Modificato vetrificazione MicroSecure: Un altamente Procedura Crioconservazione sicuro ed efficace, semplice e per blastocisti umane

L'obiettivo generale del metodo di vitrificazione degli embrioni MicroSecure è quello di fornire una procedura di vitrificazione chiusa asettica sicura, semplice, ma efficace per gli embrioni umani. Questo metodo è stato sviluppato per ridurre al minimo le variabili di controllo della qualità nella vitrificazione degli embrioni umani, garantendo così un successo affidabile e riproducibile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si sforza di eliminare le variazioni tecniche tra biologi e laboratori.

La nostra tecnica è così semplice da eseguire che riteniamo che la sfida più grande per i nostri tirocinanti sia imparare a pipettare gli embrioni senza perderli. L'idea alla base del nostro metodo era quella di eliminare la necessità di dispositivi specializzati adattando due articoli comunemente usati approvati dalla FDA. Una cannuccia ionomerica etichettata internamente e un flexipet sterile.

La dimostrazione visiva di questa tecnica è estremamente utile in quanto evidenzia i suggerimenti di base che ne garantiscono il successo dell'applicazione. Prima di iniziare la procedura, posizionare la cannuccia sterile da 0,3 ml di salvietta sulla superficie in teflon dell'elettrodo di una sigillatrice a impulsi da tavolo di base, proprio davanti al tappo, per creare una tenuta interna. Premere la maniglia per attivare il calore, rilasciando la maniglia quando la luce rossa è spenta e si sente un segnale acustico.

Quindi spingere il tappo di cotone in avanti contro la guarnizione interna prima di completare la configurazione. Per la criodiluizione e il caricamento di blastocisti dei campioni, rimuovere la piastra di coltura del paziente dall'incubatore e confermare tutte le identificazioni dei campioni con una fonte secondaria. Sotto uno stereomicroscopio, utilizzare un flexipet di vitrificazione, indicato come punta vit, per spostare le blastocisti in singole goccioline di tenuta nella fila superiore di una corrispondente capsula criogenica.

Successivamente, preriempire il flexipet con 3 microlitri di soluzione V1 ed erogare metà del contenuto sul primo embrione. Aspirare l'embrione e trasferirlo nella prima gocciolina di lavaggio V1. Quindi pipettare l'embrione due o tre volte attorno al perimetro della gocciolina e rimuovere il contenuto residuo della pipetta al di fuori della gocciolina sulla superficie della piastra.

Quindi spostare la blastocisti su una singola goccia di tenuta V1 e precaricare il puntale vit con la successiva soluzione V2 prima di pipettare gli embrioni aggiuntivi con un nuovo puntale vit. Dopo aver lavato tutte le blastocisti nelle goccioline V2 e V3 come appena dimostrato, eliminare la soluzione residua e le bolle dalla punta della vit al di fuori della gocciolina di tenuta V3 e riempire completamente la punta con una soluzione V3 pulita intorno al primo embrione. Espellere circa 1 microlitro del volume e aspirare completamente la blastocisti e la restante soluzione V3 nella punta della vite.

A questo punto, rimuovere il puntale dalla pipetta e utilizzare una garza sterile per asciugare la soluzione V3 residua dalla superficie esterna del puntale vit. L'asciugatura della superficie esterna della punta è fondamentale e non comporta alcun rischio aggiuntivo di perdita di embrioni. Quindi inserire prima l'estremità della punta nell'estremità aperta della cannuccia presigillata e capovolgere la cannuccia, con l'etichetta rivolta verso il basso.

Osservare la punta sul tappo interno. Lasciare uno spazio d'aria di 1 cm sull'estremità aperta, quindi saldare in modo sicuro. Quando tutte le cannucce sono state sigillate, immergerle direttamente nell'azoto liquido in un pallone dewar in acciaio inossidabile e conservare le cannucce nel calice aperto attaccato al bastone del paziente.

Per l'eluizione e la diluizione della criosoluzione, posizionare la corrispondente piastra di diluizione a sei pozzetti al centro di un tavolino per stereomicroscopio e una piastra di Petri da 60 mm contenente un bagno riscaldante al saccarosio a 37 gradi Celsius su un lato del microscopio. Quindi, isolare la cannuccia da riscaldare e tenere il sigillo superiore della cannuccia sopra il livello del liquido per confermare l'identità del campione. Usa le forbici per maionese per fissare la cannuccia sotto il tappo interno, per mantenere la punta in vit immersa nell'azoto liquido.

Battere con decisione le forbici contro il pallone di dewar più volte per rimuovere la punta dalla parete laterale interna della cannuccia come precauzione di controllo qualità e sollevare la cannuccia nell'aria ambiente con orientamento orizzontale accanto o sotto la superficie dello stereoscopio. Afferrando l'estremità non etichettata della cannuccia, tagliare la cannuccia dal tappo interno. Quindi sollevare la cannuccia sopra la pirofila da bagno riscaldante e versare la punta in vit nella vasca con un angolo di 60 gradi, fino a quando la punta non è completamente estrusa.

La base del flexipet deve poggiare sopra la parete laterale del piatto. Dopo 5-10 secondi, trasferire la base della pipetta in un dispositivo di pipettaggio per microcapsule. Avvia un timer di cinque minuti.

Durante l'osservazione del microscopio, utilizzare un dito indice per coprire il foro del bulbo e premere delicatamente il bulbo per rilasciare la blastocisti vetrificata dalla punta della vit nel lavaggio T1. Dopo aver confermato il rilascio della blastocisti, eliminare la soluzione V3 residua e le bolle mediante pressione positiva, evacuando il contenuto al centro di un pozzetto di scarto inutilizzato. Trasferire il puntale vit su una pipetta sterber, spostando l'embrione nella seconda gocciolina T1 sotto olio per i restanti quattro minuti.

Durante l'incubazione, preriempire il flexipet con la soluzione successiva, quindi diluire la blastocisti nelle goccioline T2, 3 e 4 a intervalli di tre minuti. Infine, equilibrare le blastocisti nella gocciolina T5 per cinque minuti su una superficie di 37 gradi Celsius, prima di rimetterle nell'incubatore. Il sistema di classificazione delle blastocisti di Gardner modificato considera le blastocisti complete come aventi meno del 10% di ernia delle cellule del trofoectoderma, mentre le blastocisti con ernia fino al 50% sono classificate come espanse.

Le blastocisti che dimostrano un'ernia superiore al 50% sono considerate in fase di schiusa. Utilizzando i metodi di crioconservazione e riscaldamento dimostrati, sono stati costantemente raggiunti alti livelli di nati vivi per inizio ciclo con o senza test genetici preimpianto. Sebbene questi successi siano notevolmente superiori, utilizzando blastocisti euploidi preselezionate.

Infatti, valutando una buona popolazione di pazienti con prognosi per i soli cicli crioconservati, questi dati sul trasferimento di embrioni congelati dimostrano tassi di successo migliori rispetto alla media nazionale sia per i tassi di impianto che per i tassi di nascita vivi di oltre il 30%Trasferendo prevalentemente singole blastocisti vitrificate euploidi geneticamente testate, alcuni dei più alti tassi di impianto e tassi di nati vivi negli Stati Uniti, indipendentemente dall'età, sono stati raggiunti, rispetto alle recenti statistiche nazionali riportate dal Center for Disease Control per altre due cliniche di fertilità ben rispettate, e ai dati rilasciati dalla Society for Assisted Reproductive Technologies. La vetrificazione MicroSecure è una nuova procedura asettica sviluppata per garantire la facilità tecnica, l'affidabilità e la criosicurezza. Questo semplice sistema di vetrificazione non commerciale offre un'alternativa altamente efficace e a basso costo ai dispositivi di vetrificazione.

Sin dal suo sviluppo, il metodo MicroSecure ha garantito un recupero dell'embrione di oltre il 99,9% e una sopravvivenza completa della blastocisti di oltre il 95%. Ciò ha permesso la trasformazione della nostra pratica clinica in quasi tutti i cicli di trasferimento di embyro crioconservati negli ultimi tre anni. Abbiamo modificato efficacemente la nostra procedura per includere una guarnizione interna davanti al tappo di cotone delle paillettes ionomeriche per produrre ancora guarnizioni di saldatura affidabili e risultati eccezionali dopo il riscaldamento.

Esistono molti sistemi di dispositivi diversi utilizzati oggi nei settori delle tecnologie di riproduzione assistiva, ma nessun altro dispositivo offre la semplicità e la ripetibilità tecnica per eliminare essenzialmente la variazione dell'utente e fornire una sicurezza ottimizzata, come la vetrificazione MicroSecure.