Alta risoluzione Quantitative Synaptic Proteome profiling di cervello di topo Regioni Dopo uditiva discriminazione Learning

L'obiettivo generale di questo approccio proteomico è la caratterizzazione della riorganizzazione molecolare delle sinapsi dopo l'apprendimento e la formazione della memoria per comprendere i meccanismi di base e le vie di segnalazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è un approccio privo di ipotesi, che consente la quantificazione e la caratterizzazione su larga scala della post-traduzione e delle modifiche all'interno dei proteomi sinaptici. Il nostro flusso di lavoro consolidato consente una correlazione tra un determinato cambiamento molecolare e un particolare comportamento.

L'apprendimento e la formazione della memoria si basano sui cambiamenti dell'efficacia sinaptica e quindi gli studi proteomici dovrebbero concentrarsi maggiormente sull'analisi delle strutture sinaptiche come i sinaptosomi piuttosto che sugli omogeneizzati del tessuto cerebrale. I risultati della proteomica rappresentano set di dati altamente complessi, pertanto richiedono un'elaborazione bioinformativa. Inizia l'addestramento posizionando il mouse di prova in una scatola shuttle scarsamente illuminata all'interno di una camera insonorizzata.

Utilizza un programma di apprendimento completamente controllato dal computer per l'apprendimento della discriminazione uditiva. Inizia con un periodo di assuefazione di tre minuti di silenzio prima di iniziare la sessione di allenamento. Durante le prove di go, l'animale deve attraversare l'ostacolo entro sei secondi dalla presentazione del tono per mettere a segno un colpo.

Durante le prove no-go, l'animale deve rimanere nello scomparto corrente della scatola della navetta durante i sei secondi di presentazione del tono. Esegui 30 prove in movimento e 30 prove senza passaggio in un ordine pseudo-randomizzato, con un intervallo tra le prove di 20 secondi in modo che una sessione sia composta da 60 prove e duri circa 25 minuti. Una volta eseguite tutte le prove, riporta il topo addestrato nella gabbia di casa fino al sacrificio.

Dopo aver sacrificato il topo e rimosso il cervello, localizza la corteccia uditiva utilizzando punti di riferimento visivi, inclusi i vasi sanguigni e la forma della superficie. Quindi usa un bisturi e un ago per sezionare bilateralmente la corteccia uditiva come un blocco di tessuto rettangolare. Usando il chiasma opticum come punto di riferimento, seziona la corteccia frontale come una fetta di cervello tra Bregma 3.56 e 1.54.

Sezionare lo striato come una fetta di cervello tra Bregma 1,54 e 0,5. E rimuovere con cura il tessuto corticale. Sezionare l'ippocampo stabilizzando il cervello con l'ago attraverso il cervelletto e srotolando la corteccia a partire dal lobo occipitale.

Campioni di cervello sezionati con congelamento rapido in azoto liquido. Iniziare la purificazione dei sinaptosomi trasferendo il tessuto cerebrale sezionato in recipienti di omogeneizzazione contenenti un millilitro di tampone ghiacciato A.Quindi omogeneizzare il tessuto a 900 giri/min utilizzando circa 12 colpi. Centrifugare i campioni a 1.000 volte G per 10 minuti.

Dopo la centrifugazione, trattenere i surnatanti. Omogeneizzare nuovamente il pellet come prima e combinare i surnatanti. Centrifugare i surnatanti combinati per 20 minuti a 12.000 volte G.Risospendere i pellet in un millilitro di tampone di omogeneizzazione e omogeneizzare con sei colpi a 900 giri/min seguiti da centrifugazione a 1.200 volte G per 20 minuti.

Durante la centrifugazione per produrre i pellet P2, preparare gradienti di gradini di saccarosio in provette per ultracentrifuga. Iniziare con 2,5 millilitri di tampone di saccarosio molare da 1,0 molari e quindi utilizzare una pipetta di vetro Pasteur per sovrapporre 1,5 millilitri di tampone di saccarosio da 1,2 molari. Dopo la centrifugazione, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di saccarosio molare 0,32 molari ai pellet P2.

Quindi omogeneizzare nuovamente utilizzando sei tempi. Caricare le frazioni omogeneizzate sopra i gradienti. Posizionare i gradienti caricati in un rotore a secchiello oscillante e quindi centrifugare a 85.000 volte G per due ore in un'ultracentrifuga.

Una volta completata la centrifugazione, scartare lo strato superiore di saccarosio molare da 0,32 molari, compreso il materiale all'interfaccia con il tampone di saccarosio molare da 1,0 molari. Raccogliere i sinaptosomi all'interfaccia del tampone di saccarosio da uno a 1,2 molari. Aggiungere 0,32 molari di tampone di saccarosio alla frazione sinaptosomica in un rapporto di 1,1.

Mescolare accuratamente e centrifugare a 150.000 volte G per un'ora. I sinaptosomi si trovano nel pellet e possono essere ri-sospesi in un tampone per un'ulteriore elaborazione. Sciogliere i sinaptosomi di ciascuna area cerebrale di un animale in 20-50 microlitri di urea 8 molari incubando su ghiaccio per un'ora in un bagno ad ultrasuoni.

Diluire con l'uno per cento di un detergente rimovibile per garantire una concentrazione finale di urea di due molari. Dopo aver determinato le quantità relative di proteine utilizzando SDS-PAGE, pipettare un terzo del resto di ciascun campione in una nuova provetta. Eseguire il digest in soluzione aggiungendo due millimolari DTT e 25 millimolari di bicarbonato di ammonio e agitare delicatamente il campione.

Ridurre i campioni per 45 minuti a 20 gradi Celsius. Aggiungere 10 millimolari di iota acedomide ai residui di cisteina carbamidometilato e mescolare. Incubare per 30 minuti al buio a 20 gradi Celsius.

Infine, aggiungere un microlitro di una soluzione madre di tripsina e incubare a 20 gradi Celsius per 12 ore. Per rimuovere il detergente acido-scissibile, aggiungere acido trifluoroacetico a una concentrazione finale dell'uno per cento e incubare per un'altra ora a 20 gradi Celsius. Dopo aver centrifugato i campioni a 16.000 volte G per 10 minuti, raccogliere con cura i surnatanti.

Posizionare la colonna di estrazione in fase solida in una griglia ed equilibrare la matrice con due millilitri di metanolo. Dopo il lavaggio, aggiungere altri due millilitri di tampone B e caricare il campione. Dopo aver lavato tre volte con il tampone B, eluire i peptidi aggiungendo 200 microlitri di acetonitrile al 70% e acido trifluoroacetico allo 0,1%.

Quindi essiccare i campioni purificati in una centrifuga sottovuoto. In questo esempio, gli animali addestrati per l'attività di discriminazione dei toni FM mostrano un tasso crescente di colpi e un tasso decrescente di falsi allarmi nel corso delle sessioni di addestramento. Una discriminazione significativa si verifica a partire dalla quarta sessione.

Le abbondanze sinaptiche relative delle proteine selezionate sono state confrontate tra topi addestrati sul compito di discriminazione del tono FM e topi di controllo naïve 24 ore dopo la prima sessione di addestramento. Dopo l'allenamento, i livelli della proteina CYFP2 sono alterati in tutte le regioni studiate. Non dimentichiamo che gli animali spesso mostrano variabilità spesso intra-individuali.

Pertanto, si raccomanda vivamente di includere nello studio almeno cinque o più repliche biologiche di gruppi di animali ben abbinati. Una volta stabilita, questa tecnica può essere facilmente adattata ad altre specie. Ad esempio, è stato utilizzato per monitorare i cambiamenti di espressione proteica dipendenti dall'apprendimento nel cervello di un singolo moscerino della frutta.