Un dispositivo a microfluidi per lo studio più ceppi distinti

L'obiettivo generale del seguente metodo è quello di visualizzare il comportamento di singole cellule di diversi ceppi di lievito nelle stesse condizioni dinamiche. Ciò si ottiene fabbricando un dispositivo microfluidico a due strati, oppure lo strato inferiore conterrà ciascuna delle diverse deformazioni separatamente e lo strato superiore fornirà le condizioni di flusso dinamico come secondo passaggio. Diversi ceppi di lievito vengono posti nei pozzetti e il dispositivo viene chiuso, creando un unico canale con più ceppi separati.

Successivamente, immaginiamo le risposte delle celle ai cambiamenti dinamici del mezzo Controllando le velocità di flusso nei due ingressi del canale Y, i risultati mostrano ceppi diversi soggetti alle stesse condizioni dinamiche e nessuna contaminazione incrociata tra i pozzetti. Questo dispositivo microfluidico presenta diversi vantaggi chiave rispetto ad altri sistemi esistenti. Consente di visualizzare più deformazioni distinte nelle stesse condizioni dinamiche.

Inoltre, cosa importante, può essere prodotto facilmente in qualsiasi laboratorio senza bisogno di attrezzature speciali. Il Di questo metodo è nato dalla discussione su come seguire le risposte di diversi isolati selvaggi orientali ai passaggi di fame. Avvia, disegna o stampa il layout a microcanali desiderato per scalarlo.

Quindi, coprire un vetrino con strati di nastro adesivo Per ottenere l'altezza desiderata del canale, posizionare il disegno del layout su una superficie piana e allineare il vetrino sul modello di disegno. Ora taglia con cura il nastro sul vetrino in base al layout. Rimuovere lo scotch da tutte le regioni del vetrino.

Accetta quelli nel layout del micro canale. Mettere il vetrino in un forno a 65 gradi Celsius per tre minuti. Quindi pulire delicatamente con etanolo.

Miscelare la base e i componenti di polimerizzazione del PDMS come raccomandato dal produttore. Versare circa 30 millilitri di miscela PDMS in una capsula di Petri ad un'altezza di circa 0,5 centimetri. Degassare il PDMS nel vuoto, se necessario.

Immergere il vetrino nel PDMS con lo scotch modellato rivolto verso l'alto. Posizionando il modello dopo il PDMS si evita la formazione di bolle d'aria tra il vetrino e la piastra Bottom Polimerizzare per 48 ore a 65 gradi Celsius, assicurandosi che la piastra sia orizzontale utilizzando una livella a bolla in una nuova piastra Petri da 90 millimetri. Versare tre millilitri di miscela PDMS.

Questo passaggio può essere eseguito su uno spin coder, se disponibile. DGA e cura come mostrato in precedenza. Ora ritagliare delicatamente lo strato di flusso del dispositivo microfluidico alla dimensione desiderata con un perforatore per biopsia.

Creare fori per gli ingressi e le uscite nello strato di flusso. Ritagliare anche uno strato di pozzetti di dimensioni simili dalla seconda capsula di Petri e posizionarlo su un bicchiere spesso. Scorri sul layout del design.

Quindi perforare i pozzetti in allineamento con i microcanali sul layout utilizzando etanolo, pulire entrambi gli strati PDMS e un vetrino di copertura in vetro e asciugare all'aria. Successivamente, trattare il vetrino coprioggetto e il PDMS dello strato di pozzetti con un incisore al plasma standard per un incollaggio non reversibile o con un trattamento corona portatile per un incollaggio reversibile. Posizionare con cura lo strato di pozzetti sopra il vetrino coprioggetti per provocarne l'adesione.

Strofinando delicatamente eventuali bolle d'aria. Preparare il terreno desiderato in siringhe appropriate e collegarlo al tubo tigon filettato attraverso una pompa a siringa. Per l'imaging cellulare.

Usa i punti di forza. Passare alla fase desiderata, Vortex accuratamente la coltura e trasferire 300 microlitri in provette da microcentrifuga. Posizionare delicatamente un microlitro di con canna A in ogni pozzetto dello strato di pozzetti PDMS.

Lavare due volte il conna A in eccesso da ciascun pozzetto pipettando delicatamente l'acqua mentre il conna in A si sta asciugando. Lavare i ceppi due volte con 300 microlitri di terreno SC privo di glucosio. Il lavaggio del glucosio residuo dalle pareti cellulari aiuta la corretta aderenza al conval.

In un dopo vortice, le cellule pipettano accuratamente circa 0,5 microlitri della sospensione cellulare in singoli pozzetti. Lavare delicatamente le cellule residue con un terreno ricco. I due passaggi successivi devono essere eseguiti rapidamente per evitare che le cellule si secchino.

Come fase opzionale del plasma, trattare il chip e i pozzetti facendo attenzione a non colpire direttamente i pozzi. Quindi, sotto uno stereoscopio, posizionare con cura il chip sui pozzetti prestando molta attenzione all'allineamento tra i due. Premere delicatamente per far aderire i due strati di PDMS.

Riempire lentamente il dispositivo completamente con circa 50 microlitri di terreno ricco, assicurandosi che non rimangano bolle d'aria all'interno del canale. Collegare ora il dispositivo inserendo i tubi negli appositi ingressi e avviare il flusso del fluido. Fare attenzione che non si formino bolle d'aria nel tubo in quanto possono rimanere bloccate nel dispositivo e distruggere il flusso.

Procedere con il posizionamento del dispositivo sotto un microscopio e trovare i punti di imaging appropriati in ciascuno di essi. Mantenere bene le celle sotto un flusso ricco e medio per un'ora o più a lungo, se necessario. Per consentire il recupero.

Avviare l'esperimento con l'impostazione del flusso costante. Pompa A a 0,8 millilitri all'ora e pompa B a 0,2 millilitri all'ora. Per un flusso medio superiore all'80% della larghezza del canale.

Possiamo modificare dinamicamente le condizioni nel dispositivo modificando le relative portate. Le nuove condizioni si stabilizzano in pochi secondi lungo l'intero canale per dimostrare la separazione tra i diversi ceppi. Due ceppi di lievito distinguibili sono ripresi in pozzetti alternati.

Si noti che in questo esperimento non ci sono perdite di cellule tra i pozzetti. Entrambi i ceppi hanno il fattore di trascrizione MSN two marcato con YFP per testare l'effetto simultaneo di condizioni che cambiano dinamicamente. Le portate nei due canali di ingresso sono state modificate per creare un passaggio senza mezzo glucosio.

Ciò ha portato alla localizzazione di MSN 2 nel nucleo. È importante sottolineare che è possibile analizzare la traccia temporale di due livelli di YFP di MSN nucleare in singole cellule. Pertanto, il dispositivo microfluidico PDMS può essere utilizzato per l'applicazione di condizioni dinamiche simultanee a più pozzi.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non lasciare che le celle si secchino durante l'assemblaggio del dispositivo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita facilmente senza bisogno di litografia morbida.