Name: Un dispositivo a microfluidi per lo studio più ceppi distinti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Scopri un dispositivo microfluidico a due strati per l'imaging simultaneo di ceppi di lievito distinti sotto condizioni dinamiche identiche, senza rischio di contaminazione incrociata.

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YG è sostenuto da una borsa di studio IDB. IN è un tipo Alon e membro della facoltà del J Edmond ‭. ‬ Safra Centro di Bioinformatica dell&#39;Università di Tel Aviv ‭. ‬ Questa ricerca è stata sostenuta da ISF sovvenzione 1499-1410.

1. Creazione di un nastro Scotch-Master 5 <ol><li> Disegna o stampare il layout desiderato microcanali, in scala, su carta. Nel nostro caso il disegno consiste di due canali a forma di Y, larghe 3 mm ciascuna (Figura 2). </li><li> Coprire un vetro scorrevole con strati di nastro adesivo. Il numero di strati determinerà l&#39;altezza del canale (circa 60 micron per strato). Abbiamo usato 3 strati di nastro scotch. </li><li> Posizionare la progettazione del layout su una superficie piana. Allineare il cursore sopra il modello di progettazione. Tagliare con cautela il nastro sul vetrino con un bisturi in base al layout. </li><li> Rimuovere il nastro Scotch da tutte le regioni del vetrino eccetto quelle del layout del microcanale. </li><li> Posizionare il vetrino in un forno di riscaldamento a 65 ° C per 2-3 min. Pulire delicatamente con etanolo. </li></ol> 2. Realizzazione di un dispositivo PDMS Microfluidic <ol><li> Miscelare la base ed indurimento componenti di PDMS come raccomandato dal produttore. Usiamo un 10:01rapporto della base e catalizzatore. Versare circa 30 ml di miscela PDMS in una piastra di Petri ad un&#39;altezza di ~ 0,5 cm. Degassarla PDMS nel vuoto, se necessario. Immergere il vetrino nel PDMS con il nastro adesivo fantasia rivolto verso l&#39;alto. Posizionare il modello dopo il PDMS impedisce la formazione di bolle d&#39;aria tra la slitta e il fondo piatto. Cure per 48 ore a 65 ° C, assicurandosi che il piatto sia orizzontale con una livella a bolla. </li><li> In un piatto nuovo 90 millimetri Petri pour 3 ml di miscela PDMS, risultante in uno strato di circa 0,5 mm di profondità. (Se un rivestitore a rotazione è disponibile, può essere utilizzata per questa fase). </li><li> Degas e cura come in 2.1. </li><li> Delicatamente tagliare il dispositivo microfluidico alla dimensione desiderata con un bisturi. Questo strato viene definito il &quot;livello di flusso&quot;. </li><li> Tagliare un pezzo di dimensioni simili di sottile strato di PDMS dal secondo piatto Petri. Questo sarà definito il &quot;livello pozzi&quot;. </li><li> Utilizzare un puncher di dimensioni adeguate biopsia (Usiamo 1.2 ID mm) a fori di perforazione per le entrate e le uscite nel livello di flusso. </li&gt; <li> Posizionare il livello pozzetti su un vetrino di spessore sul layout design e punch out pozzetti, utilizzando 2 mm ID perforatore biopsia, in allineamento con i microcanali sul formato. </li><li> Pulire entrambi gli strati PDMS nonché coprioggetto da 24 mm x 60 mm con etanolo. Asciugare e pulire. </li><li> Plasma trattare sia il coprioggetto di vetro e dei pozzi strato PDMS utilizzando incisore standard di plasma (per non reversibile legame) o un portatile corona treater 6 per incollaggio reversibile. Appoggiare delicatamente lo strato pozzetti sopra il vetrino per provocare adesione (Figura 3). Strofinare delicatamente le eventuali bolle d&#39;aria (se necessario). </li></ol> 3. Cella Imaging Experiment <ol><li> Assicurarsi di avere il supporto desiderato pronto in siringhe adeguate collegati a tubi flessibili di plastica con diametro interno da 0,02 &quot;(Tygon) nella pompa a siringa. </li><li> Grow S. cerevisiae alla fase desiderata in YPD liquido. Vortex accuratamente e posto 300 μl di ciascun ceppo in una provetta da microcentrifuga. </li><li> Posizionare delicatamente 1 ml di Concanavalina A (Sigma) 2 mg / ml in ciascun pozzetto. Lavare Concanavalina eccesso A di ogni ben due volte pipettando gentilmente acqua. </li><li> Mentre il Concanavalina A sta asciugando, lavare i ceppi volte con 300 ml di mezzo privo di glucosio SC. Lavaggio glucosio residuo dalle pareti cellulari aiuta l&#39;adesione adeguata alla Concanavalina A. </li><li> Cellule Vortex accuratamente. Pipettare 0,75 microlitri o meno di ciascuna sospensione cellulare in proprio pozzo (Figura 3). Lavare delicatamente le cellule residue con terreno ricco. I due passaggi successivi devono essere eseguiti rapidamente per impedire alle cellule di essiccazione. </li><li> Plasma trattare il chip e i pozzi accuratamente con l&#39;hand-held trattamento corona, facendo attenzione a non colpire i pozzi direttamente. Cura il chip sulla pozzi, prestando particolare attenzione all&#39;allineamento tra i due (questo passaggio può essere fatto sotto uno stereoscopio). Premere delicatamente per aderire i due strati di PDMS. Lentamente riempire completamente il dispositivo con circa 50 microlitri media ricca, prestando attenzione a non bolle d&#39;aria rimangono all&#39;interno del canale. </li><li> Collegare il dispositivo, inserire i tubi negli ingressi appropriati e avviare il flusso dei media. Evitare che le bolle d&#39;aria vengono introdotti nel dispositivo come questi possono essere difficili da rimuovere, che può essere compiuta da scollegare un ingresso o di uscita e picchiettando leggermente sul dispositivo in cui le bolle sono, facendo attenzione a non rompere il vetrino coprioggetti. </li><li> Mettere al microscopio e trovare punti di imaging appropriate in ciascun pozzetto. </li><li> Conservare le cellule sotto ricco flusso medio per 1 ora o più a lungo per consentire il ripristino in caso di necessità. </li><li> Iniziare l&#39;esperimento: usiamo flusso costante da ciascuna delle due pompe a siringa per impedire il riflusso dei media, cambiando portate relativi come desiderato. Impostazione pompa A e 0,8 ml / hr e B pompa a 0,2 ml / hr risultati in medium A scorre oltre l&#39;80% della larghezza del canale (Figura 4). Questo può essere dinamicamente cimpiccato modificando le due portate. Le nuove condizioni stabilizzare pochi secondi lungo l&#39;intera lunghezza del canale 2. </li></ol>

<ol><li>Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+substrate-bound+laminin+orient+axonal+specification+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).</li>
<li>Paliwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446, 46-51 (2007).</li>
<li>Bennett, M. R., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+measuring+gene+network+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).</li>
<li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Microfluidic+Devices+by+Replicating+Scotch-tape+Masters%5BTitle%5D)+AND+%22Chips+%26+Tips%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters.</a> Chips & Tips. , (2010).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo presentiamo un metodo semplice da banco per la creazione di un dispositivo a microfluidi che consente i seguenti ceppi di lievito contemporaneamente in condizioni dinamiche. Seguendo diversi ceppi in un canale fornisce uno strumento affidabile per il confronto dinamica di risposte di cellule singole in più ceppi. Un vantaggio del nostro approccio è la capacità di fabbricare il dispositivo con tecniche semplici senza la necessità di una camera pulita. In realtà, abbiamo anche svolto il protocollo salta...

Le cellule sono costantemente reagire ad un ambiente in perpetuo cambiamento, cambiando il loro metabolismo, profilo trascrizionale e funzioni cellulari. Per studiare questi fenomeni, metodi che possono quantificare tali cambiamenti sono necessari. Un tipo di lettura di queste risposte è il cambiamento di localizzazione di fattori di trascrizione riferiti sforzo in risposta a stress nutrizionale. Dispositivi microfluidici 1 sono stati usati per manipolare dinamicamente condizioni ambientali alle cellule 2-4. Essi presentano diversi vantaggi per l&#39;imaging cellulare dal vivo: l&#39;ambiente delle cellule può essere controllato con precisione e dinamicamente cambiato, le cellule possono essere vivo con immagini in qualsiasi momento, anche durante la manipolazione delle condizioni esterne, e volumi di reagente minimi sono obbligatori. Un disegno molto semplice per un dispositivo microfluidico, consentendo alternanza tra due condizioni, è un dispositivo a forma di Y 2. Noi abitualmente uso dispositivi microfluidici a Y che consentonoapplicazione di variazioni dinamiche delle cellule nel canale. Usiamo questo dispositivo per seguire i cambiamenti di localizzazione di etichettati con colori fluorescenti fattori di trascrizione di stress correlati in cellule di lievito. Seguiamo questi cambiamenti nutrizionali in condizioni di instabilità. Per esempio, si può fornire un impulso (o una serie di impulsi) di glucosio contenente terreno entro un periodo di non-glucosio medio, ad una buona risoluzione temporale. Spesso in tali esperimenti, si è interessato a confrontare le risposte dei ceppi cellulari diversi (ad esempio, mutanti diversi, o diversi isolati selvatici). Il canale a forma di Y è limitata ad un ceppo in ogni canale - se più di un ceppo viene utilizzato, non esiste un modo semplice per distinguere tra i ceppi. Per ovviare a questo, i canali possono essere usati diversi. Se vogliamo applicare le stesse condizioni dinamiche a più ceppi, vorremmo combinare la Y-canale concetto con più canali. Ci sono due sfide di implementazione di questa soluzione: Può essere difficile da applicare tegli stesse condizioni contemporaneamente a tutti i canali, e vi è una limitazione geometrica al numero di Y canali che possono essere montati in un unico dispositivo. Abbiamo quindi cercando un modo per visualizzare diversi ceppi in un canale in condizioni dinamiche. Qui si descrive un doppio strato dispositivo microfluidico destinato ceppi di imaging diversi canali alle stesse condizioni dinamiche. Lo strato inferiore è costituito da sottili PDMS con una fila di fori. Questo strato è attaccato al coprioggetti creando pozzi in cui si collocano i diversi ceppi, aderendo con concanavalina A al vetro. Il secondo strato è una forma di Y dispositivo microfluidico creato utilizzando il metodo scotch 5. Dopo aver posizionato i ceppi nei pozzetti secondo strato è rapidamente allineato e collegato alla prima, creando un canale con diversi pozzi che contengono i diversi ceppi. Questo dispositivo permette finale dopo diversi ceppi in un canale, dove tutticeppi sono sottoposti alle stesse condizioni al tempo stesso esatto. Tutta la progettazione e processo di produzione può essere fatto sul piano del banco, con mezzi semplici, senza litografia morbida.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> PDMS-SYLGARD 184 </td><td> Dow Corning USA </td><td></td></tr><tr><td> Vuoto essiccatore </td><td> Nalgene </td><td> 5310-0250 </td></tr><tr><td> Biopsia punzoni </td><td> Ted Pella Inc. </td><td> Harris Uni-Core 15.076 (2 mm), 15.074 (1,2 mm) </td></tr><tr><td> Pompe a siringa </td><td> Chemyx </td><td> Fusion 200 </td></tr><tr><td> Corona che cura </td><td> Electro-technic prodotti </td><td> BD-20 </td></tr><tr><td> Tygon tubo </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Concanavalina A- </td><td> Sigma </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> Nastro adesivo </td><td> 3M Scotch </td><td> Nastro trasparente 1/2 &quot; </td></tr></tbody></table>

un dispositivo a microfluidi per lo studio più ceppi distinti

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Lo studio delle risposte delle cellule ai cambiamenti ambientali pone molte sfide sperimentali: cellule hanno bisogno di essere ripreso in condizioni mutevoli, spesso in modo comparativo. Piastre multipozzetto sono abitualmente utilizzati per confrontare molti diversi ceppi o linee cellulari, ma permettono un controllo limitato sulle dinamiche ambiente. Dispositivi microfluidici, invece, consentono squisito controllo dinamico delle condizioni ambientali, ma è difficile da immagine e distinguere più di pochi ceppi in loro. Qui si descrive un metodo per produrre facilmente e rapidamente un dispositivo microfluidico in grado di applicare condizioni mutevoli a più ceppi distinti in un canale. Il dispositivo è progettato e costruito in modo semplice senza la necessità di litografia soft. Esso è composto da un canale a forma di Y flusso attaccato ad un secondo strato harboring micropozzetti. I ceppi sono posti in pozzetti separati, e ripreso nelle esatte condizioni dinamiche. Abbiamo demonstrate l&#39;uso del dispositivo per misurare le risposte di localizzazione della proteina di impulsi di cambiamenti nutrienti in differenti ceppi di lievito.

Per dimostrare la separazione tra i vari ceppi abbiamo ripreso due ceppi di lievito distinguibili in pozzi alternativi. Imaging pieno pozzetti mostra alcuna perdita cellulare tra pozzetti (Figura 5a, b). Entrambi i ceppi hanno il fattore di trascrizione MSN2 etichettato con YFP. Per verificare l&#39;effetto simultaneo di modificare dinamicamente condizioni, abbiamo cambiato le portate nei due canali di ingresso, creando una fase di mezzo di no-glucosio, che ha portato localizzazione di MSN2-YFP al nucle...

Presentiamo un metodo semplice per produrre dispositivi microfluidici capaci di applicare simili condizioni dinamiche a più ceppi distinti, senza la necessità di una stanza pulita o litografia morbida.

Un dispositivo a microfluidi per lo studio più ceppi distinti

Lo studio delle risposte cellulari ai cambiamenti ambientali pone numerose sfide sperimentali: le cellule devono essere imaged in condizioni variabili, spesso in un...

L'obiettivo generale del seguente metodo è quello di osservare il comportamento di singole cellule provenienti da diversi ceppi di lievito in condizioni dinamiche identiche. Questo risultato si ottiene realizzando un dispositivo microfluidico a due strati, in cui lo strato inferiore conterrà separatamente ciascuno dei diversi ceppi, mentre lo strato superiore fornirà le condizioni di flusso dinamico in un secondo passaggio. Diversi ceppi di lievito vengono posizionati nei pozzetti e il dispositivo viene chiuso, creando un singolo canale con ceppi multipli separati.Successivamente, osserviamo le risposte cellulari a variazioni dinamiche del mezzo. Controllando le portate nei due ingressi del canale a Y, i risultati mostrano diverse ceppi sottoposti alle stesse condizioni dinamiche e l'assenza di contaminazione incrociata tra pozzetti. Questo dispositivo microfluidico presenta diversi vantaggi chiave rispetto ad altri sistemi esistenti. Permette l'acquisizione di immagini di ceppi multipli e distinti nelle stesse condizioni dinamiche.Inoltre, cosa importante, può essere prodotto facilmente in qualsiasi laboratorio senza la necessità di attrezzature speciali. L'origine di questo metodo deriva da una discussione su come seguire le risposte di diversi isolati selvatici di East ai passaggi di privazione di nutrienti. Iniziare disegnando o stampando il layout desiderato dei microcanali in scala.Successivamente, coprire un vetrino con strati di nastro adesivo trasparente. Per raggiungere l'altezza desiderata del canale, posizionare il disegno del layout su una superficie piana e allineare il vetrino sulla traccia del disegno. A questo punto, tagliare con attenzione il nastro sul vetrino seguendo il layout. Rimuovere il nastro adesivo trasparente da tutte le regioni del vetrino.Accettare quelli disposti nel microcanale. Posizionare il vetrino in un forno riscaldato a 65 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, pulire delicatamente con etanolo.Mescolare la base e i componenti indurenti del PDMS secondo le indicazioni del produttore. Versare circa 30 millilitri di miscela di PDMS in una piastra di Petri fino a un'altezza di circa 0,5 centimetri. Depurare il PDMS da eventuali bolle d'aria in vuoto, se necessario.Immergere il vetrino nella PDMS con il nastro adesivo stampato rivolto verso l'alto. Posizionare il modello dopo la PDMS evita la formazione di bolle d'aria tra il vetrino e il fondo della piastra. Polimerizzare per 48 ore a 65 gradi Celsius, assicurandosi che la piastra sia orizzontale utilizzando un livello a bolla in una nuova piastra di Petri da 90 millimetri. Versare tre millilitri di miscela di PDMS.Questo passaggio può essere eseguito su uno spin coder, se disponibile. DGAs e incuba come mostrato in precedenza. Ora, taglia delicatamente lo strato di flusso del dispositivo microfluidico alla dimensione desiderata utilizzando un punch per biopsia.Creare fori per gli ingressi e le uscite nel livello di flusso. Tagliare anche un livello di pozzetti di dimensioni simili dalla seconda piastra di Petri e posizionarlo su un vetro spesso. Far scorrere sopra il layout del disegno.Quindi, praticare dei pozzetti in corrispondenza dei microcanali del layout utilizzando etanolo, pulire entrambi gli strati di PDMS e un coprioggetto di vetro ed essiccare all'aria. Successivamente, trattare il coprioggetto di vetro e lo strato di PDMS con i pozzetti con un etcher al plasma standard per un legame non reversibile oppure con un corona treater portatile per un legame reversibile. Posizionare con attenzione lo strato con i pozzetti sopra il coprioggetto in modo da ottenere l'adesione.Rimuovere delicatamente eventuali bolle d'aria. Preparare il mezzo desiderato in siringhe adeguate e collegarlo al tubo tigon inserito in una pompa per siringhe. Per l'acquisizione di immagini cellulari.Utilizzare le concentrazioni appropriate. Recarsi alla fase desiderata, vortexare accuratamente la coltura e trasferire 300 microlitri in provette da microcentrifuga. Posizionare delicatamente un microlitro di con canna A in ciascun pozzetto dello strato in PDMS.Lavare due volte l'eccesso di conna A da ogni pozzetto pipettando delicatamente acqua mentre il con in A si asciuga. Lavare i ceppi due volte con 300 microlitri di mezzo SC privo di glucosio. L'eliminazione del glucosio residuo dalle pareti cellulari favorisce un adeguato attaccamento al conval.Dopo aver agitato con il vortex, pipettare accuratamente circa 0,5 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto. Lavare delicatamente con mezzo ricco per rimuovere le cellule residue. I prossimi due passaggi devono essere eseguiti rapidamente per evitare che le cellule si secchino.Come passaggio facoltativo, trattare il chip e le pozzette avendo cura di non colpire direttamente le pozzette. Quindi, sotto uno stereomicroscopio, posizionare con attenzione il chip sulle pozzette prestando particolare attenzione all'allineamento tra i due elementi. Premere delicatamente per far aderire i due strati di PDMS.Riempire lentamente il dispositivo completamente con circa 50 microlitri di mezzo ricco, assicurandosi che all'interno del canale non rimangano bolle d'aria. Collegare ora il dispositivo inserendo i tubi negli ingressi appropriati e avviare il flusso del mezzo. Prestare attenzione a non formare bolle d'aria nei tubi, poiché queste potrebbero rimanere intrappolate nel dispositivo e interrompere il flusso.Procedere posizionando il dispositivo sotto un microscopio e individuare i punti di acquisizione appropriati in ciascuno. Mantenere le cellule in un flusso abbondante di mezzo per un'ora o più, se necessario, per consentire il recupero.Avviare l'esperimento con impostazione di flusso costante. Impostare la pompa A a 0,8 millilitri all'ora e la pompa B a 0,2 millilitri all'ora. Per il mezzo che scorre su oltre l'80% della larghezza del canale.Possiamo modificare dinamicamente le condizioni nel dispositivo variando le portate relative. Le nuove condizioni si stabilizzano in pochi secondi lungo l'intero canale. Per dimostrare la separazione tra ceppi diversi, due ceppi distinguibili di lievito vengono visualizzati in pozzetti alternati.Si noti che non vi è fuoriuscita cellulare tra pozzetti in questo esperimento. Entrambi i ceppi possiedono il fattore di trascrizione MSN due marcato con YFP per verificare l'effetto simultaneo di condizioni in continua variazione. Le portate nei due canali di ingresso sono state modificate per creare un passaggio a mezzo privo di glucosio.Ciò ha portato alla localizzazione della MSN due nel nucleo. In modo importante, è possibile analizzare la traccia temporale dei livelli di MSN due-YFP nel nucleo in singole cellule. Pertanto, il dispositivo microfluidico in PDMS può essere utilizzato per applicare condizioni dinamiche simultanee a più pozzetti.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di non far seccare le cellule durante il montaggio del dispositivo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita facilmente senza la necessità di litografia morbida.

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