Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di rilevare rapidamente la presenza di batteri specifici come l'e coli utilizzando nuove sonde geniche influenzali, DNA, Zyme Innanzitutto, DNA genico completo. Le sonde Zyme sono generate dalla legatura. I batteri vengono quindi coltivati per arricchire il numero di molecole bersaglio e la miscela extracellulare accumulata viene preparata dal surnatante.

La miscela extracellulare grezza viene quindi combinata con la sonda zimica del DNA, l'interazione tra la sonda dello zima del DNA e le molecole bersaglio provoca la scissione della sonda, che poi emette fluorescenza. Un'interazione fluorimetrica tra la sonda e il bersaglio è vista come un aumento della fluorescenza relativa. I risultati vengono quindi verificati mediante analisi elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla PCR o ai metodi basati su anticorpi è che la procedura è più semplice e facile da eseguire. Sebbene questo metodo sia stato sviluppato con il batterio modello e coli, può essere applicato alla rilevazione di qualsiasi altro patogeno batterico di origine alimentare o nosocomiale. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché potrebbero non essere abituate alla manipolazione di sonde di DNA sintetico e batteri A dimostrare la procedura è Sergio Aguire, un assistente di ricerca del mio laboratorio e Monso Ali, un borsista post-dottorato per questo protocollo.

Uno R-F-D-E-C è lo zima DNA in primo piano. È costituito dalla sequenza catalitica EC, una sottolineata in nero e la sequenza di substrato FS, una sottolineata in verde, contenuta all'interno del substrato è un legame RNA indicato dalla r blu, affiancato da un DT marcato con Fluor, indicato dalla F e da un DT marcato con QUENCHER, indicato dalla coda RF, SS, uno è una versione criptata di RFD EEC uno, dove la sequenza catalitica EEC uno è parzialmente mescolata in SS, ma la porzione FS rimane invariata. RF DEC one e RF SS one sono realizzati mediante legatura enzimatica mediata da stampo dell'oligonucleotide FS one con l'oligonucleotide EC one o SS one in presenza di LT one come modello di legatura per preparare miscele extracellulari grezze o cem che verranno utilizzate come bersaglio per R-F-D-E-C si inizia dispensando due millilitri di LB in provette di coltura sterili da 14 millilitri utilizzando una pistola per pipette.

Quindi, utilizzando una punta di pipetta sterile, prelevare una singola colonia di e coli da una piastra a coclea e farla cadere in una provetta di coltura contenente libbre. Posizionare le provette in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius e agitare a 250 giri/min per 14 ore dopo l'incubazione. Per generare una coltura di inoculazione all'1%re, erogare due millilitri di LB fresco in provette di coltura da 14 millilitri e aggiungere 20 microlitri della coltura batterica della fase precedente.

Incubare le provette a 37 gradi Celsius agitando a 250 giri/min fino a quando ogni soluzione batterica raggiunge un OD 600 di circa un trasferimento. Un millilitro di ogni coltura in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e pellettare le cellule mediante centrifugazione a 11.000 G per cinque minuti. Dopo la centrifuga, trasferire il surnatante limpido in una provetta fresca da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Conservare il surnatante a meno 20 gradi Celsius. Se non verrà immediatamente utilizzato per determinare se il segnale fluorescente viene generato con l'interazione degli enzimi del DNA con l'estratto di cellula grezza, i campioni vengono analizzati mediante fotometria spettrale. Accendi lo spettrofotometro fluorescente e imposta i parametri di acquisizione dati con eccitazione a 488 nanometri ed emissione a 520 nanometri.

Inoltre, impostare lo strumento per effettuare letture ogni minuto per un'ora. Lavare tre cuvette di cristallo di quarzo prima con acqua distillata deionizzata e poi con etanolo al 100%. Asciugare le cuvette facendo lampeggiare l'azoto gassoso.

Etichettare le cuvette come C, uno per il controllo uno, C due, per il controllo due e T per il test, trasferire successivamente, 24 microlitri di acqua distillata deionizzata a C uno e 24 microlitri della miscela extracellulare grezza preparata di e coli a C due e T.Aggiungere 25 microlitri di due X RB a ciascun Q vet e posizionarli nello spettrofotometro fluorescente. Iniziare a raccogliere i dati di fluorescenza dopo cinque minuti, aggiungere un microlitro di cinque micromolari RFS uno a C due e un microlitro di cinque micromolari, RFD eec uno a T e C uno assicurandosi che le letture della fluorescenza non vengano interrotte. Miscelare ciascuna soluzione mediante pipettaggio, quindi lasciare che la reazione continui per il resto del periodo di acquisizione.

Salva i dati in formato file Excel. Quindi trasferisci i dati su un personal computer e utilizza Excel per creare un'immagine grafica. Le stesse miscele di reazione utilizzate per l'analisi da Spectra.

fotometria può essere utilizzata per l'analisi mediante elettroforesi su gel. Dopo un'ora dall'acquisizione. Rimuovere le cuvette dallo spettrofotometro e trasferire le soluzioni in nuove provette per microcentrifuga.

Spegni le reazioni aggiungendo cinque microlitri di acetato di sodio a tre molari e 125 microlitri di etanolo al 100%. Mescolare ogni soluzione agitando e posizionare le provette in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per un'ora dopo la centrifuga di incubazione. La reazione mescola a 11.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius e rimuove con cura il surnatante mediante pipettaggio.

Asciugare i pellet utilizzando un concentratore di DNA per 10 minuti. Aggiungere 20 microlitri di tampone di caricamento del gel e agitare brevemente. Girare brevemente con una centrifuga da banco.

Successivamente, caricare 10 microlitri di campioni di reazione per pozzetto di gel Dage al 10% dopo la corsa. Togliere le lastre di vetro e lavare accuratamente con acqua di rubinetto. Per rimuovere eventuali pezzi di gel, pulire le piastre con una salvietta Kim.

Scansiona la piastra in gel per la fluorescenza utilizzando uno scanner per tifoni. Analizza le immagini risultanti utilizzando il software Image Quant per valutare la sensibilità del sistema. Le colture diluite in serie vengono coltivate per periodi di tempo crescenti.

Per determinare il periodo minimo di incubazione necessario per rilevare un singolo batterio, preparare 10 provette di coltura contenenti due millilitri di libbra, inoculare ciascuna coltura con 100 microlitri di due CFU per millilitro di una riserva di glicerolo di e coli e incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 250 giri/min a 4, 8, 12, 16 e 24 ore. Raccogli 300 microlitri da ciascuna delle provette di coltura inoculate poiché potrebbero non esserci batteri rilevabili per i campioni raccolti al momento. Punti 4, 8, 12.

Lasciare crescere la coltura rimanente per 24 ore al fine di identificare le colture contenenti batteri. Misurare l'OD 600 e far precipitare le cellule mediante centrifugazione a 11.000 G per cinque minuti. Trasferire il surnatante che contiene il CEMS in provette fresche da microcentrifuga da 1,5 millilitri e conservare a meno 20 gradi Celsius fino all'uso il giorno successivo.

Ispeziona le colture per la crescita. Solo una o due delle 10 colture possono contenere e coli dopo l'inoculazione e le restanti provette non conterranno alcuna cellula. Utilizzare il CEMS recuperato da colture positive nei punti temporali designati Per preparare le reazioni di clivaggio con RFD EEC one, analizzare le miscele di reazione utilizzando l'elettroforesi su gel DAGE come descritto in precedenza, sia le sonde RFD EEC one che RF SS one sono state preparate mediante legatura enzimatica delle porzioni dello zima DNA al substrato.

L'interazione FS one di CEM EEC e RFD EEC e RF SS one è stata quindi valutata mediante spettrometria. Come si può vedere qui. R-F-D-E-C one ha prodotto un alto livello di segnale fluorescente dopo l'aggiunta di CEM ec.

In netto contrasto, R FS S one non ha prodotto un forte segnale fluorescente. Da qui la funzione di produzione della fluorescenza di RFD EEC one. Al momento del contatto con CEM, la EC viene sequenziata.

Specifico per verificare che gli aumenti di fluorescenza osservati fossero dovuti alla scissione del legame RNA. Le miscele di reazione sono state analizzate mediante scissione dell'età di RFD eec, si prevede che uno per 0,25 molari di idrossido di sodio generi frammenti NA 2D, un frammento a cinque primi che trattiene il Fluor e un frammento a tre primi che trattiene il quencher. Come si può vedere qui.

La miscela di reazione RFD EEC CEM EEC ha effettivamente prodotto il prodotto di scissione atteso. Inoltre, solo UNC ha tagliato R-F-D-E-C uno e il frammento a cinque primi ha potuto essere rilevato mediante imaging a fluorescenza. Per esaminare la specificità di RFD EEC, sono stati eseguiti saggi di fluorescenza utilizzando CEMS raccolti solo da diversi altri batteri gram-negativi e gram-positivi.

Il campione contenente CEM EC ha prodotto un aumento della fluorescenza. La mancanza di reattività crociata con i CEMS degli altri batteri indica che R-F-D-E-C one è altamente selettivo per l'e coli per determinare il tempo minimo di coltura richiesto per rilevare una singola cellula di e coli, diluito a una CFU per millilitro in 100 microlitri coltivati con terreno di crescita per 4, 8, 12, 16 e 24 ore. Il CEMS risultante è stato miscelato con quello R-F-D-E-C e la scissione è stata valutata in base all'età come mostrato qui.

Un'immagine del test Dage indica che uno R-F-D-E-C non ha prodotto il prodotto di scissione atteso. Quando ha reagito con CEM. ECS raccolto a quattro e otto ore di crescita, indicando che è necessario un tempo di coltura di 12 ore Una volta padroneggiato.

Il componente chiave di questa tecnica è che il test basato sull'enzima DA può essere eseguito in 60 minuti se viene eseguito correttamente dopo questo sviluppo. La procedura ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della bioanalisi per esplorare gli enzimi del DNA allogenico per il rilevamento di un'ampia gamma di patogeni batterici.