Registrazioni elettrofisiologiche di correnti ioniche a cella singola sotto stress di taglio ben definito

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere una camera di flusso a piastre parallela modificata da utilizzare per studiare l'attivazione in tempo reale dei canali ionici meccanosensibili da sollecitazioni di taglio.

L'uso della camera di flusso della piastra parallela modificata può aiutare i ricercatori a rispondere alle domande chiave relative alla risposta funzionale dei canali ionici meccanosensibili alle sollecitazioni di taglio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'indagine in tempo reale per fluire canali ionici attivati in una camera di flusso della piastra parallela facilmente assemblabile e riutilizzabile. Per iniziare la procedura, applicare un sottile strato di soluzione di elastomero siliconico attorno ai bordi dello spazio rettangolare del pezzo C e posizionare delicatamente il vetro di copertura rettangolare, pezzo D, direttamente sulla soluzione di elastomero per coprire completamente lo spazio rettangolare aperto del pezzo C.Pulire con cura l'eccesso di soluzione di elastomero siliconico.

Quindi, ripetere la procedura per aderire al vetro di copertura rettangolare, pezzo F, sul fondo del pezzo E e lasciare che la soluzione di elastomero siliconico si polimerizza durante la notte a temperatura ambiente. Ora, assemblare la camera di flusso MPP posizionando in sequenza ogni pezzo sopra il precedente, iniziando con la camera inferiore, il pezzo E, quindi il pezzo C, il pezzo B, seguito dal pezzo A sulla parte superiore. Quindi, allineare i fori delle viti di ogni pezzo agli angoli e avvitare strettamente i pezzi insieme per evitare perdite durante la somministrazione del flusso alla camera di flusso MPP.

In una piastra da sei pozzi, posizionare da quattro a cinque, 12 millimetri coprire cerchi di vetro in ogni pozzo. Salvare le celle tra il 10% e il 30% di confluenza, in modo che sia possibile accedere a singole celle per registrazioni elettrofisiopatiche. Successivamente, incubare le cellule in condizioni di coltura standard per non meno di due ore per consentire alle cellule di aderire, e non più di 24 ore, poiché le cellule endoteliali diventeranno piatte e difficili da rattoppare se se sementi a subconfluenza per più di 24 ore.

Quindi, rimuovere un vetro di copertura contenente le cellule aderenti da un pozzo della piastra a sei po 'e risciacquare rapidamente in PBS. Quindi, trasferire il vetro di copertura con le cellule in una piastra di Petri di 35 millimetri contenente due millilitri di soluzione elettrofisiologia BAF. Trasferire immediatamente il vetro di copertura con le celle nella camera di flusso MPP.

Trasferire il cerchio di vetro di copertura nel vetro di copertura rettangolare, pezzo D, che è aderito al pezzo C della camera di flusso MPP. Aggiungere la soluzione BAF per immergere completamente il cerchio di vetro di copertura e le celle. Successivamente, posizionare il cerchio di vetro di copertura sul pezzo D in modo che le celle siano in linea con le aperture delle fessure del pezzo B.Assicurarsi che il cerchio di vetro di copertura aderisca al pezzo D attraverso l'adesione del vetro della soluzione per evitare interruzioni della posizione del cerchio di vetro del coperchio da parte dell'applicazione del flusso.

Quindi, assemblare la camera di flusso MPP avvitando i pezzi nell'ordine appropriato. Trasferire la camera allo stadio del microscopio e perfondere immediatamente la camera con la soluzione BAF. Successivamente, identificare una cellula sana con un bordo scuro e un nucleo ovvio per l'esperimento.

Evitare le celle che sembrano essere sfocate o le celle a contatto con altre celle. Per controllare le sollecitazioni di taglio, impostare un sistema di perfusione gravitazionale collegando un cilindro a siringa graduato da 30 millilitri a una serratura Luer a tre linee dotata di tubi in microbore. Successivamente, attaccare il cilindro graduato alla gabbia di Faraday che circonda il rig di elettrofisiologia utilizzando nastro a doppia parte.

Prima di inserire il tubo nella camera MPP, pre-riempire la siringa e i tubi con soluzione BAF. Quindi, inserire il tubo nel foro di ingresso della camera di flusso MPP del pezzo A.Pre-riempire la camera di flusso MPP con la soluzione, in modo che venga rimosso nel serbatoio del vuoto. Interrompere il flusso verso la camera e riempire il cilindro graduato al primo segno.

Calcola manualmente la portata utilizzando un cronometro consentendo alla soluzione di fluire attraverso la camera ad una determinata altezza del cilindro della siringa. Sollevare o abbassare la siringa per alterare il flusso e calcolare la sollecitazione di taglio in una camera parallela utilizzando questa equazione. Ripetere questo processo fino a trovare un livello desiderato di sollecitazione di taglio.

Successivamente, trasferire una camera assemblata contenente cellule aderenti allo stadio di microscopio del rig di elettrofisiologia. E inserire i tubi, pre-riempiti con soluzione BAF, nel foro del pezzo A.Quindi, riempire la camera e lavare le celle con 10 millilitri di soluzione BAF, contemporaneamente. Una volta ottenuta con successo la configurazione della patch desiderata, consentire alle correnti di canale di stabilizzarsi in un bagno statico a temperatura ambiente.

Non appena le correnti si sono stabilizzate, applicare il taglio in modo step-wise, consentendo alla maggiore corrente di stabilizzarsi prima del passaggio successivo dell'aumento della sollecitazione di taglio. Rimuovere l'esposizione al taglio alle cellule arrestando il flusso verso la camera, consentendo alle correnti di canale meccanosensibili di tornare alle correnti di base osservate nel bagno statico. Qui è mostrata una registrazione grezza rappresentativa della corrente di Kir da una cella endoteliale mesenterica del topo primario con notevole corrente lineare di perdita verso l'esterno.

Una rampa da 140 a 40 millivolt positivi è stata applicata alla patch per oltre 400 millisecondi. La corrente di perdita impedisce l'analisi dell'attività reale del canale Kir. Per sottrarre la corrente di perdita, calcolare innanzitutto la conduzione lineare della pendenza della corrente di perdita.

Pendenza G multipla in base alle tensioni corrispondenti dell'intera traccia grezza per tracciare la corrente di perdita sui dati grezzi. La linea dovrebbe sovrapporre esattamente la perdita lineare verso l'esterno. Quindi, sottrarre la corrente di perdita tracciata dall'intera traccia in modo che la corrente lineare verso l'esterno sia di circa zero picoampere per picofarad, e la corrente kir reale può essere analizzata.

La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è posizionare correttamente il vetro di copertura nella camera in modo che le celle siano accessibili per gli esperimenti. Inoltre, assicurarsi che lo slittamento del coperchio sia adeguatamente aderenti al pezzo D, in modo che il flusso di fluido non interrompa le celle contenenti vetro di copertura.