3D Quantitative In Silico Modeling (q3DISM) di cerebrale amiloide-beta fagocitosi in roditori modelli di malattia di Alzheimer

L'obiettivo generale di questa tecnica quantitativa di modellazione 3D in silico, o q3DISM, è quantificare l'assorbimento di amiloide-beta da parte dei fagociti mononucleati nel cervello di modelli di roditori della malattia di Alzheimer. Questo metodo risponde a un'esigenza urgente nel campo della ricerca sull'Alzheimer per quantificare l'eliminazione dell'amiloide-beta che si deposita nel cervello dei pazienti di Alzheimer formando placche senili. Per la prima volta, questa tecnica consente una vera ricostruzione e quantificazione 3D dell'amiloide-beta da parte dei macrofagi in vivo Abbiamo iniziato a utilizzare il cued 3-Dism per studiare la deposizione di amiloide-beta perché avevamo bisogno di uno strumento robusto per visualizzare e quantificare la fagocitosi dei microfagi in vivo.

Questa tecnica può rivelarsi utile per testare terapie sperimentali per la malattia di Alzheimer per valutare quali farmaci stimolano i macrofagi per l'eliminazione efficiente dell'amiloide-beta. Quando i campioni di tessuto sono pronti per l'immunocolorazione, riempire la regione di tessuto circondata da una penna di barriera idrofobica con un tampone bloccante per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente in una camera umidificata. Al termine dell'incubazione, sostituire il tampone bloccante con il primo anticorpo primario di interesse durante la notte a 4 gradi Celsius nella camera umidificata.

La mattina successiva, lavare i campioni in tre bagni PBS di cinque minuti a temperatura ambiente con leggera agitazione. Dopo il terzo lavaggio, incubare i vetrini con l'anticorpo secondario fluorescente appropriato a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Dopo un'ora, lavare le sezioni altre tre volte in PBS al riparo dalla luce.

Quindi etichettare le cellule con gli altri anticorpi primari e secondari di interesse appropriati per il tessuto nei successivi due-quattro giorni, come appena dimostrato. Per colorare in modo efficiente i compartimenti cellulari e supercellulari e i depositi di beta-amiloide, è fondamentale marcare con un solo anticorpo primario alla volta seguito dal corrispondente anticorpo secondario. Un processo che richiede tempo ma che ottimizza i risultati.

Dopo l'ultimo lavaggio della colorazione con anticorpi secondari, lasciare asciugare completamente le sezioni per una notte a temperatura ambiente al buio. Quindi, coprire i campioni essiccati con un vetrino coprioggetto sigillato con un supporto di montaggio fluorescente contenente DAPI. Per visualizzare i campioni mediante microscopia confocale, selezionare l'obiettivo del microscopio 60x e aggiungere olio da immersione alla lente.

Posizionare il campione sul supporto del vetrino del tavolino del microscopio e sollevare l'obiettivo fino a quando l'olio non entra in contatto con il vetrino. Utilizzando l'illuminazione epifluorescente, regolare il piano focale per individuare le placche amiloidi nell'ippocampo o nella corteccia cerebrale. Quindi, acquisire immagini confocali dei fagociti mononucleati attivati che circondano i depositi di amiloide nell'ippocampo o nella corteccia.

Per la modellazione qualitativa 3D in silico, analizzare prima i set di dati confocali con l'elaborazione scientifica delle immagini 3D in un modulo di colocalizzazione software di analisi per la prossimità spaziale della colorazione del marcatore macrofagico attivato in tutti i piani Z contemporaneamente. Creare canali di colocalizzazione che corrispondano alla colorazione del fagolisosoma all'interno dei fagociti mononucleati attivati. Selezionare TRITC per il canale A e FITC per il canale B.In finestra Controllo modalità, selezionare Soglia.

Per le intensità di colocalizzazione, selezionare Canali sorgente. Fare clic su Modifica per selezionare il colore di colocalizzazione. Quindi regolare le soglie di ciascun canale in modo indipendente per includere la colorazione specifica ed escludere i segnali di fondo e non specifici.

I voxel colocalizzati appariranno nel colore di colocalizzazione selezionato in tutti gli z-stack contemporaneamente. Quindi, fai clic su Crea canale di colocalizzazione. Il canale di colocalizzazione creato apparirà nella finestra Regolazione schermo.

Fare clic sul canale di colocalizzazione per aprire le statistiche del canale. La percentuale di volume di materiale A sopra la soglia colocalizzata rappresenta il volume dei monociti occupato dai fagolisosomi. Utilizzando il modulo di colocalizzazione, analizzare il canale di colocalizzazione per la vicinanza spaziale con i segnali di amiloide-beta per quantificare l'amiloide-beta incapsulata all'interno dei fagolisosomi.

Selezionare il set di dati di colocalizzazione del canale A e Cy5 per il canale B e creare un canale di colocalizzazione come appena dimostrato. Fare clic sul canale di colocalizzazione per aprire nuovamente le statistiche del canale. La percentuale di volume di materiale A sopra la soglia colocalizzata rappresenta il volume fagolisosomiale occupato dall'amiloide-beta.

Utilizzando il modulo Surpass, è possibile ricostruire le pile di immagini confocali e generare modelli 3D dell'amiloide-beta incapsulata all'interno dei fagolisosomi monociti. Nella finestra Regolazione visualizzazione, selezionare TRITC per mostrare solo la colorazione dei macrofagi e fare clic su aggiungi nuova superficie" nelle proprietà del volume. In Impostazioni, nel passaggio uno dei cinque algoritmi, selezionare Superficie.

In Colore, selezionare il tipo di colore di interesse e regolare la trasparenza in base alle esigenze. Quindi seleziona la casella di selezione della regione di interesse e fai clic su Avanti. Nel passaggio due di cinque, regione di interesse, regolare le coordinate X, Y e Z per disegnare una finestra attorno alla cella di interesse e fare clic su Avanti.

Nel passaggio tre di cinque, canale sorgente, selezionare il canale sorgente TRITC e selezionare la casella Smooth. Impostare il livello di dettaglio dell'area superficiale su 0,4 micron e fare clic su Avanti. Al punto quattro di cinque, soglia, regolare la soglia in modo che il volume creato si sovrapponga perfettamente al segnale del canale TRITC e fare clic su Avanti.

Infine, nel passaggio cinque di cinque, classificare le superfici, nella sezione Tipi di filtro, selezionare gli oggetti in base alle loro dimensioni da includere o escludere dai volumi da creare. Ripetere gli stessi passaggi per creare superfici 3D per fagolisosomi con il canale FITC e amiloide-beta con il canale Cy5. Dopo la modellazione qualitativa 3D in silico, come appena dimostrato, è possibile analizzare l'assorbimento dell'amiloide-beta nei fagolisosomi dei monociti nel cervello di topi e ratti transgenici.

È interessante notare che il volume occupato dai fagolisosomi CD68 positivi è significativamente aumentato nei fagociti mononucleati Iba1 positivi, associati a, rispetto a quelli distanti dalle placche, sia nei topi che nei ratti, dimostrando che i fagociti mononucleati vicino alle placche sono pronti per la fagocitosi, rispetto alle cellule situate lontano dalle placche. E' anche degno di nota il fatto che i fagociti mononucleati associati alla placca mostrano un aumento dell'assorbimento di amiloide-beta nei topi transgenici rispetto alle cellule distanti dalle placche, mentre nei ratti transgenici si osserva complessivamente un assorbimento molto modesto di fibrille amiloide-beta, senza alcun cambiamento apparente nella fagocitosi delle fibrille amiloide-beta in funzione della distanza dalle placche. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la qualità delle immagini confocali è fondamentale e che soglie simili dovrebbero essere applicate per tutti i canali durante l'analisi di colocalizzazione.

Fin dal suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neuroinfiammazione per esplorare gli eventi fagocitici nel cervello di modelli di roditori del morbo di Alzheimer. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare le sezioni del cervello dei roditori per i fagociti mononucleati, i fagolisosomi e l'amiloide-beta. Quantificare la fagocitosi dell'amiloide-beta cerebrale in 3-D in vivo.