Sviluppo di un più sensibile e specifica Chromogenic Agar Media per la rilevazione di

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la sensibilità e la specificità di un nuovo mezzo cromogeno per la capacità di rilevare e isolare Vibrio parahaemolyticus rispetto ai mezzi convenzionali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della microbiologia alimentare e ambientale, ad esempio qual è la prevalenza delle specie di Vibrio negli alimenti e negli ambienti di raccolta? Il principale vantaggio della nostra procedura è che possono essere utilizzati molti isolati batterici, anche in presenza di una matrice alimentare.

Prima di coltivare i batteri, sterilizzare in autoclave tutti i mezzi solidi contenenti agar. Successivamente, raffreddare l'agar a 45-50 gradi Celsius in un bagno termico. Quando l'agar è pronto, disporre le piastre di Petri vuote in pile di cinque-sei piastre.

Quindi, partendo dal fondo della pila, versare l'agar fuso in ogni piastra fino a riempirla per circa metà, sostituendo i coperchi dopo il travaso. Lasciare solidificare l'agar a temperatura ambiente per almeno 12 ore. Per preparare le colture dei ceppi microbici, quando l'agar è pronto, utilizzare un’ansa inoculante sterile per trasferire le colture sulle appropriate piastre di agar non selettivo, seminando i batteri con un tracciato che permetta l'osservazione di colonie isolate.

Dopo aver seminato tutte le colonie, incubare le colture capovolte a 35-37 gradi Celsius per un massimo di 48 ore, tranne per le specie di Campylobacter, che devono essere incubate in un barattolo con coperchio chiuso contenente una bustina gassosa per creare un ambiente microaerofilo. Osservare la morfologia delle colonie al termine dell'incubazione. Colture pure dovrebbero produrre colonie che mostrano una morfologia simile.

Per far crescere le colonie di interesse su terreni selettivi e differenziali, trasferire alcune colonie isolate in cinque millilitri di brodo appropriato e reincubare le colture a 35-37 gradi Celsius per 16-24 ore. Il giorno successivo, effettuare un’isolazione con un’ansa delle colture ottenute dopo la notte su almeno una piastra di agar TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose) e su almeno una piastra di agar cromogenico, incubando fino a 96 ore a 35-37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, esaminare sia la densità della coltura sulla piastra sia le dimensioni delle colonie isolate per determinare la crescita complessiva dei ceppi, registrando il colore delle colonie alla luce ambiente o UV, secondo necessità, e annotando ogni altra caratteristica importante delle colonie.

Per eseguire un saggio di recupero, inoculare colture giovani di Vibrio parahaemolyticus in cinque millilitri di brodo tripticaso-soia, integrato con il due percento di cloruro di sodio, o TSBS, e collocare le provette a 35-37 gradi Celsius per 16-24 ore. Il giorno successivo, vortexare le colture da incubazione notturna e preparare diluizioni da uno per 10 alla meno uno a uno per 10 alla meno sette del batterio in PBS. Utilizzando le diluizioni da uno per 10 alla meno quattro a uno per 10 alla meno sette, distribuire uniformemente 100 microlitri di ciascuna diluizione su piastre singole di agar cromogenico, TCBS e agar tripticaso-soia integrato con il due percento di cloruro di sodio, o TSAS.

Incubare tutte le piastre a 35-37 gradi Celsius per un massimo di 96 ore. Quindi contare le colonie, ignorando le piastre con colonie troppe numerose per essere contate o contenenti meno di 25 colonie. Per eseguire un saggio di competizione, selezionare una ceppo di V. Parahaemolyticus che produce le colonie turchesi previste su TCBS e colonie ciano su agar cromogenico, e un non-V.

Specie di Parahaemolytius che non cresce su nessuno dei due terreni oppure presenta un colore diverso delle colonie. Trasferire alcune colonie isolate di V. Parahaemolyticus e V. Metschnikovii da un'agare TSAS in cinque millilitri di TSBS per un'incubazione di 16-24 ore a 35-37 gradi Celsius. Trasferire alcune colonie isolate di Shigella sonnei da agar Brain Heart Infusion, o BHI, in cinque millilitri di brodo BHI per 16-24 ore a 35-37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, effettuare una diluizione seriale per ciascun ceppo, seminando le diluizioni su piastre di agar non selettivo per determinare le unità formanti colonie per millilitro delle colture notturne. Successivamente, utilizzare le colture notturne e i tubi di diluizione per miscelare diversi volumi di un ceppo di V. parahaemolyticus e di una specie non V. parahaemolyticus e distribuire 100 microlitri della miscela batterica su piastre di agar cromogenico, TCBS e TSAS singole.

Dopo un massimo di 96 ore a 35-37 gradi Celsius, contare le colonie in base alle differenze nella crescita e nella morfologia sulle piastre cromogeniche e TCBS. Per valutare gli effetti degli omogeneizzati di ostrica sulla crescita batterica su terreni selettivi e differenziali, pesare innanzitutto almeno 50 grammi di polpa di ostrica proveniente da almeno 12 molluschi, inclusa la polpa e il liquido. Successivamente, aggiungere una massa equivalente di PBS ai tessuti di ostrica e omogeneizzare la miscela ad alta velocità per 90 secondi.

Successivamente, aggiungere 100 grammi dell'omogenato di ostrica diluito a 400 grammi di PBS e omogeneizzare la miscela ad alta velocità per un minuto. Quindi, sterilizzare l'omogenato in autoclave. Dopo il raffreddamento, aggiungere 100 microlitri di ciascun ceppo di V. Parahaemolyticus e non-V. coltivati per 18-24 ore.

Aggiungere la coltura di Parahaemolyticus alla sospensione di ostrica e utilizzare un omogeneizzatore per mescolare le cellule batteriche con l'omogenato di ostrica. Preparare diluizioni da una volta 10 alla meno uno a una volta 10 alla meno tre dell'omogenato di ostrica contaminato in PBS come illustrato, distribuendo 100 microlitri di ciascuna diluizione su piastre singole di agar cromogenico, TCBS e TSAS. Dopo 96 ore a 35-37 gradi Celsius, confrontare i conteggi effettivi delle colonie sui gel di agar cromogenico e TCBS con i conteggi attesi dedotti dal conteggio standard delle piastre effettuato sulle colture notturne.

Per determinare la crescita e la morfologia delle colonie dei ceppi utilizzati in questo studio, i batteri sono stati coltivati su terreni selettivi e differenziali. Il TCBS è il mezzo convenzionale utilizzato per l'isolamento di alcune specie di Vibrio, tra cui il Vibrio parahaemolyticus di colore turchese e il Vibrio cholerae giallo. L'uso di un mezzo cromogenico per selezionare specie di Vibrio clinicamente rilevanti da campioni alimentari e ambientali porta alla formazione di colonie di Vibrio parahaemolyticus di colore ciano e di Vibrio cholerae di colore magenta.

Le colonie di V.Parahaemolyticus cresciute su piastre di agar cromogeno in presenza di omogeneizzato di ostrica sono osservate in numeri simili a quelle su mezzi non selettivi, suggerendo che il limite di rilevamento del mezzo cromogeno è paragonabile a quello dei mezzi non selettivi, anche in presenza di una matrice alimentare. Inoltre, la crescita e il recupero di V.Parahaemolyticus non sono influenzati dalla presenza di una specie non appartenente a V. Parahaemolyticus, un attributo essenziale per i mezzi differenziali e selettivi, poiché i campioni ambientali contengono diverse specie di Vibrio in elevato numero, specialmente dopo una procedura di arricchimento.

Inoltre, il confronto tra agar TCBS e agar cromogenici mediante PCR per l'emolisina termolabile rivela una maggiore sensibilità e specificità dell'agar cromogenico, indicando una prestazione complessivamente migliore di questo mezzo differenziale e selettivo per il rilevamento e l'identificazione di V. parahaemolyticus. Una volta acquisita padronanza, l'intero procedimento, compresi i tempi di analisi e di incubazione di circa 50 ceppi, può essere completato entro 30 giorni se eseguito correttamente. Durante l'esecuzione di questo procedimento, è fondamentale ricordare di etichettare scrupolosamente tutte le colture e di utilizzare sempre una tecnica asettica.

Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la PCR su colonia per rispondere a ulteriori domande, ad esempio: Questo isolato specifico possiede un gene di virulenza? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della sicurezza alimentare e della salute pubblica per studiare il rilevamento di specie di Vibrio nei molluschi e nell'ambiente estuariale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un conteggio standard su piastra e di come valutare la sensibilità, la specificità e il limite di rilevamento di un mezzo di coltura.

Ricordare che lavorare con agenti patogeni e mezzo caldo può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come indossare indumenti protettivi, coprire eventuali ferite aperte e separare i rifiuti biologicamente pericolosi devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.