Sviluppo di un più sensibile e specifica Chromogenic Agar Media per la rilevazione di Parahaemolyticus Vibrio E Altro Vibrio Specie

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la sensibilità e la specificità di un nuovo mezzo cromogenico per la capacità di rilevare e isolare Vibrio parahaemolyticus rispetto ai terreni convenzionali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia alimentare e ambientale, come ad esempio qual è la prevalenza delle specie di Vibrio negli ambienti alimentari e di raccolta? Il vantaggio principale della nostra procedura è che possono essere utilizzati molti isolati batterici, anche in presenza di una matrice alimentare.

Prima di coltivare i batteri, sterilizzare in autoclave tutto il terreno di coltura agar. Quindi raffreddare l'agar a 45-50 gradi Celsius a bagnomaria. Quando l'agar è pronto, disporre le piastre di Petri vuote in pile di cinque o sei piastre.

Quindi, partendo dal fondo della pila, versare l'agar fuso in ogni piatto fino a riempirlo circa a metà, riposizionando i coperchi dopo aver versato. Lasciare solidificare l'agar a temperatura ambiente per almeno 12 ore. Per impostare le colture di ceppi microbici, quando l'agar è pronto, utilizzare un circuito di inoculazione sterile per trasferire le colture sulle apposite piastre di agar non selettive, strisciando i batteri in uno schema che consentirà l'osservazione di colonie isolate.

Quando tutte le colonie sono state piastre, incubare le colture a testa in giù a 35-37 gradi Celsius per un massimo di 48 ore, ad eccezione delle specie di Campylobacter, che dovrebbero essere incubate in un barattolo con coperchio chiuso contenente una sacca di gas per produrre un ambiente microaerofilo. Osservare la morfologia della colonia al termine dell'incubazione. Le colture pure dovrebbero produrre colonie che mostrano una morfologia simile.

Per far crescere le colonie di interesse su terreni selettivi e differenziali, trasferire alcune colonie isolate in cinque millilitri del brodo appropriato e incubare nuovamente le colture a 35-37 gradi Celsius per 16-24 ore. Il giorno successivo, eseguire un ciclo di colture notturne su almeno una piastra di agar tiosolfato-citrato-sali biliari-saccarosio, o TCBS, e almeno una piastra di agar cromogenica per un massimo di 96 ore di incubazione a 35-37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, esaminare sia la densità di coltura sulla piastra che le dimensioni delle colonie isolate per determinare la crescita complessiva dei ceppi, registrando il colore delle colonie sotto la luce ambientale o UV, a seconda dei casi, e annotando qualsiasi altra caratteristica importante delle colonie.

Per eseguire un test di recupero, inoculare giovani colture di Vibrio parahaemolyticus in cinque millilitri di brodo di soia triptico, integrato con cloruro di sodio al due percento, o TSBS, e posizionare le provette a 35-37 gradi Celsius per 16-24 ore. Il giorno successivo, agitare le colture notturne e impostare una volta 10 a quella negativa, a una volta 10 a negativa sette diluizioni dei batteri in PBS. Utilizzando le sette diluizioni da una volta a 10 per quattro volte da una a una volta 10 per tutte le diluizioni, impiattare uniformemente 100 microlitri di ciascuna diluizione su singole piastre cromogeniche, TCBS e triptiche di soia agar integrate con agar di cloruro di sodio al due percento, o TSAS.

Incubare tutte le piastre a una temperatura compresa tra 35 e 37 gradi Celsius per un massimo di 96 ore. Quindi conta le colonie, ignorando le piastre che riportano colonie troppo numerose per essere contate o che contengono meno di 25 colonie. Per eseguire un test di competizione, selezionare un ceppo di V.Parahaemolyticus che produca le colonie di turchesi attese su TCBS e le colonie di ciano su agar cromogenico e un non-V.

Specie Parahaemolytius che non cresce su nessuno dei due terreni o mostra un colore di colonia diverso. Trasferire alcune colonie isolate di V. Parahaemolyticus e V. Metschnikovii da un'agricoltura TSAS, a cinque millilitri di TSBS per un'incubazione da 16 a 24 ore a 35-37 gradi Celsius. Trasferire alcune colonie isolate di Shigella sonnei dall'agar Brain Heart Infusion, o BHI, a cinque millilitri di brodo BHI per 16-24 ore a 35-37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, eseguire una diluizione seriale per ogni ceppo, impiattando le diluizioni su piastre di agar non selettive per determinare le unità formanti colonie per millilitro delle colture notturne. Successivamente, utilizzare le colture notturne e le provette di diluizione per mescolare diversi volumi di un ceppo di V.Parahaemolyticus e di un non-V. Parahaemolyticus e spargere 100 microlitri della miscela batterica su singole piastre di agar cromogeniche, TCBS e TSAS.

Dopo un massimo di 96 ore a 35-37 gradi Celsius, contare le colonie in base alle loro differenze di crescita e morfologia sulle piastre cromogeniche e TCBS. Per valutare gli effetti degli omogenati di ostriche sulla crescita batterica su mezzi selettivi e differenziali, pesare prima almeno 50 grammi di carne di ostrica da almeno 12 molluschi di crostacei, compresi la carne e il liquore. Quindi aggiungere una massa uguale di PBS ai tessuti dell'ostrica e frullare la miscela ad alta velocità per 90 secondi.

Successivamente, aggiungi 100 grammi di omogeneizzato di ostrica diluita a 400 grammi di PBS e frulla la miscela ad alta velocità per un minuto. Quindi autoclavare l'omogeneizzato. Dopo il raffreddamento, aggiungere 100 microlitri di ogni V.Parahaemolyticus notturno e non-V.

Coltura di parahaemolyticus al liquame di ostriche e utilizzare un omogeneizzatore per mescolare le cellule batteriche con l'omogeneizzato di ostriche. Effettuare una volta per 10 in negativo, una volta per 10 in negativo, tre diluizioni dell'omogenato di ostrica addizionata in PBS, come dimostrato, distribuendo 100 microlitri di ciascuna diluizione su singole piastre cromogeniche, TCBS e TSAS. Dopo 96 ore a una temperatura compresa tra 35 e 37 gradi Celsius, confrontare la conta effettiva delle colonie sugli agar cromogenici e TCBS con la conta delle colonie prevista dedotta dalla conta standard su piastra condotta sulle colture notturne.

Per determinare la crescita e la morfologia delle colonie dei ceppi utilizzati in questo studio, i batteri sono stati coltivati su terreni selettivi e differenziali. Il TCBS è il mezzo convenzionale utilizzato per l'isolamento di alcune specie di Vibrio, tra cui il V.Parahaemolyticus turchese e il V.Cholerae giallo. L'uso di mezzi cromogenici per selezionare specie di Vibrio clinicamente rilevanti da campioni alimentari e ambientali porta alla generazione di V.Parahaemolyticus ciano e V.Cholerae magenta.

Colonie di V. Parahaemolyticus coltivate su piastre cromogeniche di agar in presenza di omogenato di ostriche sono state osservate in numero simile a quelle su terreni non selettivi, suggerendo che il limite di rilevabilità del terreno cromogenico è simile a quello dei terreni non selettivi, anche in presenza di una matrice alimentare. Né la crescita e il recupero di V. Parahaemolyticus sono influenzati dalla presenza di un non-V. Parahaemolyticus, un attributo essenziale per i mezzi differenziali e selettivi, poiché i campioni ambientali contengono varie specie di Vibrio in numero elevato, soprattutto dopo una procedura di arricchimento.

Inoltre, il confronto tra TCBS e agar cromogenici mediante PCR con emolisina termolabile rivela una maggiore sensibilità e specificità per l'agar cromogenico, indicando una migliore prestazione complessiva per questo terreno differenziale e selettivo per la rilevazione e l'identificazione di V. Parahaemolyticus. Una volta padroneggiata, l'intera procedura, compresi i tempi di test e incubazione di circa 50 ceppi, può essere completata entro 30 giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di etichettare diligentemente tutte le colture e di utilizzare sempre la tecnica asettica.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la PCR delle colonie per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio: Questo specifico isolato è portatore di un gene di virulenza? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della sicurezza alimentare e della salute pubblica per esplorare il rilevamento delle specie di Vibrio nei molluschi e nell'ambiente degli estuari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come condurre una conta su piastra standard e come valutare la sensibilità, la specificità e il limite di rilevamento di un terreno di coltura.

Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni e mezzi caldi può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni come indossare indumenti protettivi, coprire eventuali ferite aperte e separare i rifiuti a rischio biologico.