Crioconservazione di embrioni di topo da glicole etilenico-Based Vetrificazione

L'obiettivo generale di questa procedura è crioconservare gli embrioni di topo in azoto liquido e scongelarli per il recupero di topi vivi. Ciò si ottiene immergendo prima gli embrioni di topo in un mezzo di equilibrio, trasferendoli in un mezzo di vitrificazione in una provetta criogenica e quindi mettendoli in un serbatoio di azoto liquido. Gli embrioni successivi possono essere scongelati in un terreno ad alta osmotizzazione e incubati in terreno di coltura fino a quando non vengono trasferiti nelle femmine riceventi.

In definitiva, i risultati mostrano una sopravvivenza di oltre il 90% degli embrioni dopo lo scongelamento della vitrificazione e tassi di natalità tra il 30 e il 70% dopo il trasferimento dell'embrione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il glicole crioprotettore permeabile è meno tossico per gli embrioni rispetto al crioprotettore convenzionale. A dimostrare la procedura sarà un tecnico del mio laboratorio Prima di iniziare questo protocollo.

Preparare due embrioni di topo cellulare in coltura ottenuti mediante accoppiamento naturale o tecniche di fecondazione in vitro convenzionali in una provetta criogenica per l'eventuale conservazione, aggiungere 50 microlitri di soluzione di congelamento degli embrioni EF S 40. Quindi preparare una capsula di Petri di plastica da 35 millimetri o 60 millimetri con 50 microlitri di temperatura ambiente. EFS 20.

Utilizzare un capillare di vetro per trasferire fino a 30 embrioni nel piatto. Fare attenzione a non trasferire il terreno di coltura. Inoltre, per garantire la disidratazione degli embrioni, posizionarli sul fondo della goccia.

Dopo circa 60-90 secondi, utilizzare un tubo capillare per prelevare gli embrioni disidratati. Con una morfologia rimpicciolita. Spostare questi embrioni nella soluzione EFS nella provetta criogenica, trasferendo la minor quantità possibile di EFS 20.

Una volta trasferiti gli embrioni, lasciarli riposare nell'EFS 40 per un minuto prima di congelarli in azoto liquido. Prima di scongelare gli embrioni, mettere in una piastra di coltura almeno due gocce di terreno di coltura embrionale ad alta osmolarità da 10 microlitri, come il terreno M 16. Quindi coprire completamente le gocce con silicone o olio minerale e posizionare il piatto in un incubatore ad anidride carbonica fino al momento dell'uso.

Quindi, riscalda la soluzione TS one a 37 gradi Celsius indossando una maschera facciale e guanti criogenici. Recupera gli embrioni dal serbatoio di azoto liquido. Ora apri rapidamente il tubo criogenico e getta l'azoto liquido nel serbatoio o in qualsiasi contenitore appropriato.

Quindi attendi 30 secondi. Ora aggiungi 850 microlitri di soluzione calda TS one al tubo criogenico. Aspirare delicatamente e abbattere la soluzione circa 10 volte in modo che si dissolva uniformemente.

Quindi trasferire l'intero volume in una piastra di Petri di plastica da 60 millimetri. Oppure guarda il vetro, attendi tre minuti affinché gli embrioni si equilibrino a temperatura ambiente dove dovrebbero rimanere per il resto della procedura. Non utilizzare un dispositivo di riscaldamento.

Esamina rapidamente gli embrioni nella capsula sotto uno stereomicroscopio per sapere come appaiono all'inizio di questa incubazione. Dopo circa due minuti di incubazione, affondare gli embrioni agitando delicatamente la piastra fino a quando il terreno non si è distribuito sulla superficie della capsula. Nell'ultimo minuto dell'incubazione, espellere tre gocce separate da 50 microlitri di soluzione TS two in un piatto.

Trascorsi i tre minuti, utilizzare uno stereomicroscopio per verificare che gli embrioni si siano leggermente rimpiccioliti. Se gli embrioni sono ancora gonfi, continuare l'incubazione per uno o tre minuti. Ora, raccogli gli embrioni con un capillare di vetro e trasferiscili nella prima goccia di TS due.

Attendi tre minuti e trasferisci gli embrioni nella seconda goccia. Seguito dal terzo drop. Infine, recupera il piatto di terreno embrionale preparato e conservato nell'incubatrice e usa un capillare di vetro per trasferire gli embrioni nella prima goccia del terreno.

Se esaminati sotto uno stereoscopio, gli embrioni dovrebbero recuperare lentamente la loro normale morfologia. Ora, rimetti il piatto nell'incubatrice per circa 10 minuti. Quindi lavare via il saccarosio che è stato portato da TS due.

Spostare gli embrioni nella goccia successiva di terreno di coltura. Continua a coltivare gli embrioni nell'incubatore a CO2 fino a quando non vengono trasferiti nella cu delle femmine riceventi. Dopo la vitrificazione e il recupero di 300-480 embrioni di tre diversi ceppi di topo, la sopravvivenza era molto elevata.

Dopo lo scongelamento, la frazione di embrioni che mostravano una morfologia normale era compresa tra il 93 e il 99% e di questi embrioni almeno l'84% si è sviluppato in cisti blastiche. Non dimenticare che lavorare con l'azoto che perde può essere estremamente pericoloso e le precauzioni per evitare il contatto diretto e ridurre al minimo l'esposizione a breve distanza alle perdite. L'azoto deve essere sempre assunto eseguendo questa procedura.