Name: Crioconservazione di embrioni di topo da glicole etilenico-Based Vetrificazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Impara la vitrificazione con glicole etilenico per crioconservare embrioni di topo. Questo metodo semplice garantisce tassi di sopravvivenza superiori al 90% e riduce la tossicità rispetto ai crioprotettori convenzionali.

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Questo studio è stato condotto in collaborazione con il Progetto Bioresource Nazionale, il Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia, Giappone.

Lo schema generale di questo esperimento è mostrato in fig. 1. 1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Rendere il terreno base (qui in nota come PB1) in una bottiglia da 100 ml in vetro secondo la seguente tabella di seguito: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,4 </td><td> 136,98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,6 </td><td> 2,68 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1,47 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O </td><td> 358,14 </td><td> 8,04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0,49 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td glucosio></td><td> 180,2 </td><td> 5,56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Na piruvato </td><td> 110 </td><td> 0,33 </td><td> 3,6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0,9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> Penicillina G </td><td></td><td></td><td> 6,0 (circa) </td></tr></tbody></table></li><li> Rendere il Ficoll-saccarosio (FS) soluzione: <ol><li> Aggiungere le seguenti sostanze chimiche a 14 ml di PB1 soluzione, in tubo da 50 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> 3,424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42,0 mg </td></tr></tbody></table></li><li> Mescolare Ficoll 70 e saccarosio in PB1 soluzione e agitare bene fino a completo scioglimento. </li><li> Dopo aver controllato completa dissoluzione sopra, aggiungere BSA sulla superficie della soluzione e la tiene a4 ° C fino a BSA è completamente sciolto (&gt; 4 ore o durante la notte). </li></ol></li><li> Rendono la soluzione di equilibrio (EFS20) e la soluzione vetrificazione (EFS40) in una provetta da 50 ml: <ul><li> EFS20: 20% (v / v), glicole etilenico, il 24% (w / v) Ficoll, e 0,4 mol / L di saccarosio in PB1 con BSA </li><li> EFS40: 40% (v / v), glicole etilenico, il 18% (w / v) Ficoll, e 0,3 mol / L di saccarosio * in PB1 con BSA * Per gli embrioni dal ceppo BALB / c o ICR, aumentare la concentrazione di saccarosio di 0,9 mol / L di saccarosio perché sono più sensibili ai cryodamage 6. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 soluzione </td><td> EFS40 soluzione </td></tr><tr><td> Glicole etilenico </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> FS soluzione </td><td> 4 ml </td><td> 3 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Sterilizzare la soluzione per filtrazione con un filte 0,45 micronr. Fai aliquote in provette da 5 ml in polistirolo e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 6 mesi. </li><li> Preparazione della soluzione scongelamento degli embrioni contenenti saccarosio 0,75 M (TS1) <ol><li> Sciogliere 7,7 g di saccarosio in PB1 (preparato nel passo 1.1) e portare il volume complessivo di 30 ml. Mescolare agitando delicatamente fino a quando saccarosio è completamente sciolto. </li><li> Aggiungere 90 mg di BSA sulla superficie della soluzione e lasciare riposare fino a completo scioglimento. </li><li> Sterilizzare la soluzione per filtrazione. </li><li> Aliquota e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 1 mese. </li></ol> Nota: TS1 può anche essere disponibili in commercio preparati a partire da M2. <ol start="6"><li> Sciogliere 7,7 g di saccarosio in M2 e portare il volume complessivo di 30 ml. </li><li> Mescolare agitando delicatamente fino a quando saccarosio è completamente sciolto. </li><li> Sterilizzare la soluzione per filtrazione. </li><li> Aliquota e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 1 mese. </li></ol></li><li> TS2 (soluzione scongelamentocontenenti saccarosio 0,25 M): <ol><li> Diluire 10 ml TS1 con 20 ml di PB1 o M2, a seconda dei casi. </li><li> Aliquota e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 1 mese. </li></ol></li></ol> 2. Vetrificazione di 2-cell embrioni di topo <ol><li> Preparare 2-cellule da embrioni di topo accoppiamento naturale o convenzionale nelle tecniche di fecondazione in vitro. </li><li> Aliquota 50 microlitri EFS40 in un CryoTube. D'ora in poi, eseguire il resto della procedura di vetrificazione a temperatura ambiente. </li><li> Aliquota 50 ml di EFS20 sul fondo di una 35 mm o 60 mm piatto di plastica Petri. </li><li> Trasferimento fino a 30 embrioni per EFS20 utilizzando un capillare di vetro con solo la quantità minima di terreno di coltura. Avviare un timer per 2 min. Nota: gli embrioni Posizionare sul fondo della goccia. Questo rende la disidratazione efficiente degli embrioni. Controllare la morfologia degli embrioni da uno stereomicroscopio. Embrioni disidratati mostrano una morfologia rimpicciolito, come mostrato in fig. 2A.Se non sono abbastanza disidratato, attendere per più di 1 o 2 min. </li><li> A circa 1,5 minuti, raccogliere gli embrioni dal menu EFS20 con solo la quantità minima della soluzione. Trasferirli EFS40 nel CryoTube preparato in 2.1 passo. Nota: Per ottenere risultati ottimali, regolare il tempo di raccogliere gli embrioni in modo che tutti gli embrioni possono essere trasferiti in EFS40 a circa 2 min. </li><li> Attendere 1 min. </li><li> Mettere il CryoTube direttamente in azoto liquido (LN 2). </li></ol> 3. Scongelamento vetrificati 2-cell embrioni di topo <ol><li> Prima di scongelamento, preparare un piatto con 10 gocce ml di terreno di coltura degli embrioni per gli embrioni di recupero (vedi punto 3.13). Coprire il piatto con l'olio e mettere in un incubatore CO 2 fino al momento dell'uso. Nota: Anche se tutti i mezzi per la coltura degli embrioni di routine possono essere utilizzati in questo esperimento, si consiglia di media con maggiore osmolarità come medium M16. </li><li> TS1 caldo a 37 ° C. </li><li> Indossare una maschera viso e cryogloves. Aprire la LN 2 tank e recuperare un CryoTube contenente gli embrioni. </li><li> Aprire rapidamente la parte superiore del tubo ed eliminare LN 2. Attendere 30 secondi per evitare TS1 dal gelo nel passaggio successivo. </li><li> Utilizzare una pipetta 1000ul aggiungere 850 ml di TS1 (37 ° C) nella provetta e miscelare la soluzione da pipettings dolce (circa dieci volte in 25 secondi) fino a quando la soluzione è sciolto in modo uniforme. </li><li> Trasferire l'intero volume del tubo di plastica ad una parabola di 60 millimetri Petri (o un vetro da orologio) (Fig. 3A). Nota: Gli embrioni devono essere gestiti a temperatura ambiente (22-25 ° C) fino a quando non sono posti in un incubatore a CO 2 Passo 3.14. </li><li> Avviare un timer per 3 min. </li><li> A circa 2 minuti in TS1, agitare delicatamente il piatto fino a quando il supporto contenente embrioni si sviluppa sulla superficie del piatto (Fig. 3B). Nota: Questo aiuterà gli embrioni andare fino in fondo perché sono galleggianti in prossimità della superficie quando vengono trasferiti su TS1. </li><li> Mettete tre da 50 ml di gocce su TS2 °e piatto (Fig. 3C). </li><li> Dopo 3 minuti in TS1, controllare la morfologia degli embrioni da uno stereomicroscopio, ma dovrebbe essere leggermente rimpicciolito. Vedere la morfologia degli embrioni in precedenza (Fig. 2B) e più tardi (Fig. 2C) in TS1. Nota: Se gli embrioni sono ancora gonfi, tenerli in TS1 per di più 1 per 3 min. </li><li> Raccogliere gli embrioni e trasferirli la prima goccia di TS2 (Fig. 3D). Avviare un timer per 3 minuti </li><li> Dopo 3 minuti, trasferire gli embrioni per la seconda goccia e poi alla terza derivazione (Fig. 3E). </li><li> Trasferire gli embrioni al mezzo di coltura preparato a punto 3.1. Gli embrioni sono a forma mostrato in fig. 2D. </li><li> Piatto posto in un incubatore CO 2. Circa 10 minuti dopo, il trasferimento di embrioni per la caduta successiva del terreno di coltura per lavare saccarosio che è stato riportato da TS2. </li><li> Continua la cultura in un incubatore a CO2 fino al trasferimento degli embrioni. Nota: Il trasferimento Embryos alla ovidotti delle femmine destinatario il giorno del disgelo. Cultura lungo in vitro può diminuire la vitalità degli embrioni in alcuni ceppi di topi. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: In vitro - e in vivo, lo sviluppo di embrioni dopo lo scongelamento è presentato nelle tabelle 1 e 2. I vantaggi di questo protocollo sono l'elevata capacità di sopravvivenza degli embrioni dopo lo scongelamento e la sua vasta applicabilità a diversi ceppi di topi. <table border="1"><tbody><tr><td> Tensione </td><td> Numero totale di tubi </td><td> Numero di embrioni vetrificata </td><td> Recupero (N. (%)) </td><td> Morfologicamente normali (N. (%)) </td><td> Sviluppo di blastocisti (N. (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / cA </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Tabella 1. In vitro, sviluppo di vetrificati-embrioni scongelati in ceppi di topo comune <table border="1"><tbody><tr><td> Condizione di embrioni </td><td> Numero di femmine destinatario </td><td> Numero di embrioni trasferiti </td><td> Siti di impianto (n. (%)) </td><td> Vivere prole (N. (%)) </td></tr><tr><td> Fresco </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Vetrificati </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> Tabella 2. In vivo-sviluppo di vetrificati-embrioni scongelati nei topi C57BL/6J. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Lo schema complessivo dell'esperimento, comprese equilibrio, vetrificazione, e lo scongelamento degli embrioni. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. La morfologia degli embrioni in ogni fase del disgelo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Procedura di scongelamento di embrioni. Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente. (A), Aggiungere 850 ml di TS1 (37 ° C) in un CryoTube e trasferire l'intero volume della soluzione in CryoTube su un piatto di plastica. A questo punto, gli embrioni aspetto gonfio come mostrato in fig. 2B. (B), Stendere la soluzione sulla superficie del piatto da parte agitando delicatamente. (C), Place tre da 50 ml di gocce TS2 sul piatto di plastica. (D), trasferimento degli embrioni per la prima goccia di TS2. Dopo 3 minuti, gli embrioni aspetto shurunken come mostrato in fig. 2C. (E), Trasferimento li serialeLy in TS2 restanti gocce e poi al mezzo di coltura.

<ol><li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196%C2%B0+and+-269%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li>
<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196%C2%B0C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li>
<li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mamm.+Ova.+Res%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li>
<li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution%2C+without+appreciable+loss+of+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fert%22%5BJournal%5D)">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li>
<li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li>
<li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li>
<li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li>
<li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li>
<li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Dal momento che il primo rapporto di vetrificazione del mouse embrione da Rall e Fahy nel 1985 2, diversi miglioramenti tecnici sono stati fatti per aumentare la capacità di sopravvivenza degli embrioni dopo lo scongelamento. Una delle modifiche di maggior successo è stato ottenuto mediante l&#39;uso di glicole etilenico come crioprotettore a causa della sua bassa tossicità ed elevata permeabilità di membrana. Tali vantaggi ci permettono di gestire il congelamento degli embrioni a temperatura ambiente 4; metodi di vitrificazione altri richiedono embrione consegna a temperature più fredde e non sono sempre applicabili ad alcuni ceppi di topi compresi BALB / c 6. A base di glicole etilenico la prima vetrificazione è stato sviluppato da Kasai et al. nel 1990 5,7. Poiché il metodo originale è stato ottimizzato per cannucce di plastica come contenitori, abbiamo leggermente modificato il protocollo per cryotubes, che sono più facilmente accessibili in laboratorio e più resistenti ai danni fisici. Pertanto, il metodo di vetrificazione qui descritte possono essere applicable a molti laboratori usando topi come modelli di ricerca. Lo stesso metodo può essere utilizzato anche per embrioni di topo a morula e di blastocisti fasi 8 e 9 embrioni di ratto. Tuttavia, abbiamo recentemente scoperto che la qualità del cryotubes possono influenzare i tassi di sopravvivenza degli embrioni dopo il congelamento-scongelamento. Quindi, è essenziale esaminare la superficie interna del cryotubes per la sua morbidezza gli embrioni prima di vetrificazione (ad esempio, vedere tabella di reagenti e attrezzature specifiche). Metodi di vetrificazione hanno molti vantaggi rispetto ai tradizionali metodi di congelamento lento, ma di per sé hanno uno svantaggio rispetto a scopo di trasporto. Come embrioni vetrificata deve essere mantenuto al di sotto dei -120 ° C per mantenere la loro vitalità, spedizionieri a secco sono generalmente utilizzati per il loro trasporto sicuro. Spedizionieri secco sono pesanti e ingombranti, e la loro andata e ritorno è costoso, soprattutto per il trasporto internazionale. Ora siamo attualmente sviluppando un nuovo metodo di vetrificazioneche gli embrioni vetrificate possono essere conservati a temperatura di ghiaccio secco (circa -80 ° C) per almeno 7 giorni 10. Questo metodo dovrebbe essere la vetrificazione della prossima generazione.

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> Glicole etilenico </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sub&gt; O </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 media </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2 di media </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> CryoTube </td><td> Sumitomo Bakelite </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;Vial criogenici&quot; </td></tr></table>

crioconservazione di embrioni di topo da glicole etilenico-based vetrificazione

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Crioconservazione di embrioni di topo è una base tecnologica che supporta scienze biomediche, perché molti ceppi di topi sono stati prodotti da modificazioni genetiche e il numero è costantemente aumentando di anno in anno. Il suo sviluppo tecnico è iniziato con i metodi di congelamento lento nel 1970 1, seguito da metodi di vetrificazione sviluppati alla fine del 1980 2. In generale, la tecnica di questi ultimi è vantaggioso nella sua rapidità, semplicità e capacità di sopravvivenza elevato di embrioni recuperati. Tuttavia, i crioprotettori contenuti sono altamente tossici e possono influenzare il successivo sviluppo embrionale. Pertanto, la tecnica non era applicabile a alcuni ceppi di topi, anche quando le soluzioni sono raffreddato a 4 ° C per mitigare l&#39;effetto tossico durante la manipolazione degli embrioni. Al Bioresource RIKEN Center, più di 5000 ceppi di topi con differenti background genetici e fenotipi sono mantenuti 3, e quindi abbiamo ottimizzato a te vetrificazionechnique con i quali siamo in grado di crioconservare embrioni da molti diversi ceppi di topi, con i benefici di sopravvivenza dell&#39;embrione alto dopo vetrificazione e scongelamento (o liquefazione, più precisamente) a temperatura ambiente 4. Qui vi presentiamo un metodo di vetrificazione per embrioni di topo che è stato utilizzato con successo presso il nostro centro. La soluzione crioconservazione contiene glicole etilenico invece di DMSO per ridurre al minimo la tossicità di embrioni 5. Esso contiene inoltre Ficoll e saccarosio per la prevenzione delle devetrificazione e regolazione osmotica, rispettivamente. Gli embrioni possono essere gestite a temperatura ambiente e trasferiti in azoto liquido entro 5 minuti. Poiché il metodo originale è stato ottimizzato per cannucce di plastica come contenitori, abbiamo leggermente modificato il protocollo per cryotubes, che sono più facilmente accessibili in laboratorio e più resistenti ai danni fisici. Abbiamo anche descrivere la procedura di scongelamento di embrioni vetrificata nel dettaglio, perché è un critico step per il recupero efficiente dei topi vivi. Queste metodologie sarebbe utile a ricercatori e tecnici che hanno bisogno di conservazione dei ceppi di topi per un uso successivo in modo sicuro e conveniente.

Un glicole etilenico metodo basato vetrificazione per embrioni di topo è descritto. E &#39;vantaggioso per altri metodi nella sua semplicità e bassa tossicità embrionale, e quindi può essere ampiamente applicabile a molti ceppi di topi, compresi topi inbred e geni modificati.

Crioconservazione di embrioni di topo da glicole etilenico-Based Vetrificazione

La crioconservazione di embrioni di topo è una base tecnologica che supporta le scienze biomediche, poiché molti ceppi di topi sono stati prodotti tramite ingegneria genetica...

L'obiettivo generale di questa procedura è criopreservare embrioni di topo in azoto liquido e scongelarli per ottenere topi vivi. Questo viene realizzato immergendo prima gli embrioni di topo in un mezzo di equilibrazione, trasferendoli quindi in un mezzo di vitrificazione all'interno di una provetta criogenica e infine ponendoli in un serbatoio di azoto liquido. Successivamente, gli embrioni possono essere scongelati in un mezzo ad elevata osmolarità e incubati in un mezzo di coltura fino al loro trasferimento in femmine riceventi.In definitiva, i risultati mostrano una sopravvivenza di oltre il 90% degli embrioni dopo la devetrificazione, e tassi di natalità compresi tra il 30 e il 70% dopo il trasferimento embrionale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il crioprotettore permeabile glicole è meno tossico per gli embrioni rispetto ai crioprotettori convenzionali. A dimostrare la procedura sarà un tecnico del mio laboratorio prima di iniziare questo protocollo.Preparare due embrioni di topo in coltura ottenuti mediante accoppiamento naturale o tecniche convenzionali di fecondazione in vitro (FIV), trasferendoli in una provetta criogenica per la successiva conservazione; aggiungere 50 microlitri di soluzione di congelamento per embrioni EF S 40. Quindi preparare una piastra di Petri in plastica da 35 millimetri o da 60 millimetri con 50 microlitri di EFS 20 a temperatura ambiente.Utilizzare una pipetta di vetro per trasferire fino a 30 embrioni nella piastra. Avere cura di evitare il trasferimento del mezzo di coltura. Per garantire anche la disidratazione degli embrioni, posizionarli nella parte inferiore della goccia.Dopo circa 60-90 secondi, utilizzare un capillare per aspirare gli embrioni disidratati, che presentano una morfologia ridotta. Trasferire questi embrioni nella soluzione EFS all'interno della provetta criogenica, trasferendo il minor quantitativo possibile di EFS 20.Dopo il trasferimento degli embrioni, lasciarli assestare nell'EFS 40 per un minuto prima di congelarli in azoto liquido. Prima della scongelazione, posizionare in una piastra da coltura almeno due gocce di 10 microlitri di mezzo di coltura per embrioni ad elevata osmolarità, come il mezzo M 16. Quindi ricoprire completamente le gocce con olio siliconico o minerale e collocare la piastra in un incubatore a anidride carbonica fino all'uso.Successivamente, riscaldare la soluzione TS one a 37 gradi Celsius indossando una maschera facciale e guanti da criogenia. Recuperare gli embrioni dal serbatoio di azoto liquido. Aprire ora rapidamente la provetta criogenica e smaltire qualsiasi azoto liquido nel serbatoio o in un contenitore appropriato.Quindi attendere 30 secondi. Aggiungere ora 850 microlitri di soluzione TS uno calda al tubo criogenico. Aspirare e rilasciare delicatamente la soluzione circa 10 volte in modo che si sciolga uniformemente.Quindi trasferire l'intero volume in una piastra di Petri di plastica da 60 millimetri. Oppure, su un vetrino, attendere tre minuti affinché gli embrioni si equilibrino alla temperatura ambiente, dove dovranno rimanere per il resto della procedura. Non utilizzare dispositivi di riscaldamento.Esaminare rapidamente gli embrioni nella piastra al microscopio stereoscopico per osservarne l'aspetto all'inizio dell'incubazione. Dopo circa due minuti di incubazione, far sedimentare gli embrioni agitando delicatamente la piastra finché il mezzo non si sarà distribuito sulla superficie. Nell'ultimo minuto di incubazione, depositare tre gocce separate da 50 microlitri di soluzione TS due nella piastra.Trascorsi i tre minuti, utilizzare un microscopio stereoscopico per verificare che gli embrioni si siano leggermente ridotti. Se gli embrioni sono ancora gonfi, proseguire l'incubazione per uno o tre minuti aggiuntivi. A questo punto, raccogliere gli embrioni con una pipetta di vetro e trasferirli alla prima goccia di TS due.Attendere tre minuti e trasferire gli embrioni nella seconda goccia. Successivamente, trasferirli nella terza goccia. Infine, recuperare la piastra con il mezzo per embrioni preparata e conservata nell'incubatore, e utilizzare una capillare di vetro per trasferire gli embrioni nella prima goccia del mezzo.Se osservati al microscopio stereoscopico, gli embrioni dovrebbero ripristinare lentamente la loro morfologia normale. A questo punto, rimettere la piastra nell'incubatrice per circa 10 minuti. Successivamente, lavare via il saccarosio trasferito dal TS due.Spostare gli embrioni nella successiva goccia di mezzo di coltura. Continuare la coltura degli embrioni nell'incubatore a CO2 fino al loro trasferimento nell'utero di femmine riceventi. Dopo la vitrificazione e il recupero di tra 300 e 480 embrioni di tre ceppi diversi di topi, la sopravvivenza è stata molto elevata.Dopo il scongelamento, la frazione di embrioni che mostravano una morfologia normale era compresa tra il 93 e il 99% e almeno l'84% di tali embrioni si sviluppava in blastocisti. Non dimenticare che lavorare con azoto in fuga può essere estremamente pericoloso e che è necessario adottare precauzioni per evitare il contatto diretto e ridurre al minimo l'esposizione a breve distanza alla fuoriuscita. L'azoto deve essere sempre manipolato seguendo questa procedura.

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In questo video-articolo vi presentiamo un passo-passo dimostrazione su come raccogliere e crioconservare gli ovociti di criceto con elevate post-disgelo tassi di sopravvivenza. La stessa procedura può anche essere applicato con successo per congelare e scongelare embrioni di topo a diversi stadi di sviluppo preimpianto.

Raccolta e Crioconservazione degli ovociti e di embrioni di topo criceto

Preimpianto degli embrioni possono essere crioconservati dopo l'inserimento in una soluzione ipertonica crioprotettivi a causare disidratazione cellulare. Dopo equilibrio, la formazione di cristalli di ghiaccio è indotta nella soluzione che circonda l'embrione. Disidratazione ulteriore verifica come l'embrione è lentamente raffreddato a temperature sotto lo zero prima di tuffarsi in azoto liquido per la conservazione.

Crioconservazione di embrioni preimpianto di bovini, ovini, e caprini

Qui mostriamo il nuovo • I kit per la crioconservazione degli spermatozoi Cryo mouse. Stadio di due cellule sviluppo dell'embrione con decongelati sperma era migliorato costantemente in 5 ceppi di topi con l'utilizzo di questo kit. Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topi geneticamente modificati sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi con la Cryo • I kit e poi recuperato con successo da fecondazione in vitro.

Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo

In questo video, descriviamo la procedura per la vitrificazione degli embrioni di coniglio raccolti allo stadio di sviluppo desiderato utilizzando glicole etilenico e dimetilsolfossido come crioprotettori e paglia criogenica come sistema di trasporto. Gli embrioni vitrificati hanno un alto tasso di sopravvivenza e possono essere conservati per un periodo prolungato fino all'uso.

Vitrificazione di embrioni di coniglio con paglia criogenica: una tecnica di raffreddamento ultrarapido per conservare embrioni di coniglio per la conservazione a lungo termine

Questo video mostra la procedura per lo scongelamento degli embrioni di coniglio vitrificati e i passaggi di misurazione precauzionale per un recupero ottimale degli embrioni.

Scongelamento degli embrioni di coniglio: una procedura di riscaldamento per recuperare embrioni di coniglio crioconservati per il trasferimento degli embrioni

Utero-tubarico trasferimento di embrioni utilizza la giunzione utero-tubarica come barriera per impedire la fuoriuscita embrione che si può verificare quando si esegue il trasferimento uterino. Maschi vasectomized sono tenuti ad ottenere destinatari pseudopregnant per il trasferimento di embrioni. Entrambe le tecniche sono discusse.

Trasferimento di Embrione utero-tubarica e vasectomia nel modello murino

MicroSecure Vitrification è stato sviluppato come un sistema di vitrificazione chiuso asettico non commerciale, conforme alle buone pratiche di produzione e manipolazione dei tessuti della FDA. A causa del ritiro dall'industria delle paillettes per embrioni ostruite idrofobiche, la procedura di vitrificazione è stata modificata per includere un sigillo interno prima del tappo di cotone interno standard.

Modificato vetrificazione MicroSecure: Un altamente Procedura Crioconservazione sicuro ed efficace, semplice e per blastocisti umane

Le tecniche di riproduzione assistita (ARTs) sono in continua valutazione per migliorare i risultati e ridurre i rischi associati. Questo manoscritto descrive una procedura di trasferimento dell'embrione minimamente invasiva con un efficiente protocollo di crioconservazione che consente l'uso di conigli come modello animale ideale di riproduzione umana.

Trasferimento embrionale minimamente invasivo e vetrificazione embrionale nella fase embrionale ottimale nel modello Rabbit

Qui presentiamo un protocollo time-lapse morfometrica per seguire l'intensità della contrazione di blastocisti e re-espansione durante gli interventi di previtrification ed il recupero post-riscaldamento. L'applicazione del protocollo è possibile in vitro fertilizzazione laboratori attrezzati con microscopi time-lapse e raccomanda lo sviluppo di un metodo di vitrificazione blastocisti ottimale.

Morfometrica protocollo per la valutazione obiettiva dei blastocisti comportamento durante la vetrificazione e passaggi scaldavivande

Qui presentiamo un metodo modificato per la crioconservazione di embrioni unicellulari, nonché un protocollo che afcoppia l'uso di embrioni congelato ed elettroporazione per la generazione efficiente di topi geneticamente modificati.

Uso di embrioni congelati per la produzione ad alta efficienza di topi geneticamente modificati

Qui presentiamo il protocollo Spatola Montevideo per la vitrificazione di embrioni preimpianto di topi e pecore, che consiste in una spatola fatta in casa e utilizza soluzioni fatte in casa. Gli embrioni vengono rapidamente equilibrati in due soluzioni crioprotettive a concentrazione crescente, caricati sulla spatola, immersi in azoto liquido e infine sigillati con una cannuccia da 0,5 mL.

Spatola Montevideo Dispositivo per la vitrificazione di embrioni di mammiferi

Impara la vitrificazione con glicole etilenico per crioconservare embrioni di topo. Questo metodo semplice garantisce tassi di sopravvivenza superiori al 90% e riduce la tossicità rispetto ai crioprotettori convenzionali.

Crioconservazione di embrioni di topo da glicole etilenico-Based Vetrificazione

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