Name: Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Scopri come sottoporre cellule aderenti a sforzo di taglio laminare usando una camera a piatti paralleli e un circuito a flusso continuo sterile. Questo metodo consente la visualizzazione in tempo reale delle risposte cellulari.

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Gli autori desiderano ringraziare Joe Owen nello strumento Biomediche e Centro di lavorazione per il suo instancabile impegno nella lavorazione e l&#39;assemblaggio delle parti flusso da camera e Matt Maudsley da Leica Microsystems per aiutare nelle tecniche di celle di immagine attraverso camere di flusso. Siamo in debito con Kevin Collins da Servizi perfusione Duke e il dottor Steve Wallace presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica per i suggerimenti utili su progettazione del flusso di circuito. Vorremmo anche ringraziare la National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program per il supporto Alexandra Jantzen e il NIH per il loro sostegno attraverso Grant &quot;rivestimento EPC autologhe per migliorare la biocompatibilità dei dispositivi di assistenza circolatoria&quot; RC1HL099863-01.

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Il nostro circuito di flusso e camera di flusso permettono di soggetto cellule aderenti, EPC per esempio, alle sollecitazioni di taglio fluido definito. Dal momento che la parte superiore della camera e in basso sono trasparenti, l'adesione cellulare e la morfologia possono essere valutati sia in tempo reale, attraverso la camera stessa, o dopo un esperimento di flusso e lo smontaggio della camera di flusso. A quel punto, le cellule possono essere raccolte in condizioni sterili e sia ri-placcato, o utilizzati per raccogliere il loro DNA o RNA, ecc, per ulteriori analisi. Per ottenere flusso laminare, il design della camera deve essere tale che diverse condizioni siano soddisfatte. In primo luogo, il flusso deve essere laminare, che può essere verificata calcolando il numero di Reynolds (Re), che è il rapporto di forze inerziali a forze viscose. (Se le forze viscose predominano, Re è piccolo e il flusso è laminare o 'completamente sviluppato' - di solito per Re &lt;2300.Se le forze inerziali predominano, il flusso diventa sempre più casuale fino a quando non è turbolento, come nel caso di Re&gt; 4000.) Possiamo calcolare Re secondo l'equazione 3 8, <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 3"> Dove ρ è la densità del fluido, Q è la portata, μ è la viscosità, w e h sono la larghezza e l'altezza della camera, rispettivamente, e D h è il diametro idraulico, definito secondo l'equazione 4 8, <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 4"> Il numero di Reynolds delle nostre camere flusso tre, con altezze che vanno dal 166-267 micron, range 13,9-34,6 ai tassi di flusso calculated per ottenere un sforzo di taglio di 15 dyne / cm 2. A portate calcolate per un sforzo di taglio di 100 dyne / cm 2, il numero di Reynolds delle camere variava dal 90,4-234. Tutti questi numeri di Reynolds sono molto inferiori a 2300 e soddisfare il criterio di flusso laminare. In secondo luogo, per il campo di velocità e di sforzo di taglio deve essere indipendente dalla distanza lungo il canale di flusso (cioè completamente sviluppate), la distanza dalla presa di scorrere fluido deve essere più lungo rispetto alla lunghezza d'ingresso, e L. Questo può essere soddisfatta calcolando la lunghezza d'ingresso, secondo l'equazione 5 9. <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 5"> Per i valori di cui sopra, la lunghezza d'ingresso varia 0,01-0,25 cm. In terzo luogo, al fine di assicurare che la velocità e lo stress di taglio in direzione laterale non varianosignificativamente dal valore di unidimensionale del flusso del canale (Ph Δ / 2L), il rapporto h / w deve essere molto minore di 1. Per il carico medio di taglio a parete sotto bidimensionale condizioni di flusso per il 95% della sollecitazione di taglio muro con una dimensione di flusso, h / w deve essere uguale a 0,10, e per lo sforzo di taglio muro sotto bidimensionale condizioni di flusso da 97,5% dello sforzo di taglio muro con una dimensione di flusso, h / w deve essere uguale a 0,05. Con le dimensioni della nostra camera di flusso progettato 1,7 centimetri in larghezza e 166-267 micron di altezza, questi criteri sono soddisfatti. La pressione varia solo nella direzione del flusso se non ci sono gradienti di pressione laterale all'ingresso. Questo può essere valutato utilizzando coloranti o particelle nel percorso del flusso. Inoltre, per esperimenti di flusso costante, un attenuatore delle pulsazioni è inserita nel circuito del flusso. L'attenuatore delle pulsazioni tira fuori la maggior parte della pulsatility causato dalla pompa rullo nel circuito, e ci permette di approssimare l'ipotesi di flusso costante. Da notare che il attenuatore delle pulsazioni utilizzati devono essere compatibili con la pompa e il tubo utilizzato nel circuito, in modo che possa effettivamente eliminare pulsazioni nel flusso di output per le frequenze specifiche della pompa rullo. Nella nostra dimostrazione L / S Masterflex ammortizzatore di pulsazioni raggiunge flusso laminare quando utilizzato sulla linea di scarico con qualsiasi M / L pompa serie Masterflex (0-600 RPM) e I / P 26 tubi. Per un flusso pulsatile, una pompa programmabile può essere utilizzato per generare forme d'onda diverse. Per un flusso pulsatile, una pompa programmabile può essere utilizzato per generare forme d'onda diverse. Inoltre, il circuito è progettato in modo tale che i campioni di perfusato possono facilmente essere raccolti in tempi diversi senza rischio di contaminazione delle cellule o media portata. Nel nostro esempio, la concentrazione di NO 2 - è stata misurata mediante chemiluminescenza conuno Ionics / Sievers Analizzatore di ossido di azoto (NOA 280, Strumenti Sievers, Boulder, CO), come descritto in precedenza 10. Il riducente utilizzato per l'analisi è stata nitrito di ioduro di potassio in acido acetico (14,5 M di acido acetico e 0,05 M KI), che ha il potenziale di riduzione di convertire nitrito di NO, ma non è sufficiente a ridurre eventuali ossidi di azoto superiore come il nitrato ed è quindi relativamente specifici per nitriti. Il nitrito importo totale prodotta è stato calcolato come il prodotto della concentrazione prodotta e il volume totale del circuito durante la regolazione del volume perso, mentre il prelievo di campioni 6. I seguenti passaggi sono fondamentali per la riuscita di esperimenti di flusso: <ol class="lroman"><li> È auspicabile per evitare la formazione di bolle durante il flusso di set-up, dal momento che le bolle hanno il potenziale per strappare le cellule dalla loro superficie. Questo può essere evitato facendo attenzione a quando si posiziona la parte superiore della camera di flusso sulla parte inferiore, che è megliocompiuta tenendo entrambe parallele l'una all'altra e abbassando la parte superiore sul fondo in un unico movimento senza modifiche. In tal modo, piccole bolle d'aria che possono essere presenti e / o galleggiante nel canale di flusso, sarà deviato nelle trappole bolla alle due estremità del contenitore in alluminio. </li><li> E 'importante assicurarsi che il tubo deflusso nel bacino raggiunge fino al fondo del serbatoio è. In caso contrario, l'aria può essere risucchiato nel tubo che porta dal serbatoio alla camera se il livello scende leggermente al di sotto perfusato fine tubo. </li><li> Il ricercatore deve avere familiarità con la direzione del flusso della pompa in modo che la pompa non accidentalmente correre nella direzione opposta con l'inizio del flusso, il che si tradurrebbe in aria risucchiata nel circuito e da camera. </li><li> Per evitare la formazione di schiuma (a causa di proteine ​​denaturate contenute nel siero), si consiglia di abbassare il tubo che porta dalla camera al serbatoio a circa un centimetro al di sopra del perfusate livello all'interno del serbatoio. Tuttavia, mantenendolo al di sopra del livello medio di flusso consente di verificare il flusso nel serbatoio durante l'esperimento. </li><li> Al momento di collegare le parti della camera insieme, è importante afferrare saldamente la custodia con una mano durante l'utilizzo del cacciavite elettrico con l'altra mano. Si noti che il movimento del cacciavite elettrico si tradurranno in una coppia che ha il potenziale di 'scagliare la camera intorno' una volta che la vite è serrata. </li><li> Per evitare la formazione di onde di pressione nel circuito e il sollevamento delle cellule i loro superficie, in modo che tutti i rubinetti sono aperti prima di iniziare il flusso. </li><li> Soprattutto per gli studi di flusso a più lungo termine (&gt; 48 ore) si consiglia di utilizzare il tubo più duro e più resistente di essere inserito nella testa della pompa per evitare rottura dei tubi. </li><li> E 'possibile che i tubi' migra 'all'interno della testa della pompa a causa di denti pompa mal regolata testa. Pertanto si consiglia attenzione a come la vascaING è fissato nella testa della pompa e la marcatura ogni estremità del tubo con un pennarello in modo tale che si può facilmente notare se il tubo è 'tirato in' o staccato durante l'esperimento. </li><li> Sempre verificare attentamente ogni singolo connettore del circuito e da camera prima di iniziare la perfusione al fine di evitare perdite di perfusato durante un esperimento a causa di un collegamento difettoso. Ciò è particolarmente importante per i connettori di afflusso e deflusso di smorzatori di impulsi! </li><li> Ricordatevi di limitare l'esposizione alla luce se si utilizzano etichette fluorescenti. </li></ol> Una limitazione possibile della nostra camera di flusso è che l'altezza è fissata per l'altezza del canale lavorati in alluminio. Tuttavia, questo ha il vantaggio di non dover verificare e regolare l'altezza del canale prima di ogni esperimento e semplifica quindi i calcoli sforzo di taglio, semplicemente regolando la portata della pompa al valore desiderato. A seconda degli obiettivi della ricerca, può essere auspicabileaumentare la tensione di taglio senza aumentare la velocità della pompa. In questo caso si consiglia di aumentare la viscosità del perfusato è, ad esempio l'aggiunta di destrano al medium 11. Una possibile limitazione del circuito flusso è il grande volume di mezzo utilizzato, che può essere problematico quando si tenta di quantificare le concentrazioni molto piccole di metaboliti cellulari. Anche se non qui, è possibile ridurre considerevolmente il livello del circuito utilizzando un serbatoio più piccolo e attenuatore delle pulsazioni e diminuire lunghezza del tubo e il diametro. Inoltre, ci sono parecchi altri sistemi disponibili in commercio che possono essere utilizzati per applicare liquidi shear stress alle cellule in coltura. Microfluidica sistemi basati, ad esempio il sistema BioFlux da flussione, consentono analisi simultanea di cellule in diversi canali di flusso microfluidica caricato con soluzione in pozzetti in qualità di ingresso e di uscita serbatoi per questi canali 12,13,14. Tuttavia, queste e altre microsistemi fluidici non sono compatibili con vetrini da microscopio standard e non consentono il recupero di un numero sufficientemente ampio di celle per ulteriori esperimenti, come la RT-PCR o Western Blot. Inoltre, sono meno user-friendly, un costo minimo di $ 40.000 e possono raggiungere un totale di più di 100.000 dollari, a seconda del materiale accessorio. Due sistemi macrofluidic disponibili dall'Aeroporto Internazionale di Flexcell Corporation, lo Streamer Flexcell ei sistemi FlexFlow, sono stati utilizzati con successo per studiare le cellule endoteliali 15,16,17, cellule umane anello 18 e 19 fibroblasti in condizioni di flusso del fluido. Un terzo sistema, disponibile attraverso GlycoTech, è stato utilizzato per studiare l'adesione delle cellule tumorali 20 e l'adesione dei leucociti da 21 a monostrati endoteliale. Il sistema Streamer consente diverse diapositive per essere eseguito nelle stesse condizioni di stress di taglio in una sola volta, ma manca di un valore e - a differenza dei nostridesign - non consente visualizzazione in tempo reale delle cellule in condizioni di flusso. Il sistema FlexFlow ha una finestra di visualizzazione, ma richiede un microscopio verticale, che potrebbe non essere il microscopio standard utilizzato nella maggior parte dei laboratori. Inoltre, il sistema FlexFlow richiede una cella rivestita vetrino per essere invertita, quando sono immessi nella camera di flusso. Questo impedisce la visualizzazione di cellule fluorescenti su una superficie opaca, come il titanio rivestita di vetro, che dimostriamo nel nostro studio. Infine, il copri-specialistici devono essere acquistati appositamente per il sistema FlexFlow, che si trova nella multi-mille dollari fascia di prezzo, simile al sistema Streamer Flexcell. GlycoTech offre circolari e rettangolari a piatti paralleli camere di flusso, che sono significativamente meno costoso, ma realizzati in acrilico, colato, che non possono essere comodamente staminali in autoclave come la nostra camera. Da segnalare, camere flusso altre che sono state descritte da autoclavabiliapparire impraticabile perché richiedono particolari lenti microscopiche 22,23. Il sistema utilizza GlycoTech guarnizioni in gomma di silicone interposto tra le piastre superiore e inferiore, che cambierà di spessore con l'uso ripetuto e quindi modificare l'altezza della camera nel corso del tempo (il produttore consiglia l'acquisto di nuovi dopo ogni dieci usa). La nostra camera di alluminio con built-in o-ring permette di opposizione completa di piastre superiore e inferiore e garantisce un'altezza costante camera tra esperimenti. Infine, pompe a vuoto sono necessari per ottenere una tenuta guarnizione in molti disegni camera di flusso, tra cui le camere GlycoTech, che non sono necessarie nel nostro design. Considerando che non qui, la camera di flusso può essere tenuta sotto un microscopio durante l'esperimento intero flusso di imaging in tempo reale di adesione cellulare e / o comportamenti. Se questo è desiderato, si consiglia di utilizzare lampade a calore o un tappetino riscaldato sotto la camera per mantenere la temperatura perfusato a 37 ° C. Pelliccialì, la pompa rullo può essere sostituita con una pompa a siringa, se no 'riciclo' di due cellule o metaboliti o farmaci sperimentali o agenti si desidera 24. E 'anche possibile flusso di cellule diversamente etichettato più di cellule aderenti, ad esempio le piastrine fluorescenti su uno strato di EPC confluenti (usando il test delle piastrine descritto da Achneck et al. 6,25) per valutare cellula-cellula interazione in condizioni di stress di taglio fluido. La nostra camera di flusso combina caratteristiche di valore delle altre camere di flusso disponibili, ad esempio una porta di campionamento perfusato e una finestra di visualizzazione e ha l'importante vantaggio di compatibilità sia con un microscopio invertito o verticale. E 'completamente autoclavabile e permette di esperimenti ripetuti in altezza della camera costante e senza la necessità di pompe per vuoto ad ottenere una tenuta stagna.

<table border="1"><tbody><tr><td> Prodotti / reagenti </td><td> Azienda </td><td> Prodotto # </td></tr><tr><td> Siringa da 10 ml </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07940-12 </td></tr><tr><td> 1-Way Stopcoks </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-00 </td></tr><tr><td> 30 ml Siringa </td><td> BD Medical </td><td> 309650 </td></tr><tr><td> 4-Way Rubinetti </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-04 </td></tr><tr><td> In lega di alluminio </td><td> N / A </td><td> 6061 </td></tr><tr><td> Cell-Cultura Piatti (4-bene, rettangolare) </td><td> Thermo Scientific; Nunc </td><td> 267061 </td></tr><tr><td> Cellula Tracker Arancio </td><td> Invitrogen </td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Ricerca Organics </td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM-2 Singlequots </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Femmina Adattatore Luer </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> SI-45500-04 </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Sigma </td><td> F0895-2MG </td></tr><tr><td> Bottiglia di vetro (250 ml) con Cap </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 34594-24 </td></tr><tr><td> Tubi duro </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06508-16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td></tr><tr><td> HISTOPAQUE </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td></tr><tr><td> Hoechst Soluzione Stain </td><td> Sigma </td><td> H6024 </td></tr><tr><td> Hyclone FBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Lonza </td><td> 17-605E </td></tr><tr><td> Adattatore Maschio Luer </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> EW-45505-04 </td></tr><tr><td> MCDB-131, 1X Media </td><td> Cellgro </td><td> 15-100-CV </td></tr><tr><td> Raccordi in polipropilene spinato </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06365-90 </td></tr><tr><td> O-Ring </td><td> N / A </td><td> AS568A </td></tr><tr><td> Pulse-Dampener </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07596-20 </td></tr><tr><td> Pompa-Drive (Masterflex L / S azionamento a velocità variabile economia) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 7524-40 </td></tr><tr><td> Pompa-Head (Masterflex Facile testa della pompa di carico) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07518-60 </td></tr><tr><td> Scivolo </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 48500-00 </td></tr><tr><td> Tubo morbido </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 96400-16 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Siringa filtro </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 02915-12 </td></tr><tr><td> Sytox Nucleic Acid Orange Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S-11368 </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Tripsina soluzione neutralizzante </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td></tr></tbody></table>

piatti paralleli camera flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di descrivere una tecnica per soggetto cellule aderenti alle condizioni di flusso laminare e valutare la loro risposta al taglio fluido ben quantificabili sottolinea 1. Il nostro design camera di flusso e flusso del circuito (Fig. 1) contiene una regione trasparente visualizzazione che consente la sperimentazione di adesione cellulare e l&#39;imaging di morfologia cellulare immediatamente prima del flusso (Fig. 11A, B), in vari momenti durante il flusso (Fig. 11C) , e dopo che il flusso (Fig. 11D). Questi esperimenti sono illustrate con cordone ombelicale umano derivati ​​dal sangue le cellule progenitrici endoteliali (EPC) e suina EPC 2,3. Questo metodo è applicabile anche ad altri tipi di cellule aderenti, ad esempio, cellule muscolari lisce (SMC) o fibroblasti. La camera e tutte le parti del circuito sono facilmente sterilizzati in autoclave a vapore. A differenza di altriCamere, ad esempio camere di microfluidica, un gran numero di cellule (&gt; 1 milione a seconda delle dimensioni della cella) può essere recuperato dopo l&#39;esperimento di flusso in condizioni sterili per colture cellulari o di altri esperimenti, come ad esempio l&#39;estrazione del DNA o RNA, o immunoistochimica (Fig. 11E), o microscopia elettronica a scansione 5. La tensione di taglio può essere regolata variando la portata del perfusato, la viscosità del fluido, o l&#39;altezza e la larghezza del canale. Quest&#39;ultima può ridurre il volume di liquidi o ha bisogno di cellule assicurando nel contempo che unidimensionale del flusso viene mantenuta. Non è necessario misurare l&#39;altezza della camera tra esperimenti, dal momento che l&#39;altezza della camera non dipende l&#39;uso di guarnizioni, che aumenta notevolmente la facilità di esperimenti multipli. Inoltre, il design del circuito consente facilmente la raccolta di campioni perfusato per l&#39;analisi e / o la quantificazione di metaboliti secreti dalle cellule del liquido sotto esposizione shear stress, ad esempio, l&#39;ossido nitrico (fig. 12) 6 </sup&gt;.

Stiamo descrivendo un metodo per soggetto cellule aderenti alle sollecitazioni di taglio a flusso laminare in un circuito sterile flusso continuo. L&#39;adesione delle cellule &#39;, morfologia possono essere studiati attraverso la camera trasparente, campioni ottenuti dal circuito per l&#39;analisi metabolita e le cellule raccolte dopo l&#39;esposizione di taglio per gli esperimenti futuri o della cultura.

Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

L'obiettivo generale di questo metodo è descrivere una tecnica per sottoporre cellule aderenti a condizioni di flusso laminare e valutarne la risposta a ...

L'obiettivo generale di questo articolo video è descrivere una tecnica per sottoporre cellule aderenti a condizioni di flusso laminare e valutare la risposta a stress di taglio del fluido ben quantificabili. Questo viene realizzato assemblando innanzitutto il circuito di flusso senza la camera di flusso. Il circuito comprende il serbatoio del polso, l'ammortizzatore di pulsazioni, i tubi rigidi, i tubi flessibili, i rubinetti a quattro vie e gli adattatori a baionetta collegati, nonché un filtro dell'aria.Il passaggio successivo consiste nel riempire il circuito con il fluido desiderato, ad esempio il mezzo cellulare in condizioni sterili, quindi avviare la pompa per riempire l'ammortizzatore di pulsazione ed espellere l'aria dai tubi. Successivamente si inserisce la lamellina con le cellule nella piastra inferiore della camera di flusso. L'ultimo passaggio della procedura è il montaggio completo del circuito di flusso, con la camera di flusso inserita in linea.I risultati finali possono dimostrare l'allineamento di cellule progenitrici endoteliali marcate con fluorescenza sotto esposizione a stress da taglio del fluido, osservato attraverso una camera trasparente mediante microscopio a fluorescenza. Per studiare il comportamento funzionale delle cellule, è spesso necessario imitare la fisiologia in vivo sottoponendo le cellule a stress da taglio del fluido. Abbiamo progettato una camera a piastre parallele e un circuito a flusso continuo, che ci permettono di studiare le cellule in condizioni di flusso e di osservarle attraverso la camera trasparente.Questa tecnica può rappresentare uno strumento di ricerca prezioso per i settori della medicina e dell'ingegneria. La nostra camera di flusso consente la visualizzazione intermittente o in tempo reale di cellule in condizioni di flusso, utilizzando un microscopio diritto o invertito. Inoltre, il design del Dott. Ach Nick permette ai ricercatori di acquisire immagini di cellule su superfici trasparenti o radiopache impiegando obiettivi microscopici standard.Inoltre, può rappresentare uno strumento importante nella ricerca farmacologica per studiare l'effetto dei farmaci sulle cellule in condizioni di flusso. La visualizzazione dell'allestimento è fondamentale poiché diversi passaggi risultano difficili da apprendere soltanto leggendo un protocollo. Fornirò istruzioni dettagliate su come allestire la camera a flusso e il circuito di flusso comunemente utilizzati nel laboratorio del Dott. Ock Next per assemblare il circuito di flusso.Iniziare collegando un segmento di tubo rigido lungo 36 pollici a un'estremità di un smorzatore di impulsi e l'altra estremità. Collegare un segmento di tubo flessibile lungo 18 pollici. Posizionare un adattatore filettato maschio da un ottavo di pollice all'estremità del tratto di tubo flessibile da 18 pollici.Collegare l'esca maschio a un adattatore femmina da un ottavo di pollice. Fissare l'esca femmina a un nuovo segmento di tubo flessibile lungo 18 pollici. Praticare tre fori nel tappo di un becher di vetro da 250 millilitri.Per adattare il tubo, inserire un segmento di tubo morbido lungo 1,5 pollici in un foro, come sfiato d'aria. Inserire le estremità libere del tubo rigido e di quello morbido attraverso gli altri due fori nel tappo, all'interno del flacone di vetro da 250 millilitri, che fungerà da serbatoio.Assicurarsi che il tubo rigido raggiunga il fondo del serbatoio. Il mantenimento della sterilità durante l'allestimento del circuito è fondamentale per il successo di questa procedura. Pertanto, tutte le parti devono essere sterilizzate e si devono indossare guanti sterili per tutta la durata dell'operazione.Oltre alle parti assemblate, queste parti devono essere sterilizzate. Una camera di flusso completa, tre segmenti di tubo flessibile di due pollici ciascuno, un raccordo maschio e uno femmina da un ottavo di pollice, quattro viti a testa piatta da un mezzo pollice, 6 5 16 pollici, otto da trenta secondi. Pollici di pista per pollice, viti a testa piatta, una coppia di pinzette, un vetrino, e due strofinacci sterilizzati a vapore.Autoclavaggio a 121 gradi Celsius per 60 minuti. Posizionare il circuito di flusso, la camera di flusso, i rubinetti a quattro vie uno per uno, il rubinetto e tutte le parti sterilizzate su questo campo sterile. Indossando guanti sterili, collegare i due rubinetti a quattro vie.Mettere i tappi sui porti di campionamento aperti. Staccare gli adattatori maschio e femmina che collegano i due tratti di tubo flessibile del circuito di flusso e inserire le valvole a saracinesca collegate. Collegare il tubo flessibile inserito nel serbatoio a una siringa da 30 millilitri e rimuovere il pistone della siringa.Riempire il flacone con 125 millilitri di mezzo EPC. Ricollegare il tubo flessibile al rubinetto a tre vie. Inserire un filtro sterile per siringa nel foro di ventilazione.Ora trasferire il circuito di flusso in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Fissare il tubo rigido nella testa della pompa peristaltica Master Flex indicata per l'uso con questo tipo di tubo Palmer in carbone. Assicurarsi che il tubo non si sovrapponga alle guide di montaggio della pompa a rulli.Segnare il tubo nel punto in cui esce dalla testa della pompa su entrambi i lati con un pennarello. Dopo aver verificato che tutti i rubinetti a chiusura siano chiusi verso i porti del campione e aperti lungo il circuito di flusso, avviare la pompa. Verificare il senso del flusso.Il PERFUSE otto deve scorrere dal serbatoio di vetro attraverso il tubo rigido fino allo smorzatore di pulsazioni. Per il montaggio della camera di flusso, utilizzare guanti sterili per collegare un segmento di tubo flessibile da due pollici a un adattatore femmina da un ottavo di pollice. Collegare un altro segmento di tubo flessibile da due pollici a un adattatore maschio da un ottavo di pollice.Collegare il tubo morbido da due pollici con adattatore femmina a baionetta al porto di ingresso e il tubo morbido da due pollici con adattatore maschio a baionetta al porto di uscita. Collegare rubinetti a quattro vie a entrambi questi adattatori a baionetta. Collegare il rimanente pezzo di tubo morbido da due pollici al connettore del porto laterale proveniente dal trappola bolle e fissare un rubinetto unidirezionale utilizzando pinze sterili.Rimuovere il vetrino con cellule seminate dal contenitore di coltura cellulare e posizionarlo nella cavità della piastra inferiore della camera a flusso. Assicurarsi che il vetrino sia posizionato con il lato contenente le cellule rivolto verso l'alto; utilizzando una siringa o una pipetta, aggiungere 10 millilitri di mezzo EPC caldo sopra il vetrino con le cellule. Lasciare che il mezzo ricopra il vetrino all'interno della camera a flusso, senza farlo traboccare sull'O-ring presente sulla piastra inferiore.Posizionare la piastra superiore della camera di flusso sulla piastra inferiore, allineando i fori delle viti. Mantenere le due piastre parallele per evitare di introdurre bolle d'aria nella camera avvitando le piastre insieme. Utilizzando un cacciavite elettrico a batteria, eliminare la bolla nel trappola di spurgo in ingresso aprendo il rubinetto unidirezionale collegato alla porta della trappola di spurgo del lato di ingresso.Utilizzare una siringa da 10 millilitri per lavare delicatamente il tubo di ingresso con il mezzo EPC, quindi chiudere e tappare questo rubinetto a tre vie. A questo punto, eliminare l'aria dal canale della camera aprendo il rubinetto a quattro vie del porto di uscita e lavando delicatamente con il mezzo EPC attraverso la camera di flusso. Utilizzando nuovamente una siringa da 10 millilitri, tappare tutte le connessioni del rubinetto a quattro vie e chiuderle.Trasferire la camera di flusso nell'incubatore umidificato con il circuito di flusso assemblato. Fermare la pompa del circuito di flusso chiudendo il circuito. Chiudere i rubinetti nel senso del flusso per prevenire perdite.Collegare la camera di flusso al circuito di flusso. Dopo aver collegato la camera di flusso al circuito di flusso, aprire i rubinetti a tre vie nel senso del flusso. Riavviare la pompa di flusso ed assicurarsi che il flusso di PERFUSE eight proceda nella direzione corretta. Regolare la portata alla tensione di taglio desiderata.Durante l'esperimento di flusso, la camera di flusso può essere rimossa dal circuito per osservare le cellule mediante microscopia ottica o fluorescenza. Per fare ciò, scollegare la camera di flusso dal circuito di flusso alle connessioni tra i rubinetti a spillo. Per raccogliere il perfusato, prelevare otto campioni per l'analisi.Prima di tutto, arrestare la pompa e chiudere il rubinetto a tre vie situato più vicino allo smorzatore di pulsazioni. Rimuovere il suo cappuccio protettivo, posizionandolo capovolto per assicurarsi che non si contamini. Inserire una siringa piccola nel porto di campionamento.Chiudere il rubinetto a chiusura rapida nella direzione della camera di flusso, mantenendo aperti il portello del campione e il circuito in direzione dello smorzatore di impulsi. Aspirare la quantità desiderata di campione dal circuito, quindi chiudere il rubinetto verso il portello del campione prima di rimuovere la siringa. Conservare il campione in abbondanza in un vial etichettato e congelare a meno 80 gradi Celsius.Richiudere il porto del campione e assicurarsi che tutti i rubinetti a tre vie siano aperti prima di avviare il flusso. Utilizzando questo metodo, cellule progenitrici endoteliali derivate da sangue umano possono essere seminate su vetrini di titanio entro 15 minuti e aderire sotto forze di taglio fisiologiche. Come mostrato in questa figura, le CPE si espandono sotto l'influenza del flusso da circa 210 micrometri quadrati immediatamente dopo la semina a circa 657 micrometri quadrati dopo tre ore e a circa 1.152 micrometri quadrati dopo 48 ore di stress da taglio del fluido pari a 15 din/cm².Questa immagine al microscopio ottico illustra l'orientamento casuale degli EPC umani. Dopo un periodo di adesione statica di sei ore a seguito di tre ore di flusso a 100 din/cm², le cellule si sono espanse ma rimangono orientate in modo casuale. Dopo 48 ore di stress da flusso a 100 din/cm², gli EPC si allineano e orientano nella direzione del flusso.Qui, le EPC sono state marcate con CTO e i nuclei cellulari colorati con herx prima della morte dopo il passaggio in flusso. A scopo comparativo, questa immagine mostra EPC suine su vetrini di titanio allineate nella direzione del flusso. Dopo 48 ore di flusso ed esposizione a uno stress di taglio di 15 dine per centimetro quadrato, i bordi cellulari sono stati colorati con il marcatore anti pcam e i nuclei con il colorante nucleico cytoxin.Questo metodo consente inoltre di ottenere campioni del PERFUSE otto in intervalli di tempo predeterminati per l'analisi e/o la quantificazione dei metaboliti cellulari secreti. Qui viene mostrato un esempio della produzione di nitrito durante un esperimento di flusso della durata di 48 ore con EPC porcini. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale mantenere l'asepsi per tutto il tempo.Inoltre, è importante adottare le misure necessarie per ridurre il numero di bolle d'aria nella camera di flusso prima dell'inizio del flusso continuo, poiché potrebbero staccare le cellule. Raccomandiamo inoltre di controllare ogni singola connessione nella camera di flusso e nel circuito prima della perfusione per evitare perdite di PERFUSE eight durante un esperimento. Questa camera è progettata con O-ring integrati che consentono un perfetto accoppiamento tra la piastra superiore e quella inferiore e garantiscono una tenuta ermetica senza la necessità di pompe a vuoto.Questa caratteristica garantisce anche un'altezza costante della camera tra un esperimento e l'altro ed elimina la necessità di guarnizioni di gomma o regolazioni. La nostra camera a flusso utilizza vetrini da microscopio standardizzati. Pertanto, un elevato numero di cellule è disponibile per ulteriori esperimenti.Ad esempio, l'RNA e il DNA delle cellule dopo il flusso possono essere valutati per la sintesi proteica o l'espressione genica. Il nostro design del circuito consente la raccolta di otto campioni di perfusione per l'analisi e la quantificazione di metaboliti cellulari come il nitrito, un metabolita ossidativo primario dell'ossido nitrico, secreto dalle cellule sotto stress da taglio fluidodinamico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come assemblare la nostra camera a flusso e il circuito a flusso sterile per sottoporre cellule aderenti a uno stress da taglio fluidodinamico.

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Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

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