi cellulari.
- Dimostrata la capacità di controllare efficacemente le condizioni ambientali.
- Osservate risposte cellulari distinte a diversi stimoli.
- Fornite informazioni sulle interazioni tra le cellule e il loro microambiente.
Conclusioni
- La piattaforma microfluidica è uno strumento prezioso per lo studio del comportamento cellulare.
- I risultati contribuiscono alla comprensione delle risposte cellulari in un ambiente controllato.
- Applicazioni future potrebbero includere test farmacologici e modellizzazione delle malattie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Le piattaforme microfluidiche che consentono un controllo preciso sugli stimoli chimici, elettrici e da stress di taglio offrono alla ricerca e sviluppo biofarmaceutica un approccio scalabile per ridurre i rischi nella validazione degli obiettivi, mimando microambienti complessi in vivo. Questi dispositivi basati su PMMA aumentano la produttività sperimentale per lo screening delle risposte cellulari in presenza contemporanea di stimoli, favorendo approfondimenti meccanicistici nelle fasi iniziali della scoperta. La tecnologia aiuta a prioritizzare bersagli con maggiore affidabilità predittiva prima di impegnare risorse nell'identificazione dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle risposte cellulari a gradienti chimici, campi elettrici e stress di taglio, chiarificando il coinvolgimento delle vie nei meccanismi delle malattie.
- Valore operativo: I substrati in PMMA permettono una fabbricazione economica e rapida mediante ablazione laser, supportando un design iterativo nella verifica delle ipotesi mirate.
- Valore predittivo: Quantifica la produzione di specie reattive dell'ossigeno e la migrazione cellulare in risposta a stimoli definiti, fornendo letture funzionali per la riduzione del rischio associato al target.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera cinque gradienti di concentrazione con gradienti simultanei di stress di taglio o di campo elettrico, consentendo uno screening multiparametrico in un singolo dispositivo.
- Valore operativo: Riduce la necessità di ripetere esperimenti integrando molteplici condizioni di stimolo, migliorando l'efficienza del saggio nello screening di librerie di composti o di siRNA.
- Scalabilità: Compatibile con flussi di lavoro standard di microscopia e incubazione, facilitando l'adozione in cascami di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Utilizza cellule tumorali polmonari CL1-5 come modello rilevante per lo studio di fenotipi indotti dal microambiente.
- De-risking meccanicistico: Isola il contributo di stimoli chimici, elettrici e meccanici alle risposte cellulari, fornendo indicazioni per strategie di terapia combinata.
- Allineamento preclinico: Parametri ottenuti come migrazione e stress ossidativo si correlano con i tratti distintivi associati a metastasi e invasività.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
I chip microfluidici funzionano come una piattaforma sperimentale per la fase di scoperta, che collega la validazione del bersaglio e lo screening iniziale dei composti attivi fornendo fenotipi cellulari quantitativi e sensibili a stimoli.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su come i segnali del microambiente modulino il comportamento cellulare nei modelli di cancro e di altre malattie.
- Screening: Permette il test parallelo delle risposte cellulari lungo gradienti di concentrazione chimica e stimoli fisici, aumentando la densità di dati per ogni esperimento.
- Analisi: Genera output misurabili, inclusa la rilevazione della ROS basata sulla fluorescenza e parametri di migrazione in time-lapse, per un confronto oggettivo.
- Ricerca traslazionale: Utilizza una linea di cancro polmonare metastatico per collegare le risposte al microambiente a fenotipi di invasività rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: La progettazione basata sul PMMA consente la replicazione tra laboratori e progetti, garantendo una somministrazione costante degli stimoli negli studi di meccanobiologia o farmacologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica consentendo l'applicazione controllata di singoli stimoli o stimoli coesistenti per isolare i contributi delle variabili.
- Valore operativo: Standardizza la somministrazione degli stimoli mediante la generazione riproducibile di gradienti, riducendo la variabilità tra le replicazioni.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale fornendo letture multiparametriche dell'efficacia e della tossicità in condizioni fisiologicamente rilevanti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione degli obiettivi in base al rischio identificando composti in grado di modulare risposte cellulari specifiche per lo stimolo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione di microfluidica, nell'ablazione laser di PMMA e nell'assemblaggio di interfacce fluide.
- Richiede l'accesso a uno scriber al laser CO2, a sterilizzazione UV e a strumenti per l'innesto del fluido come siringhe e tubi.
- Necessita della standardizzazione della semina cellulare, dei tempi di applicazione dello stimolo e della normalizzazione delle letture tra diversi gruppi.
- L'adattamento ad altri tipi cellulari potrebbe richiedere un'ottimizzazione delle dimensioni dei canali e delle portate per mantenere l'integrità dello sforzo di taglio e del gradiente.
- I limiti pratici includono la formazione di bolle durante l'innesto e il delaminamento degli elettrodi in configurazioni con campo elettrico, come indicato nel protocollo.
