Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

L'obiettivo generale di questo video articolo è quello di descrivere una tecnica per sottoporre le cellule aderenti a condizioni di flusso laminare e valutare la risposta a sollecitazioni di taglio dei fluidi ben quantificabili. Ciò si ottiene assemblando prima il circuito di flusso senza la camera di flusso. Il circuito comprende l'impulso del serbatoio, lo smorzatore, i tubi rigidi, i tubi morbidi, i rubinetti di arresto a quattro vie e gli adattatori per esche collegate, nonché un filtro dell'aria.

Il passo successivo consiste nel riempire il circuito con l'abbondante otto desiderato, come il mezzo cellulare in condizioni sterili, quindi avviare la pompa per riempire lo smorzatore di impulsi e spurgare il tubo dall'aria. Segue l'inserimento del vetrino alloggiato nella piastra inferiore della camera di flusso. La fase finale della procedura è l'assemblaggio completo del circuito di flusso con la camera di flusso in linea.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'allineamento delle cellule progenitrici endoteliali marcate in fluorescenza sotto l'esposizione allo stress da taglio del fluido attraverso la camera trasparente utilizzando un microscopio a fluorescenza per studiare il comportamento funzionale delle cellule. Spesso è necessario imitare la fisiologia in vivo sottoponendo le cellule a stress di taglio dei fluidi. Abbiamo progettato una camera di flusso a piastre parallele e un circuito a flusso continuo, che ci permettono di studiare le celle in condizioni di flusso e di osservarle attraverso la camera trasparente.

Questa tecnica può fungere da prezioso strumento di ricerca per i campi della medicina e dell'ingegneria. La nostra camera di flusso consente la visualizzazione intermittente o in tempo reale delle cellule sotto flusso utilizzando il microscopio verticale o invertito. Inoltre, il design del Dr. Ach Nick consente ai ricercatori di visualizzare le cellule su superfici trasparenti o radiopache utilizzando lenti per microscopio standard.

Inoltre, può essere uno strumento importante nella ricerca farmacologica per studiare l'effetto dei farmaci sulle cellule in condizioni di flusso. La visualizzazione della configurazione è fondamentale perché molti dei passaggi sono difficili da padroneggiare leggendo solo un protocollo. Darò istruzioni passo passo su come impostare la camera di flusso e il circuito di flusso comunemente usati nel laboratorio del Dr.Ock Next Per assemblare il circuito di flusso.

Inizia collegando un segmento di tubo rigido da 36 pollici a un'estremità di uno smorzatore di impulsi all'altra estremità. Collegare un segmento da 18 pollici di tubo morbido. Posizionare un adattatore per esche maschio da un ottavo di pollice all'estremità della sezione del tubo morbido da 18 pollici.

Collegare l'esca maschile a un adattatore per esca femmina da un ottavo di pollice. Attacca l'esca femmina a un nuovo segmento da 18 pollici di tubo morbido. Praticare tre fori in un tappo di vetro da 250 millilitri.

Per montare il tubo, inserire un segmento di tubo morbido da 1,5 pollici in un foro. Come presa d'aria. Inserire le estremità libere del tubo duro e morbido attraverso gli altri due fori del tappo nella bottiglia di vetro da 250 millilitri, che fungerà da serbatoio.

Assicurarsi che il tubo rigido raggiunga il fondo del serbatoio. Il mantenimento della sterilità durante l'allestimento del circuito è fondamentale per il successo di questa procedura. Pertanto, tutte le parti devono essere sterilizzate e si devono indossare guanti sterili per tutto il tempo.

Oltre alle parti assemblate, queste parti devono essere sterilizzate. Una camera di flusso completa, segmenti di tubi morbidi da tre per due pollici, un maschio e una femmina, un adattatore per esche da un ottavo pollice, quattro viti a testa piatta da mezzo pollice, 6 5 da 16 pollici, otto da 30 secondi. Tracce in pollici per pollice, viti a testa piatta, un paio di pinzette, un vetrino e due asciugamani sterilizzati a vapore.

Autoclavaggio a 121 gradi Celsius per 60 minuti. Posizionare la camera di flusso del circuito di flusso a quattro vie i rubinetti di arresto a quattro vie uno per uno, il rubinetto di arresto e tutte le parti sterilizzate su questo campo sterile. Indossando guanti sterili, collegare i due rubinetti di arresto a quattro vie.

Posizionare i cappucci sulle porte del campione aperte. Staccare gli adattatori per esche maschio e femmina che fissano i due segmenti di tubo morbido del circuito di flusso e inserire i rubinetti di arresto collegati. Collegare il tubo morbido inserito nel serbatoio in una siringa da 30 millilitri e rimuovere il pistone della siringa.

Riempire la bottiglia con 125 millilitri di terreno EPC. Ricollegare il tubo morbido al rubinetto di arresto. Posizionare un filtro per siringa sterile nella presa d'aria.

Ora trasferisci il circuito di flusso in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Clamp il tubo rigido nella testa della pompa a rulli master flex indicata per l'uso con questo tipo di tubo Palmer per carbone. Assicurarsi che il tubo non si sovrapponga ai binari di montaggio della pompa a rulli.

Contrassegnare il tubo nel punto in cui esce dalla testa della pompa su entrambi i lati con un pennarello. Dopo essersi assicurati che tutti i rubinetti di arresto siano chiusi verso le porte del campione e aperti lungo il circuito di flusso, avviare la pompa. Verificare la direzione del flusso.

Il PERFUSE eight dovrebbe spostarsi dal serbatoio di vetro attraverso il tubo rigido nello smorzatore di impulsi. Per l'assemblaggio della camera di flusso, utilizzare guanti sterili per collegare un segmento di tubo morbido da due pollici a un adattatore per esca femmina da un ottavo di pollice. Collegare un altro segmento di tubo morbido da due pollici a un adattatore per esche maschio da un ottavo di pollice.

Collegare il tubo morbido da due pollici con adattatore per esca femmina alla porta di afflusso e il tubo morbido da due pollici con adattatore per esca maschio alla porta di uscita. Collegare i rubinetti di arresto a quattro vie a entrambi questi adattatori per esche. Collegare il rimanente pezzo di tubo morbido da due pollici al connettore della porta laterale che esce dalla trappola a bolle e collegare un rubinetto di arresto unidirezionale utilizzando una pinzetta sterile.

Rimuovere il vetrino seminato dalla cella di coltura cellulare e posizionarlo nell'incavo sulla piastra inferiore della camera di flusso. Assicurarsi che il vetrino sia posizionato con la cellula rivolta verso l'alto utilizzando una siringa o una pipetta, posizionare 10 millilitri di terreno EPC caldo sul vetrino in posizione della cellula. Lasciare che il fluido copra il vetrino nella camera di flusso, ma non versare il fluido sull'O-ring sulla piastra inferiore.

Posizionare la piastra superiore della camera di flusso sulla piastra inferiore, allineando i fori delle viti. Mantenere le due piastre parallele per non introdurre bolle d'aria nelle piastre delle viti della camera. Insieme. Utilizzando un cacciavite automatico a batteria de aria, la trappola per bolle di afflusso aprendo il rubinetto di arresto unidirezionale collegato alla porta della trappola per bolle laterale di afflusso.

Utilizzare una siringa da 10 millilitri per lavare delicatamente il tubo di afflusso con il mezzo EPC, quindi chiudere questo rubinetto di arresto e tapparlo. Ora dearieggiare il canale della camera aprendo il rubinetto di arresto a quattro vie della porta di deflusso e lavando delicatamente il fluido EPC attraverso la camera di flusso. Sempre utilizzando un tappo da siringa da 10 millilitri, tutti i collegamenti del rubinetto di arresto a quattro vie e chiuderli.

Trasferire la camera di flusso nell'incubatore umidificato con il circuito di flusso assemblato. Mettere in pausa la pompa del circuito di mandata, chiudere il circuito di mandata. Arrestare i rubinetti nella direzione del flusso per evitare perdite.

Collegare la camera di flusso al circuito di flusso Dopo aver collegato la camera di flusso al circuito di flusso, aprire i rubinetti di arresto nella direzione del flusso. Riprendere la pompa di flusso e assicurarsi che il PERFUSE otto scorra nella direzione corretta. Regolare la portata in base alla sollecitazione desiderata.

Durante l'esperimento di flusso, la camera di flusso può essere rimossa dal circuito per visualizzare le cellule tramite microscopia ottica o fluorescente. A tale scopo, scollegare la camera di flusso dal circuito di flusso in corrispondenza del rubinetto di arresto per arrestare i collegamenti del rubinetto. Raccogliere otto campioni per l'analisi.

Per prima cosa, mettere in pausa la pompa, chiudere il rubinetto di arresto situato più vicino allo smorzatore di impulsi. Rimuovere il cappuccio protettivo, posizionandolo a testa in giù per assicurarsi che non sia contaminato. Inserire una piccola siringa nella porta del campione.

Chiudere il rubinetto di arresto in direzione della camera di flusso, mantenendo aperta la porta del campione e il circuito in direzione dello smorzatore di impulsi. Prelevare la quantità desiderata di campione dal circuito, chiudere il rubinetto verso la porta del campione prima di rimuovere la siringa. Conservare l'abbondante campione otto in una fiala etichettata e congelare a meno 80 gradi Celsius.

Richiudere il sample porta e assicurarsi che tutti i rubinetti siano aperti prima di iniziare il flusso. Utilizzando questo metodo, le cellule progenitrici endoteliali derivate dal sangue umano possono essere seminate su vetrini di titanio entro 15 minuti e aderire sotto forze di taglio fisiologiche. Come mostrato in questa figura, le EPC si diffondono sotto l'influenza del flusso da circa 210 micron quadrati subito dopo la semina a circa 657 micron quadrati dopo tre ore e circa 1.152 micron quadrati dopo 48 ore di stress da taglio fluido di 15 dines per centimetro quadrato.

Questa immagine al microscopio ottico illustra l'orientamento casuale delle EPC umane. Dopo un periodo di seduta statica di sei ore dopo tre ore di flusso a 100 cene per centimetro quadrato, le celle si sono diffuse ma rimangono in un orientamento casuale. Dopo 48 ore di sforzo di taglio del fluido a 100 dosi per centimetro quadrato, gli EPC sono allineati e orientati nella direzione del flusso.

Qui le EPC sono state marcate con CTO e i nuclei cellulari sono stati colorati con herx per morire dopo il flusso. A scopo di confronto, questa immagine mostra le EPC suine su vetrini in titanio allineate con la direzione del flusso. Dopo 48 ore di flusso e 15 dosi per centimetro quadrato di esposizione allo stress da taglio, i bordi cellulari sono stati colorati con colorante anti pcam e i nuclei con colorante con acido nucleico citossina.

Questo metodo consente anche di ottenere campioni di PERFUSE eight in momenti predeterminati per l'analisi e/o la quantificazione dei metaboliti cellulari secreti. Qui è mostrato un esempio della produzione di nitriti durante un esperimento di flusso di 48 ore con EPC suine. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere la sterilità per tutto il tempo.

Inoltre, è importante adottare le misure necessarie per ridurre il numero di bolle d'aria nella camera di flusso prima dell'inizio del flusso continuo, in quanto potrebbero strappare le celle. Si consiglia inoltre di controllare ogni singola connessione nella camera di flusso e nel circuito prima della profusione per evitare perdite di PERFUSE otto durante un esperimento. Questa camera è progettata con O-ring incorporati che consentono l'opposizione completa delle piastre superiore e inferiore e forniscono una tenuta stagna senza richiedere pompe per vuoto.

Questa caratteristica garantisce inoltre un'altezza costante della camera tra gli esperimenti ed elimina la necessità di guarnizioni in gomma o regolazioni. La nostra camera di flusso utilizza vetrini per microscopio standardizzati. Pertanto, un gran numero di celle è disponibile per ulteriori esperimenti.

Ad esempio, l'RNA e il DNA delle cellule dopo il flusso possono essere valutati per la sintesi proteica o l'espressione genica. Il nostro design del circuito consente la raccolta di otto campioni di perfuso per l'analisi e la quantificazione di metaboliti cellulari come il nitrito, un metabolita ossidativo primario dell'ossido nitrico, che viene secreto dalle cellule sotto stress di taglio del fluido. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare la nostra camera di flusso e il circuito di flusso sterile per sottoporre le celle di aderenza a stress di taglio del fluido.