Name: Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Scopri come quantificare la distribuzione eterogenea di proteine sinaptiche nel cervello del mouse mediante immunofluorescenza e microscopia confocale. Questo metodo utilizza rapporti di intensità per analisi affidabili.

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Ringraziamo Irmgard Weiss per l'eccellente assistenza tecnica. Gli autori riconoscono supporto da Hermes Pofantis e Andoniya Petkova. Gli autori ringraziano anche l'Istituto europeo di Neuroscienze per l'utilizzo del LSM800 e assistenza tecnica, soprattutto da Dr. Nils Halbsgut. Questo lavoro è stato finanziato all'University Medical Center Gottinga. JSV riconosce sostegno dal centro per microscopia su scala nanometrica e fisiologia molecolare del cervello (CNMPB).

Questo protocollo non comporta esperimenti su animali vivi. Gli esperimenti che coinvolgono eutanasia degli animali per ottenere campioni del cervello sono stati approvati dalle autorità locali di protezione animale (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sotto il numero di omologazione T 10/30.
Nota: Per questo protocollo, sono stati utilizzati topi C57BL/6 3 maschio adulto.
1. preparazione del campione
<ol><li>Preparare il fissativo e tampone fosfato 0,1 M (PB; si veda tabella 1).</li>
	<li>Difficoltà l'animale mediante perfusione perfusione come descritto in Gage et al. 28. in primo luogo lavare il sangue con 0,9% NaCl-soluzione, quindi irrorare con 30 mL di paraformaldeide al 4% (PFA).</li>
	<li>Aprire il cranio con le forbici e isolare accuratamente il cervello utilizzando un cucchiaio con spigoli arrotondati per evitare di danneggiare il tessuto.</li>
	<li>Riempire una provetta di reazione da 50 mL con fissativo e postfix il cervello nel 4% PFA a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>Rimuovere il fissativo e lavare il cervello in 50 mL di PB 0,1 M su un agitatore per 30 min.</li>
	<li>Dopo il lavaggio, incubare il cervello in un tubo di reazione da 50 mL in 30% di saccarosio in PB 0,1 M per 48 h o fino a quando non si affonda nel tubo a 4 ° C per crioprotezione.</li>
	<li>Tagliare il cervello di crioprotetti con una lama affilata, collocarlo in un cryomold e incorporarlo con temperatura di taglio ottimale (OCT) composto. Evitare le bolle. Orientare il cervello e congelare il cryomold nel congelatore-80 ° C.</li>
	<li>Montare il tessuto congelato per il sezionamento. Equilibrare il tessuto alla temperatura cryomicrotome per almeno 15 min prima di sezionamento.</li>
	<li>Sezione del cervello a 25 µm spessore fette coronali. Toccare il OCT attentamente con un gancio di vetro senza toccare il tessuto cerebrale. Raccogliere 3 fette adiacenti per pozzetto in un piatto ben 24 e archiviarli in PB 0,1 M a 4 ° C fino a colorazione. Nota: Il protocollo può essere sospeso qui per fino a due settimane. Tempi di conservazione più lungo possono interferire con la qualità del tessuto e quindi influenzare il risultato dell'esperimento.</li>
</ol>2. immunofluorescenza
<ol><li>Preparare soluzioni tra cui il tampone bloccante, il buffer di anticorpo, lavaggio buffer 1 e tampone di lavaggio 2 (Vedi tabella 1).</li>
	<li>Sciacquare le fette una volta con PB per rimuovere l'eccesso OCT.<ol>
<li>Rimuovere la soluzione con una pipetta di plastica senza succhiare le fettine di cervello. Aggiungere 250 µ l di PB fresco con una pipetta di 1000 µ l. Attenzione: Fette non devono asciugarsi, quindi rimuovere e aggiungere liquidi Pozzetto da altro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il PB con una pipetta di plastica e aggiungere 250 µ l di tampone bloccante per pozzetto con una pipetta di 1000 µ l. Incubare per 3 ore a temperatura ambiente (TA) sull'agitatore.</li>
	<li>Durante il periodo di incubazione, diluire gli anticorpi primari nel buffer dell'anticorpo in un tubo di reazione. Utilizzare 250 µ l di tampone di anticorpo per pozzetto e aggiungere la quantità appropriata di anticorpo (Vedi tabella 2) pipettando esso direttamente la soluzione utilizzando una pipetta 2 µ l. Miscelare la soluzione pipettando delicatamente su e giù più volte. Vortice poco in seguito per garantire la corretta miscelazione. Nota: Per determinare la fluorescenza di fondo, gli stainings deve essere eseguiti anche senza l'aggiunta dell'anticorpo primario. Per questo, incubare la fetta in soluzione di anticorpo senza anticorpi primari secondo il protocollo.</li>
	<li>Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il tampone di bloccaggio con una pipetta di plastica e aggiungere 250 µ l di soluzione di anticorpo che contiene gli anticorpi primari per pozzetto. Incubare le fette con l'anticorpo primario durante la notte a 4 ° C in un agitatore.</li>
	<li>Giorno successivo, lavare le fette con lavaggio tampone 1 3 x per 10 min a RT su un agitatore.<ol>
<li>Rimuovere il supporto con una pipetta di plastica e aggiungere 300 µ l di tampone 1 di lavaggio per pozzetto. Incubare a + RT 10 min ripetere 3 volte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durante le fasi di lavaggio, diluire i fluoroforo-accoppiati anticorpi secondari nel buffer dell'anticorpo in un tubo di reazione. Utilizzare 250 µ l di tampone di anticorpo per pozzetto e aggiungere la quantità appropriata di anticorpo (Vedi tabella 2) pipettando esso direttamente la soluzione utilizzando una pipetta 2 µ l. Miscelare la soluzione pipettando delicatamente su e giù più volte. Vortice poco in seguito per garantire la corretta miscelazione. Attenzione: Poiché gli anticorpi sono sensibili alla luce, tutte le misure da questo punto in poi devono essere eseguite nel buio.</li>
	<li>Dopo i passaggi di lavaggio, Rimuovi il lavaggio tampone con una pipetta di plastica e aggiungere 250 µ l di soluzione di anticorpo contenente anticorpi secondari per pozzetto. Incubare le fette con anticorpo secondario per 90 min a RT nel buio.</li>
	<li>Lavare le fette con lavaggio tampone 2 3 x per 10 minuti a TA.</li>
	<li>Durante le fasi di lavaggio, diluire 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in PB 0,1 M in una concentrazione di 1: 2000.</li>
	<li>Rimuovere il tampone di lavaggio 2 con una pipetta di plastica e aggiungere 250 µ l di soluzione DAPI per pozzetto. Incubare per 5 min a RT sull'agitatore.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione DAPI con una pipetta di plastica e aggiungere 500 µ l di PB 0,1 M per pozzetto con una pipetta di 1000 µ l.</li>
	<li>Montare fette su vetrini da microscopio.<ol>
<li>Posto un vetrino da microscopio sotto lo stereoscopio. Con un pennello fine, aggiungere tre gocce separate di 0.1 M PB sulla diapositiva. Mettete una fetta per goccia sul vetrino del microscopio.</li>
		<li>Utilizzare il pennello sottile per appiattire e orientare le fette sul vetrino da microscopio.</li>
		<li>Quando tutte le sezioni sono posizionate correttamente, rimuovere PB in eccesso con un panno e asciugare accuratamente la diapositiva. Attenzione: Evitare l'essiccazione le fette di cervello completamente.</li>
		<li>Aggiungere 80 µ l di mezzo nella diapositiva di inclusione. Abbassare con cautela il coprioggetto sulla diapositiva, quindi incorporare le fette di cervello.</li>
		<li>Lasciare le diapositive ad asciugare la cappa per 1-2 h (coprirli per evitare l'esposizione alla luce) e memorizzarli in una casella di scorrimento microscopio a 4 ° C. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. imaging
<ol><li>Dopo il mezzo di inclusione è completamente indurito, posizionare il vetrino al microscopio confocale. Nota: Epifluorescenza combinato con software di deconvoluzione dovrebbe produrre qualità d'immagine simile.</li>
	<li>Regolare le impostazioni di laser aumentando o diminuendo l'intensità del laser per ogni canale in modo che alcuni pixel sono sovraesposte per assicurare la massima distribuzione dei valori di grigio.</li>
	<li>Acquisire tessuti virtuale della fetta intero cervello per i diversi canali.<ol>
<li>Nel software di imaging (Vedi Tabella materiali), selezionare l'opzione di piastrelle e delineare manualmente la fetta di cervello con la Piastrella regione Setup.</li>
		<li>Distribuire i punti di assistenza in tutta la regione di mattonelle e regolare il fuoco per i punti di supporto differente premendo Verificare Tile regioni/posizioni...
</li>
		<li>Regolare le impostazioni in Modalità di acquisizione secondo la desiderata ad alta risoluzione e le dimensioni dell'immagine risultante e avviare la scansione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando la scansione è terminata, è possibile utilizzare la funzione di cucitura per elaborare il tessuto virtuale. Esportare il file come un TIF con la funzione Esporta immagine.</li>
</ol>4. computer-based Analysis
<ol><li>Caricare tutti i singoli canali per un'immagine in Figi29 cliccando File | Aperto.</li>
	<li>Con lo strumento selezione a mano libera , delineare un emisfero nel DAPI-canale. Creare una maschera di selezione facendo clic modifica | Selezione | Creare la maschera.</li>
	<li>Determinare l'intensità media di fluorescenza per i singoli canali (Mover e lo synaptophysin) cliccando Analyze | Misura. Nota: Assicurarsi di selezionare i canali diversi per determinare i valori di intensità media di fluorescenza per ogni canale.</li>
	<li>Copiare l'intensità media di fluorescenza per singoli canali in un foglio di calcolo.</li>
	<li>Determinare l'intensità media di fluorescenza per singoli canali in un'area di interesse di delineare la zona anche con lo strumento selezione a mano libera . Utilizzare un Atlante del cervello del mouse come riferimento.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.1-4.5 per tutti gli emisferi e tutte le aree di interesse. Nota: Determinare i valori per ogni emisfero separatamente per poi confrontare i valori in un'area di interesse a quello nell'emisfero (Vedi punto 5.2).</li>
</ol>5. il trattamento
<ol><li>Nel caso in cui la fluorescenza di fondo è alta (Vedi discussione), potrebbe essere necessario una sottrazione di sfondo. Per questo, determinare l'intensità media di fluorescenza per la fetta elaborata senza primaria dell'anticorpo contro la proteina di riferimento (qui: sinaptofisina) e sottrarre tale valore da tutti i valori ottenuti per le regioni del cervello e gli emisferi.</li>
	<li>Quando sono state determinate le intensità media di fluorescenza per singoli canali per ogni emisfero e ogni area di interesse (Vedi tabella 3), calcolare il rapporto di Mover per lo synaptophysin dividendo il valore per Mover per il valore per lo synaptophysin ( giallo nella tabella 3). Questa azione eseguita separatamente per ogni emisfero e ogni area di interesse.</li>
	<li>Dividere il rapporto ottenuto per un'area di interesse per il rapporto ottenuto per l'emisfero corrispondente (arancione nella tabella 3) per determinare il rapporto tra l'area di interesse per l'emisfero.</li>
	<li>Per determinare la relativa abbondanza di Mover, tradurre il rapporto ottenuto in 5.2 in una percentuale da determinare la deviazione da 1 (in rosso nella tabella 3). Un rapporto di 1.25 darebbe quindi una relativa abbondanza di Mover del 25% superiore alla media, e un rapporto di 0,75 produrrebbe una relativa abbondanza di Mover del 25% inferiore alla media.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo qui presentato mira a quantificare la distribuzione di una proteina di interesse riguardante l'abbondanza di una proteina marker con una nota distribuzione. Colorazione di immunofluorescenza può mostrare un'alta variabilità dell'intensità tra le diverse sezioni di colorazione. L'approccio di quantificazione descritto qui aggira questo problema determinando il rapporto della proteina di interesse per i media in tutto l'emisfero. Di conseguenza, diverse intensità di colorazione attraverso fette sono vanificate e ...

Comunicazione tra neuroni avviene presso siti specializzati di contatto chiamati sinapsi. Sinapsi contengono una miriade di diverse proteine che orchestrano trasmissione sinaptica. Alcune di quelle proteine mostrano una distribuzione eterogenea in tutto il sistema nervoso e non sono presenti in ogni sinapsi1. Un esempio di una tal proteina è Munc13, che è coinvolto nel processo di adescamento delle vescicole sinaptiche. Esistono diverse isoforme di Munc13, che sono distribuite in modo eterogeneo in tutto il cervello2, e la presenza o l'assenza di specifiche isoforme possa influenzare la plasticità sinaptica a breve termine e dynamics delle vescicole sinaptiche3, 4 , 5. Pertanto, è di vitale importanza per essere in grado di identificare la presenza di diverse proteine sinaptiche tra aree del cervello.
I metodi di scelta per la quantificazione delle proteine sinaptiche - finora - sono di spettrometria di massa e Western blotting, piuttosto che immunohistochemistry6,7,8,9. In alcuni casi, vengono utilizzati diversi metodi per completarsi a vicenda per valutare sia la quantità e la localizzazione delle proteine specifiche (cioè, Wilhelm et al. 10). il metodo qui descritto consente per la localizzazione e la quantificazione delle proteine di interesse senza la necessità di utilizzare qualsiasi metodo di biochimica, semplicemente che impiegano gli stainings immunofluorescenti. Un altro vantaggio è che la quantificazione può essere fatto su aree molto più piccoli e, dunque, più specifico, rispetto a quelli realizzati con altri metodi. Tuttavia, uno deve prendere in considerazione che una proteina di riferimento affidabile è necessario per valutare la distribuzione della proteina di interesse.
Macchiatura fluorescente da immunohistochemistry permette di identificare sistematicamente la localizzazione delle proteine attraverso aree cerebrali, così come all'interno di diversi compartimenti neuronali. Per identificare i diversi compartimenti, vengono utilizzati gli indicatori specifici. In genere, anticorpi contro la sinapsina e lo synaptophysin11 possono essere usati per etichettare le vescicole sinaptiche, mentre gli anticorpi contro fagotto etichettare la zona attiva di un terminale presinaptico12. Trasportatori vescicolari, quali i trasportatori del glutammato vescicolare dei suini (vGluT) o il trasportatore vescicolare di GABA (vGAT), vengono utilizzati per etichettare eccitatorio13 e inibitorio14 terminali presinaptici, rispettivamente. Sul versante postsinaptico, anticorpi contro la proteina Homer possono essere impiegati per contrassegnare terminali postsinaptici e anticorpi contro densità postsinaptica proteina 95 (PSD95)15,16,17 o gephyrin18 , 19 , 20 può etichettare terminali postsinaptici eccitatori o inibitori, rispettivamente. Usando gli anticorpi contro una proteina di interesse e marcatori come quelle descritte sopra, si può determinare la localizzazione di tali proteine. Molti studi fino ad oggi hanno fatto questo in un modo qualitativo21. Tuttavia, per determinare in modo affidabile la distribuzione differenziale di una specifica proteina sinaptica, si deve non solo determinare la presenza o assenza, ma anche la concentrazione relativa. L'eterogeneità di dimensioni e densità delle sinapsi lo rende importante per stabilire un rapporto tra il marcatore sinaptico e la proteina di interesse. In caso contrario, sinapsi ricche regioni quali gli strati non-piramidali dell'ippocampo e strato molecolare del cervelletto mostrerà un'alta densità di proteine sinaptiche, solo a causa della maggiore densità delle sinapsi, ma non a causa di una forte presenza di quella proteina in ogni sinapsi (ad es., Wallrafen e Dresbach1). D'altra parte, proteine in soma neuronale (ad es., TGN3822) di solito mostrano forte presenza nella strato delle cellule piramidali hippocampal o strato delle cellule ippocampali o cerebellari del granello dovuta all'alta concentrazione di corpi delle cellule neuronali in quelle zone. Pertanto, questa distribuzione non omogenea delle strutture, in questo caso le sinapsi, può portare a una falsa stima della distribuzione della proteina di interesse stesso. Inoltre, vi è un'intrinseca variabilità nell'intensità di colorazione attraverso campioni in stainings immunohistochemical. Il protocollo descritto qui prende questo in considerazione ed evita tali pregiudizi, come pure altri avvertimenti che derivano da metodi immunohistochemical.
Nel nostro recente studio, abbiamo utilizzato questo metodo per descrivere l'espressione differenziale di Mover (chiamato anche TPRGL23 o SVAP3024) attraverso 16 di aree differenti del cervello1. Mover è una proteina sinaptica di vertebrato-specifico che può essere trovata in associazione a vescicole sinaptiche ed influenze neurotrasmettitore rilascio25,26,27. Abbiamo abbiamo riferito l'espressione Mover per l'abbondanza delle vescicole sinaptiche, macchiando per lo synaptophysin come un marcatore di riferimento delle vescicole sinaptiche. Abbiamo trovato alti livelli di Mover in particolare i nuclei settali, pallidum ventrale e l'amigdala. All'interno dell'ippocampo, abbiamo trovato una distribuzione eterogenea di Mover, con alti livelli negli strati connessi con calcolo intra-ippocampale e bassi livelli in livelli di ingresso e di uscita.

<table><tbody><tr><td>Provette di reazione da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>Provette di reazione da 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>multipozzetto a 24 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 087721H</td><td></td></tr><tr><td>pipetta in plastica (monouso)</td><td>Sarstedt</td><td>861.176</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta da 1000 ml</td><td>Rainin</td><td>&nbsp; </td><td></td>17014382</tr><tr><td>pipetta da 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&nbsp;</td><td>Vetrini per</td> microscopio IKA <td>3340001</td><td></td></tr><tr><td>Menzel</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM800</td><td>Zeiss</td><td>Microscopio confocale</td><td></td></tr><tr><td>microtomo per congelamento</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Roche</td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>11666789001</tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; P6148-1kg</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>saccarosio</td><td>neoFroxx</td><td>1104KG001</td><td></td></tr><tr><td>Tessuto Tek Sakura</td><td>&nbsp;</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.063.460.500</td><td></td></tr><tr><td>siero di capra normale</td><td>Merck Millipore</td><td>S26-100ML</td><td></td></tr><tr><td>siero d'asino normale</td><td>Merck</td><td>S30-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1.086.031.000</td><td></td></tr><tr><td>coniglio anti-Mover</td><td>Synaptic Systems</td><td>RRID: AB_10804285</td><td></td></tr><tr><td>cavia anti-sinaptofisina</td><td>Sistemi sinaptici</td><td>RRID: AB_1210382</td><td></td></tr><tr><td>asino anti-coniglio AF647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>RRID: AB_2492288</td><td></td></tr><tr><td>capra anti-topo AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>RRID: AB_2337438</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol4-88</td><td>Calbiochem</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>475904</tr><tr><td>software ZEN2 blue Software</td> per <td>microscopia Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi FIJI</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del mouse mediante immunofluorescenza

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

La presenza, assenza o livelli di specifiche proteine sinaptiche possono influire gravemente trasmissione sinaptica. Oltre a chiarire la funzione di una proteina, è fondamentale per determinarne anche la distribuzione. Qui, descriviamo un protocollo che impiegano immunofluorescenza, microscopia confocale e l'analisi computerizzata per determinare la distribuzione della proteina sinaptica Mover (chiamato anche TPRGL o SVAP30). Mettiamo a confronto la distribuzione del motore a quello della sinaptofisina proteine delle vescicole sinaptiche, determinando la distribuzione del motore in maniera quantitativa rispetto l'abbondanza delle vescicole sinaptiche. In particolare, questo metodo potrebbe potenzialmente essere implementato per consentire il confronto tra la distribuzione delle proteine usando anticorpi differenti o microscopi o attraverso studi differenti. Il nostro metodo elude la variabilità inerente di immunofluorescente stainings cedendo un rapporto piuttosto che i livelli assoluti di fluorescenza. Inoltre, il metodo descriviamo consente al ricercatore di analizzare la distribuzione di una proteina su diversi livelli: dalle fette di cervello intero a regioni del cervello a subregions differenti nell'area di un cervello, come i diversi strati dell'ippocampo o sensoriali cortecce. Mover è una proteina di vertebrato-specifico che è associata con vescicole sinaptiche. Con questo metodo, dimostriamo che Mover è eterogeneo tra aree del cervello, con gli alti livelli nell'amigdala, i nuclei settali e pallidum ventrale e anche all'interno di aree cerebrali singole, ad esempio i diversi strati dell'ippocampo.

Rappresentante modelli dei diversi marcatori di macchiatura può essere visto nella Figura 1. Il modello varia a seconda della distribuzione della proteina. Esempi di cinque livelli di rostro-caudale sono riportati nelle colonne (A)-(E). Un rappresentante colorazione DAPI è indicata nella prima riga: DAPI aderisce al DNA di una cellula e quindi i nuclei sono colorati. Ciò provoca un modello punctato. Regioni con una densità el...

Qui, descriviamo un approccio quantitativo per determinare la distribuzione di una proteina sinaptica rispetto una proteina marker mediante immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzata.

Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Qui descriviamo un protocollo che utilizza immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzazione per determinare la distribuzione della proteina sinaptica rispetto a una proteina di riferimento. Il nostro metodo elude la variabilità intrinseca delle macchie di immunofluorescenza utilizzando un rapporto piuttosto che livelli assoluti di fluorescenza. Inoltre con questo metodo è possibile analizzare l'eterogeneità della distribuzione proteica su diversi livelli.Dalle fette cerebrali intere alle regioni cerebrali fino a sub regioni come i diversi strati dell'ippocampo. Questa tecnica può essere adattata per determinare la distribuzione proteica in diversi tessuti diversi dal cervello e dai sistemi modello diversi dai topi. Inizia lavando il cervello del topo precedentemente isolato e fisso come descritto nel manoscritto.Quindi trasferire il cervello in un tubo di reazione da 15 millilitri con 30%saccarosio 0,1 PB molare. Per crio proteggere il cervello incubarlo a 4 gradi Celsius per 48 ore o fino a quando non affonda. Successivamente usa una lama affilata per tagliare il cervello protetto dal crio a seconda dell'area di interesse. Quindi posizionare il cervello in uno stampo criogenico e aggiungere optimal cutting temperature compound per incorporarlo assicurandosi di evitare bolle e orientare correttamente il cervello in modo da avere un piano coronale di taglio.Posizionare lo stampo crio nel congelatore meno 80 gradi Celsius fino a quando non è congelato solido. Montare il tessuto congelato sul microtomo crio e attendere almeno 15 minuti prima della sezione per equilibrarlo alla temperatura del microtomo. Inizia a tagliare il cervello in fette coronali spesse 25 micrometri.Utilizzare un gancio di vetro allo Strumento di personalizzazione di Office della prima fetta con attenzione senza toccare il tessuto cerebrale. L'OCT si atterrà al gancio di vetro. Usa il gancio di vetro per trasferire la fetta cerebrale nel primo pozzo.Raccogliere tre fette adiacenti per pozzo in una piastra di 24 po 'riempita con 0,1 PB molare. Conservare le fette a quattro gradi celsius fino alla colorazione per un massimo di due settimane. Per preparare le fette per la colorazione immuno utilizzare una pipetta di plastica per rimuovere la soluzione PB da un pozzo senza disegnare le fette cerebrali. Quindi utilizzare una pipetta da 1000 micro litri per aggiungere 250 microlitri di PB fresco per lavarli di OCT in eccesso.Ripetere questo lavaggio per ogni pozzo al momento per evitare di asciugare le fette. Quindi, utilizzare una pipetta di plastica per rimuovere la soluzione PB dal primo pozzo. Utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per aggiungere 250 microlitri di tampone di blocco per pozzo che funzionano bene di nuovo.Incubare la piastra a temperatura ambiente su uno shaker per tre ore. Durante l'incubazione aggiungere 250 microlitri di tampone anticorpale per pozzo a un tubo di reazione. Quindi utilizzare una pipetta da 2 microliter per aggiungere la quantità appropriata di anticorpo che la tubazione direttamente nella soluzione e pipettare delicatamente su e giù più volte per mescolare.Quindi vortice questo anticorpo diluito per incerta corretta miscelazione. Lavorando bene rimuovendo bene il tampone di blocco con una pipetta di plastica e aggiungere 250 microlitri di soluzione anticorpale primaria per pozzo. Incubare il piatto su uno shaker a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno seguente rimuovere la soluzione anticorpale con una pipetta di plastica. Lavare le fette con 300 microlitri di tampone di lavaggio uno per bene tre volte dieci minuti ciascuno lavare su uno shaker a temperatura ambiente. Durante il lavaggio, lavorando al buio, diluire il fluoro per un paio di secondi anticorpi in un tubo di reazione nello stesso modo precedentemente fatto con l'anticorpo primario.Dopo il lavaggio completato rimuovere il tampone di lavaggio con una pipetta di plastica e aggiungere 250 microlitri di soluzione anticorpale secondaria per pozzo. Incubare al buio a temperatura ambiente per 90 minuti. Dopo l'incubazione completata rimuovere la soluzione anticorpale con una pipetta di plastica.Lavare le sezioni tre volte con tampone di lavaggio due allo stesso modo del tampone di lavaggio uno. Durante questo lavaggio diluire la macchia DAPI in 0,1 PB molare per ottenere una concentrazione da uno a 2000. Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio dalla piastra aggiungere 250 microlitri di soluzione DAPI e incubare a temperatura ambiente sullo shaker per 5 minuti.Dopo aver rimosso la soluzione DAPI con una pipetta di plastica utilizzare un pipetto da 1000 microlitri per aggiungere 500 microlitri di 0,1 PB molare per pozzo. Posizionare uno scivolo al microscopio sotto uno stereoscopio. Utilizzare un pennello fine per aggiungere tre gocce separate di 0,1 PB molare sullo scivolo.Utilizzando il pennello posizionare una fetta per goccia sulla diapositiva, quindi appiattire e orientare le fette. Dopo che tutte le fette sono state posizionate correttamente utilizzare un tessuto di carta per rimuovere il PB in eccesso e asciugare con cura senza asciugare completamente le fette. Quindi aggiungere 80 microlitri di mezzo di incorporamento sulla diapositiva e coprirlo con cura con un foglietto di copertura per incorporare le fette cerebrali.Coprire le diapositive per evitare l'esposizione alla luce e lasciarle asciugare nella cappa dei fumi per una o due ore e quindi conservarle in una scatola scorrevole al microscopio a quattro gradi Celsius fino a quando non sono pronte per la microscopia confocale. Dopo aver acquisito tessuti virtuali di tutta la fetta cerebrale per diversi canali come descritto nel manoscritto caricare tutti i singoli canali o un'immagine in FIJI facendo clic su file e quindi aprire. Quindi utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per delineare un emisfero nel canale DAPI.Fare clic sulla modifica, quindi selezionare, quindi creare una maschera per creare una maschera dell'area selezionata. Quindi fare clic sull'analisi e quindi misurare le particelle per determinare l'intensità media della fluorescenza per i singoli canali. Assicurarsi di selezionare singoli canali per determinare i valori medi di intensità della fluorescenza per ogni canale.Successivamente, copiare l'intensità di fluorescenza media per i singoli canali in un foglio di calcolo. Per determinare l'intensità media della fluorescenza per i singoli canali in un'area di interesse delineare l'area con lo strumento di selezione a mano libera. Dopo la colorazione con DAPI che macchia le sezioni cerebrali dei nuclei hanno un modello di punctato e le regioni ad alta densità cellulare sono più luminose delle regioni a bassa densità cellulare.La colorazione con l'anticorpo Mover ha rivelato una distribuzione eterogenea con aree sensibili luminose e aree dimmer in tutto il cervello dove come Synaptophysin ha rivelato una distribuzione più omogenea. Una sovrapposizione di immagini ha mostrato la distribuzione differenziale della fluorescenza rossa che indica che la proteina Mover ha confrontato la fluorescenza verde che indica synaptophysin. Dopo l'analisi di quantificazione sono stati determinati valori medi di intensità di fluorescenza per diversi canali attraverso gli emisferi e attraverso le aree di interesse sia per Mover che per Synaptophysin.I rapporti tra i valori di fluorescenza del mover e i valori di fluorescenza synaptophysin mostrano la distribuzione eterogenea di Mover con aree di alti e bassi livelli di Mover rispetto alle vescicole sinaptiche. L'abbondanza relativa di Mover il rapporto in un'area di interesse rispetto a quella dell'emisfero e tradotta in una percentuale ha mostrato quanto Mover è presente in un'area di interesse rispetto alla media. L'abbondanza relativa di Mover è stata determinata per diversi strati nei sottocampi dell'ippocampo.Le tre regioni di interesse sono quantificate confrontando il rapporto tra i rispettivi strati e il rapporto dell'emisfero corrispondente. Questa procedura può essere facilmente adattata e combinata con diverse tecniche di imaging come la microscopia a super risoluzione per determinare ulteriormente la distribuzione subcellulare della proteina di interesse. Questa tecnica può anche essere applicata a diversi sistemi modello come animali geneticamente modificati o trattati con farmaci.Ciò può consentire un approccio comparativo in diverse condizioni sperimentali o anche specie.

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Neuroscienze

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