Un dispositivo a microfluidi per lo studio più ceppi distinti

L'obiettivo generale del seguente metodo è quello di osservare il comportamento di singole cellule provenienti da diversi ceppi di lievito in condizioni dinamiche identiche. Questo risultato si ottiene realizzando un dispositivo microfluidico a due strati, in cui lo strato inferiore conterrà separatamente ciascuno dei diversi ceppi, mentre lo strato superiore fornirà le condizioni di flusso dinamico in un secondo passaggio. Diversi ceppi di lievito vengono posizionati nei pozzetti e il dispositivo viene chiuso, creando un singolo canale con ceppi multipli separati.

Successivamente, osserviamo le risposte cellulari a variazioni dinamiche del mezzo. Controllando le portate nei due ingressi del canale a Y, i risultati mostrano diverse ceppi sottoposti alle stesse condizioni dinamiche e l'assenza di contaminazione incrociata tra pozzetti. Questo dispositivo microfluidico presenta diversi vantaggi chiave rispetto ad altri sistemi esistenti. Permette l'acquisizione di immagini di ceppi multipli e distinti nelle stesse condizioni dinamiche.

Inoltre, cosa importante, può essere prodotto facilmente in qualsiasi laboratorio senza la necessità di attrezzature speciali. L'origine di questo metodo deriva da una discussione su come seguire le risposte di diversi isolati selvatici di East ai passaggi di privazione di nutrienti. Iniziare disegnando o stampando il layout desiderato dei microcanali in scala.

Successivamente, coprire un vetrino con strati di nastro adesivo trasparente. Per raggiungere l'altezza desiderata del canale, posizionare il disegno del layout su una superficie piana e allineare il vetrino sulla traccia del disegno. A questo punto, tagliare con attenzione il nastro sul vetrino seguendo il layout. Rimuovere il nastro adesivo trasparente da tutte le regioni del vetrino.

Accettare quelli disposti nel microcanale. Posizionare il vetrino in un forno riscaldato a 65 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, pulire delicatamente con etanolo.

Mescolare la base e i componenti indurenti del PDMS secondo le indicazioni del produttore. Versare circa 30 millilitri di miscela di PDMS in una piastra di Petri fino a un'altezza di circa 0,5 centimetri. Depurare il PDMS da eventuali bolle d'aria in vuoto, se necessario.

Immergere il vetrino nella PDMS con il nastro adesivo stampato rivolto verso l'alto. Posizionare il modello dopo la PDMS evita la formazione di bolle d'aria tra il vetrino e il fondo della piastra. Polimerizzare per 48 ore a 65 gradi Celsius, assicurandosi che la piastra sia orizzontale utilizzando un livello a bolla in una nuova piastra di Petri da 90 millimetri. Versare tre millilitri di miscela di PDMS.

Questo passaggio può essere eseguito su uno spin coder, se disponibile. DGAs e incuba come mostrato in precedenza. Ora, taglia delicatamente lo strato di flusso del dispositivo microfluidico alla dimensione desiderata utilizzando un punch per biopsia.

Creare fori per gli ingressi e le uscite nel livello di flusso. Tagliare anche un livello di pozzetti di dimensioni simili dalla seconda piastra di Petri e posizionarlo su un vetro spesso. Far scorrere sopra il layout del disegno.

Quindi, praticare dei pozzetti in corrispondenza dei microcanali del layout utilizzando etanolo, pulire entrambi gli strati di PDMS e un coprioggetto di vetro ed essiccare all'aria. Successivamente, trattare il coprioggetto di vetro e lo strato di PDMS con i pozzetti con un etcher al plasma standard per un legame non reversibile oppure con un corona treater portatile per un legame reversibile. Posizionare con attenzione lo strato con i pozzetti sopra il coprioggetto in modo da ottenere l'adesione.

Rimuovere delicatamente eventuali bolle d'aria. Preparare il mezzo desiderato in siringhe adeguate e collegarlo al tubo tigon inserito in una pompa per siringhe. Per l'acquisizione di immagini cellulari.

Utilizzare le concentrazioni appropriate. Recarsi alla fase desiderata, vortexare accuratamente la coltura e trasferire 300 microlitri in provette da microcentrifuga. Posizionare delicatamente un microlitro di con canna A in ciascun pozzetto dello strato in PDMS.

Lavare due volte l'eccesso di conna A da ogni pozzetto pipettando delicatamente acqua mentre il con in A si asciuga. Lavare i ceppi due volte con 300 microlitri di mezzo SC privo di glucosio. L'eliminazione del glucosio residuo dalle pareti cellulari favorisce un adeguato attaccamento al conval.

Dopo aver agitato con il vortex, pipettare accuratamente circa 0,5 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto. Lavare delicatamente con mezzo ricco per rimuovere le cellule residue. I prossimi due passaggi devono essere eseguiti rapidamente per evitare che le cellule si secchino.

Come passaggio facoltativo, trattare il chip e le pozzette avendo cura di non colpire direttamente le pozzette. Quindi, sotto uno stereomicroscopio, posizionare con attenzione il chip sulle pozzette prestando particolare attenzione all'allineamento tra i due elementi. Premere delicatamente per far aderire i due strati di PDMS.

Riempire lentamente il dispositivo completamente con circa 50 microlitri di mezzo ricco, assicurandosi che all'interno del canale non rimangano bolle d'aria. Collegare ora il dispositivo inserendo i tubi negli ingressi appropriati e avviare il flusso del mezzo. Prestare attenzione a non formare bolle d'aria nei tubi, poiché queste potrebbero rimanere intrappolate nel dispositivo e interrompere il flusso.

Procedere posizionando il dispositivo sotto un microscopio e individuare i punti di acquisizione appropriati in ciascuno. Mantenere le cellule in un flusso abbondante di mezzo per un'ora o più, se necessario, per consentire il recupero.

Avviare l'esperimento con impostazione di flusso costante. Impostare la pompa A a 0,8 millilitri all'ora e la pompa B a 0,2 millilitri all'ora. Per il mezzo che scorre su oltre l'80% della larghezza del canale.

Possiamo modificare dinamicamente le condizioni nel dispositivo variando le portate relative. Le nuove condizioni si stabilizzano in pochi secondi lungo l'intero canale. Per dimostrare la separazione tra ceppi diversi, due ceppi distinguibili di lievito vengono visualizzati in pozzetti alternati.

Si noti che non vi è fuoriuscita cellulare tra pozzetti in questo esperimento. Entrambi i ceppi possiedono il fattore di trascrizione MSN due marcato con YFP per verificare l'effetto simultaneo di condizioni in continua variazione. Le portate nei due canali di ingresso sono state modificate per creare un passaggio a mezzo privo di glucosio.

Ciò ha portato alla localizzazione della MSN due nel nucleo. In modo importante, è possibile analizzare la traccia temporale dei livelli di MSN due-YFP nel nucleo in singole cellule. Pertanto, il dispositivo microfluidico in PDMS può essere utilizzato per applicare condizioni dinamiche simultanee a più pozzetti.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di non far seccare le cellule durante il montaggio del dispositivo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita facilmente senza la necessità di litografia morbida.