Alta risoluzione Quantitative Synaptic Proteome profiling di cervello di topo Regioni Dopo uditiva discriminazione Learning

L'obiettivo generale di questo approccio proteomico è la caratterizzazione del riassetto molecolare a livello delle sinapsi dopo la formazione dell'apprendimento e della memoria, al fine di comprendere i meccanismi di base e le vie di segnalazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è rappresentato da un approccio privo di ipotesi, che consente la quantificazione e la caratterizzazione su larga scala delle modifiche post-traduzionali all'interno dei proteomi sinaptici. Il nostro protocollo consolidato permette di stabilire una correlazione tra un determinato cambiamento molecolare e un comportamento specifico.

L'apprendimento e la formazione della memoria si basano su cambiamenti dell'efficacia sinaptica e pertanto gli studi proteomici dovrebbero concentrarsi maggiormente sull'analisi di strutture sinaptiche come i sinaptosomi piuttosto che su omogenati di tessuto cerebrale. I risultati proteomici rappresentano dataset altamente complessi e richiedono quindi un'elaborazione bioinformatica. Iniziare l'addestramento posizionando il topo in esame in una scatola shuttle illuminata debolmente all'interno di una camera insonorizzata.

Utilizzare un programma di apprendimento completamente controllato dal computer per l'apprendimento della discriminazione uditiva. Iniziare con un periodo di abituazione di tre minuti di silenzio prima di iniziare la sessione di allenamento. Durante le prove di tipo "go", l'animale deve superare l'ostacolo entro sei secondi dalla presentazione del tono per ottenere un successo.

Nelle prove di tipo no-go, l'animale deve rimanere nel compartimento attuale della scatola di trasferimento per tutta la durata dei sei secondi di presentazione del tono. Eseguire 30 prove di tipo go e 30 prove di tipo no-go in un ordine pseudo-randomizzato, con un intervallo inter-trial di 20 secondi, in modo che una sessione consista di 60 prove e duri circa 25 minuti. Al termine di tutte le prove, restituire il topo addestrato alla gabbia di mantenimento fino al sacrificio.

Dopo aver sacrificato il topo e rimosso il cervello, localizzare la corteccia uditiva utilizzando punti di riferimento visivi come i vasi sanguigni e la forma della superficie. Quindi utilizzare un bisturi e un ago per dissezionare bilateralmente la corteccia uditiva sotto forma di un blocco di tessuto rettangolare. Utilizzando il chiasma ottico come punto di riferimento, dissezionare la corteccia frontale come una sezione cerebrale compresa tra Bregma 3,56 e 1,54.

Dissezionare lo striato come fetta cerebrale compresa tra bregma 1,54 e 0,5. Rimuovere con attenzione il tessuto corticale. Dissezionare l'ippocampo stabilizzando il cervello con l'ago attraverso il cervelletto e srotolando la corteccia a partire dal lobo occipitale.

Congelare rapidamente i campioni di tessuto cerebrale prelevati in azoto liquido. Iniziare la purificazione dei sinaptosomi trasferendo il tessuto cerebrale dissezionato in vasi di omogeneizzazione contenenti un millilitro di Buffer A freddo di ghiaccio. Quindi omogeneizzare il tessuto a 900 giri al minuto utilizzando circa 12 passaggi. Centrifugare i campioni a 1.000 ×g per 10 minuti.

Dopo la centrifugazione, conservare i soprannatanti. Risospendere il pellet come in precedenza ed unire i soprannatanti. Centrifugare i soprannatanti combinati per 20 minuti a 12.000 ×g. Risospendere i pellet in un millilitro di tampone di omogeneizzazione ed omogeneizzare con sei passaggi a 900 giri/min, seguiti da centrifugazione a 1.200 ×g per 20 minuti.

Durante la centrifugazione per ottenere i pellet P2, preparare gradienti a step di saccarosio in provette per ultracentrifuga. Iniziare con 2.5 millilitri di tampone di saccarosio 1,0 M e quindi utilizzare una pipetta Pasteur di vetro per stratificare 1,5 millilitri di tampone di saccarosio 1,2 M. Al termine della centrifugazione, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di saccarosio 0,32 M ai pellet P2.

Quindi re-omogenizzare utilizzando sei passaggi. Caricare le frazioni omogeneizzate sulla sommità dei gradienti. Posizionare i gradienti caricati in un rotore a cestelli oscillanti e centrifugare a 85.000 × g per due ore in un ultracentrifugo.

Al termine della centrifugazione, scartare il livello superiore di saccarosio 0,32 molare, compreso il materiale presente all'interfaccia con il tampone di saccarosio 1,0 molare. Raccogliere i sinaptosomi all'interfaccia tra il tampone di saccarosio 1,0 e 1,2 molare. Aggiungere il tampone di saccarosio 0,32 molare alla frazione sinaptosomica in un rapporto di 1,1.

Mescolare accuratamente e centrifugare a 150.000 ×g per un'ora. I sinaptosomi si trovano nel pellet e possono essere risospesi in un buffer per ulteriori lavorazioni. Dissolvere i sinaptosomi di ciascuna area cerebrale di un animale in 20-50 microlitri di urea 8 M, incubando sul ghiaccio per un'ora in un bagno ad ultrasuoni.

Diluire con l'uno percento di un detergente rimovibile per ottenere una concentrazione finale di due molarità di urea. Dopo aver determinato le quantità relative di proteine mediante SDS-PAGE, trasferire con pipetta un terzo del resto di ciascun campione in un tubo fresco. Eseguire la digestione in soluzione aggiungendo DTT 2 millimolare e bicarbonato di ammonio 25 millimolare, quindi vortexare delicatamente il campione.

Incubare i campioni per 45 minuti a 20 gradi Celsius. Aggiungere 10 millimolari di iodoacetamide per carbamidometilare i residui di cisteina e mescolare. Incubare per 30 minuti al buio a 20 gradi Celsius.

Infine, aggiungere un microlitro di una soluzione madre di tripsina e incubare a 20 gradi Celsius per 12 ore. Per rimuovere il detergente scindibile in ambiente acido, aggiungere acido trifluoroacetico fino a una concentrazione finale dell'uno percento e incubare per un'ulteriore ora a 20 gradi Celsius. Dopo aver centrifugato i campioni a 16.000 ×g per 10 minuti, raccogliere con attenzione i soprannatanti.

Posizionare la colonna di estrazione in fase solida su un supporto ed equilibrare la matrice con due millilitri di metanolo. Dopo il lavaggio, aggiungere ulteriori due millilitri di Buffer B e caricare il campione. Dopo aver lavato tre volte con Buffer B, eluire i peptidi aggiungendo 200 microlitri di acetonitrile al 70 percento e acido trifluoroacetico allo 0,1 percento.

Quindi asciugare i campioni purificati in un centrifugo sotto vuoto. In questo esempio, gli animali addestrati al compito di discriminazione del tono FM mostrano un aumento progressivo della percentuale di risposte corrette e una diminuzione della percentuale di falsi allarmi nel corso delle sessioni di addestramento. Una discriminazione significativa si osserva a partire dalla quarta sessione.

Le abbondanze sinaptiche relative di proteine selezionate vengono confrontate tra topi addestrati al compito di discriminazione del tono FM e topi di controllo naïve, 24 ore dopo la prima sessione di addestramento. Dopo l'addestramento, i livelli della proteina CYFP2 risultano modificati in tutte le regioni studiate. Non dimenticare che gli animali spesso mostrano variabilità intra-individuali.

È quindi fortemente raccomandato includere almeno cinque o più replicati biologici di gruppi animali ben abbinati nello studio. Una volta stabilita, questa tecnica può essere facilmente adattata ad altre specie. Ad esempio, è stata utilizzata per monitorare i cambiamenti nell'espressione proteica dipendenti dall'apprendimento nei singoli cervelli di moscerini della frutta.