Sinapsi quantificare: un Immunocitochimica basato su analisi per quantificare Numero Synapse

Uno degli obiettivi più importanti delle neuroscienze è comprendere i segnali molecolari che istruiscono le prime fasi della formazione delle sinapsi. Pertanto, è diventato imperativo sviluppare approcci oggettivi per quantificare i cambiamenti nella connettività sinaptica. Per quantificare il numero di sinapsi in una varietà di preparazioni sperimentali, i neuroni in coltura o le preparazioni di tessuto cerebrale crio-sezione vengono colorati con marcatori pre e post sinaptici selettivi per etichettare i punti di contatto sinaptico tra i neuroni.

Le cellule o il tessuto vengono quindi ripresi su un microscopio a fluorescenza e sono necessarie immagini a otto bit per ciascuno dei canali corrispondenti ai due marcatori immunoistochimici. Le immagini vengono analizzate utilizzando l'immagine J 1.29 con analizzatore di puncta. Per determinare l'entità della colocalizzazione tra i marcatori pre e post sinaptici, i punti di colocalizzazione possono quindi essere utilizzati per determinare il numero di sinapsi presenti nel preparato.

Il vantaggio principale della tecnica qui descritta rispetto ai metodi esistenti come la microscopia elettronica, è che il saggio delle sinapsi consente un'analisi e una quantificazione del numero di sinapsi molto più elevate. Le principali implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi e alla terapia di disturbi clinici come il morbo di Alzheimer, l'epilessia o l'autismo in cui le anomalie e la connettività sinaptica sono state implicate come base per la patologia sottostante. Questa tecnica può essere utilizzata per identificare forme di intervento che possono ridurre o migliorare le carenze che vediamo nella capacità dei neuroni colpiti di formare sinapsi tra loro.

Sebbene questo metodo sia utile per studiare lo sviluppo del cervello, può essere applicato anche ad altri organismi modello o sistemi di organi in cui si è interessati a studiare o quantificare il numero di contatti cellula-cellula per i quali si ha la capacità di etichettare selettivamente ogni faccia opposta di ogni sito di contatto. Preparare colture neuronali piastrando cellule gangliari retiniche di ratto purificate dalla retina di ratto, raccolte da P cinque a sette animali su vetrini di vetro rivestiti di poli de licina. In una piastra a 24 pozzetti, le cellule vengono lasciate crescere a 37 gradi Celsius per tre-cinque giorni prima della trasfezione.

Dopo la trasfezione, incubare le cellule per altri sette-otto giorni per consentire lo sviluppo delle sinapsi quando le cellule piastrate sono sufficientemente mature. Rimuovere il terreno di coltura dai pozzetti e aggiungere 500 microlitri di preriscaldamento, para formaldeide al 4% a ciascun pozzetto fissato per sette minuti. A temperatura ambiente dopo la fissazione, sciacquare le cellule tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato.

È importante assicurarsi che le celle non vengano mai lasciate asciugare nei pozzetti. Una volta che un buffer viene rimosso da un pozzo, deve essere prontamente sostituito dal buffer successivo. Preparare un tampone bloccante contenente il 50% di siero di capra normale e lo 0,2% di Triton X 100.

Dopo aver rimosso il PBS da ciascuno, aggiungere 200 microlitri di tampone bloccante a ciascun pozzetto e bloccare per 30 minuti. A temperatura ambiente, rimuovere il tampone bloccante e risciacquare tre volte. Con PBS, preparare una diluizione di anticorpi primari in una soluzione tampone anticorpale al 90% e NGS al 10% contenente la coppia di anticorpi pre e post sinaptici di scelta.

Qui un coniglio antis sinapsina, un marcatore presinaptico e un topo anti homer. Un marcatore post-sinaptico viene utilizzato Centrifuga, la diluizione dell'anticorpo primario per cinque minuti alla massima velocità in una centrifuga da banco per rimuovere qualsiasi anticorpo precipitato, quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione di anticorpi primari a ciascuno. Posizionare bene la piastra in un contenitore umidificato per evitare l'essiccazione della soluzione primaria.

Incubare per una notte a quattro gradi Celsius dopo l'incubazione con anticorpi primari. Sciacquare ogni pozzetto tre volte. Con PBS, aggiungere 200 microlitri di anticorpi secondari appropriati, diluiti da uno a 1000 in tampone anticorpale contenente il 10% di NGS preparato.

Come in precedenza, porre la capsula nella camera umidificata e incubare per due ore a temperatura ambiente al buio dopo l'incubazione con i secondari. Sciacquare ogni pozzetto tre o quattro volte con PBS. Posizionare una goccia di supporto di montaggio dello scudo vettoriale con DPI su un vetrino.

Quindi capovolgere il vetro di copertura con le celle sulla goccia per montarlo. Infine, applica lo smalto trasparente attorno ai bordi del vetrino coprioggetti. Fare attenzione a non spingere o spostare i vetrini coprioggetti durante l'applicazione.

Poiché questo condividerà le celle, lasciare asciugare i vetrini per almeno 30 minuti in un luogo asciutto e buio. In questo caso, l'imaging viene eseguito utilizzando un microscopio a fluorescenza zes axio imager dotato di set di filtri appropriati e di un obiettivo a immersione in olio 63x. Posizionare un vetrino contenente cellule non trasfettate sul tavolino del microscopio.

Utilizzando il filtro DPI impostato per visualizzare i nuclei cellulari, selezionare le cellule che si trovano ad almeno due diametri di cella di distanza dalle celle adiacenti più vicine. L'uso di DPI per questo passaggio aiuterà a evitare distorsioni e garantirà la casualità della selezione delle celle. Per ogni cella selezionata, ottenere immagini a otto bit utilizzando i set di filtri appropriati, in questo caso GFP e Texas Red.

L'immagine pseudo colorata sovrapposta dovrebbe mostrare i marcatori pre e post-sinaptici rispettivamente in rosso e verde. Quindi posizionare un vetrino contenente cellule trasfettate sul tavolino del microscopio. Qui le cellule sono state trasfettate con un vettore di espressione del pomodoro TD.

Utilizzare questo marcatore per selezionare le celle come prima. Per ogni cella selezionata, ottenere otto immagini di fossa utilizzando i set di filtri appropriati in questo caso, GFP, Texas Red e Sci five. L'immagine pseudo colorata sovrapposta dovrebbe avere i marcatori post-sinaptici in rosso, verde e blu.

In questo caso, il programma di analisi delle punture viene utilizzato per la quantificazione della puntura sinaptica co-localizzata. Il plugin Puncta analyzer è stato scritto da Barry Walk ed è disponibile su richiesta nell'immagine J 1.26. Apri una delle immagini raccolte.

Usa lo strumento di selezione circolare per selezionare una regione di circa un diametro di cella attorno al SOR di interesse. Con la regione di interesse selezionata, vai al menu dei plugin e seleziona analizzatore di puntura nella finestra delle opzioni di analisi che appare Seleziona canale rosso Canale verde. Il primo sottrae lo sfondo e imposta il file dei risultati.

Fare clic su OK. Definire quindi una posizione in cui salvare i risultati. Questi risultati possono essere esportati in Excel per ulteriori analisi nella finestra che appare.

Quindi, assicurati che sia selezionato un raggio della palla rotante di 50 e deseleziona l'opzione dello sfondo bianco. Questa modifica non è necessaria, ma è spesso preferita dagli utenti dell'applicazione. Per facilitare la visualizzazione, fare clic su OK.

Apparirà una nuova finestra accanto a una maschera corrispondente all'immagine rossa del canale. Regolare la soglia fino a quando la maschera rossa corrisponde nel miglior modo possibile con il maggior numero possibile di punture individuali discrete. Senza introdurre troppo rumore, fare clic su Fine.

Impostate la dimensione minima del punto su quattro pixel. Non modificare nient'altro. Fare clic su OK.

Ripetere il passaggio precedente, questa volta per il canale verde. Dopo aver ripetuto l'operazione con il canale verde, il plugin fornirà la quantificazione corrispondente ai puncta in ciascun canale separatamente e un puncta co-localizzato tra i due canali. Il test delle sinapsi qui mostrato può essere applicato a sezioni criogeniche del cervello e a qualsiasi altro tessuto del sistema nervoso come il midollo spinale o la retina.

A condizione che esista un'adeguata coppia di marcatori pre e post-sinaptici. Inizia raccogliendo tessuto cerebrale da un topo che è stato soppresso mediante dissanguamento e profusione con PBS. Metti l'intero cervello in paraldeide al 4% in PBS a quattro gradi Celsius durante la notte del giorno successivo.

Sciacquare il cervello tre volte con PBS. Cryo protegge il cervello inserendolo nel 30% di saccarosio. In PBS.

Il tessuto inizialmente galleggerà, manterrà a quattro gradi Celsius fino a quando il tessuto non affonderà sul fondo. A quel punto, la crioprotezione è completa. Successivamente, in una soluzione due a uno di saccarosio al 20% per OCT e PBS incorporare il cervello all'orientamento desiderato per il sezionamento.

Ad esempio, sagittale o coronale. Quindi, posiziona una superficie metallica piatta sopra un secchio di ghiaccio secco. Metti il cervello incorporato su di esso per congelarlo una volta congelato, trasferisci il cervello in un sacchetto per congelatore e posizionali a meno 80 gradi Celsius per un massimo di un anno prima del sezionamento.

Utilizzando una criosezione criostatica, il tessuto viene suddiviso in sezioni da 12 a 16 micron e montato su vetrini. Successivamente, asciuga i vetrini mettendoli in un forno a 37 gradi Celsius. Quindi sciacquarli tre volte con PBS per rimuovere l'OCT residuo.

Una penna di paraffina viene utilizzata per creare una barriera idrofobica attorno al vetrino e viene aggiunto un tampone di blocco al vetrino che impedisce di fluire dal vetrino dal bordo di paraffina. Posizionare i vetrini nel 20% di siero di capra normale in PBS per un'ora a temperatura ambiente per bloccare il posto successivo. Le sezioni negli anticorpi primari diluite in PBS con lo 0,3% di tritoni e il 10% di siero di capra normale.

Qui, l'antit di coniglio, PSD 95 viene utilizzato per marcare i compartimenti glutammatergici post-sinaptici e il porcellino d'India anti v glu due viene utilizzato per marcare i terminali pre-sinaptici glutammatergici. Posizionare i vetrini a quattro gradi Celsius e incubare per 36-60 ore dopo l'incubazione. Lavare via l'anticorpo primario immergendo i vetrini tre volte in PBS per 15 minuti ciascuno.

Dopo questo passaggio, assicurati di proteggere i vetrini dalla luce diretta. Applicare anticorpi secondari diluiti da uno a 200 in PBS con 0,3% di tritoni e 10% di siero di capra normale. Qui, capra anti porcellino d'India.

Alexa 4 8 8 e capra anti coniglio. Alexa 5 9 4 sono utilizzati. Incubare per due ore a temperatura ambiente al buio.

Lavare i vetrini immergendoli quattro volte in PBS per 15 minuti ciascuno per montarli. Aggiungere piccole gocce di supporto per scudo vettoriale con dappy e coprire le diapositive con vetrini. Applicare lo smalto per inibire i movimenti dei vetrini.

L'imaging della sezione di tessuto deve essere eseguito utilizzando un microscopio confocale con laser appropriati utilizzando un obiettivo a immersione in olio 63 volte per ogni immagine della sezione, sezioni ottiche seriali a intervalli di 0,33 micron su una profondità totale di cinque micron per un totale di 15 sezioni ottiche. Devono essere riprodotte almeno tre sezioni di ciascun animale e devono essere inclusi almeno tre animali da una determinata condizione sperimentale. Genera proiezioni di massima intensità da gruppi di tre sezioni consecutive, ottenendo cinque proiezioni che rappresentano un micron di profondità ciascuna.

Questi sono quantificati utilizzando l'immagine J come descritto per le RG Cs con un ROI modificato per determinare il numero di sinapsi formate in assenza di astrociti. L'immunochimica è stata eseguita su rgc dissociato trattato con mezzi di crescita basali utilizzando anticorpi contro il fagotto mostrati in rosso e homer mostrati in verde come previsto. Pochissimi punti di colocalizzazione sinaptica sono stati osservati per determinare l'effetto delle molecole secrete dagli astrociti sul numero di sinapsi formate in vitro; le RG C dissociate sono state trattate con terreni condizionati con astrociti di topo ogni tre giorni per un totale di 12 giorni dopo la colorazione.

Numerose sinapsi erano evidenti in questo neurone, ma presto si mostra in rosso. Homer è mostrato in RDC dissociati verdi trasfettati con TD espresso da Lee citoplasmatico Il pomodoro è stato trattato con solo crescita basale. Le sinapsi medie non sono visibili.

Il pomodoro TD è visto in blu e la sinapsi in è vista in rosso. C'è pochissimo segnale visto per il marcatore post-sinaptico omero mostrato in verde. Quando le stesse cellule vengono trattate cronicamente con un terreno condizionato con astrociti di ratto, si osservano molte sinapsi.

Il pomodoro TD è in blu, la sinapsina in rosso e l'omero in verde qui. È stato mostrato un RGC purificato che è stato trattato con terreno condizionato con astrociti ed è stato colorato per la pre sinapsi in rosso e le maschere di soglia verdi homer post-sinaptiche generate utilizzando l'analizzatore di puntura corrispondono ai due canali presenti. Dopo aver identificato i punti di colocalizzazione, l'analizzatore Puncta produce una rappresentazione grafica di questi punti.

Un output numerico è fornito dall'analizzatore di puncta che indica il numero di puncta discreti identificati in entrambi i canali e per i punti di colocalizzazione. I dati prodotti dall'analisi di questo neurone illustrano la capacità delle molecole secrete dagli astrociti di promuovere la formazione di sinapsi, mostrate qui come un saggio sinaptico in cui è stata quantificata la colocalizzazione della marcatura immunoistochimica pre e post-sinaptica per dimostrare il potenziamento della formazione di sinapsi indotta dagli astrociti mediante sovraespressione del recettore neuronale per l'importante molecola genica secreta dagli astrociti, il trombombo spon. In questa figura è mostrato il numero medio di sinapsi per neurone trattati cronicamente con mezzi di crescita basali, gm, o con terreni condizionati da astrociti.

A-C-M-A-C-M promuove più fortemente la formazione di sinapsi nelle cellule gangliari retiniche rispetto all'espressione del recettore dello spon del trombo rispetto alle cellule che esprimono un vettore vuoto. Per quantificare la densità sinaptica nel collicolo superiore di topo, i compartimenti pre e post-sinaptici sono stati marcati separatamente utilizzando marcatori immunoistochimici specifici del compartimento. Come mostrato qui, c'è stato un aumento del numero di sinapsi dal settimo giorno postnatale a P 14.

Ciò illustra l'aumento del numero di sinapsi nell'ulus superiore in questa finestra temporale di sviluppo. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere completato in circa due giorni per le colture neuronali dissociate e in circa cinque giorni per le sezioni cerebrali dal prelievo dall'animale dopo questa procedura. Altri metodi, come l'elettrofisiologia e la microscopia elettronica, vengono utilizzati per verificare che i cambiamenti nel numero sinaptico riflettano rispettivamente i cambiamenti sia nelle sinapsi funzionali che nelle sinapsi ultra strutturalmente normali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare l'immunoistochimica alla tua preparazione sperimentale per quantificare il numero di sinapsi. Questo protocollo descrive in dettaglio come utilizzare gli anticorpi specifici del compartimento per marcare selettivamente i compartimenti pre e post-sinaptici. In questo contesto, definiamo le sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali ottenuti da ciascuno di questi marcatori.