Name: Sinapsi quantificare: un Immunocitochimica basato su analisi per quantificare Numero Synapse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 11 s
Description: Scopri come quantificare le sinapsi nelle colture neuronali e nei tessuti cerebrali mediante immunocitochimica e microscopia a fluorescenza. Questo metodo permette di analizzare la connettività sinaptica con elevata precisione.

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Nel laboratorio di A. Ben Barres (Stanford University).: Puncta Plug-in per immagini è stata scritta da Barry J Wark (Consulting Physion attuale indirizzo) Analyzer Finanziamento; <ul><li> Alfred P. Sloan Foundation </li><li> A. Esther e Giuseppe Klingenstein Fund, Inc. </li><li> Broad Fondazione per la Ricerca Biomedica </li><li> Cura per la malattia di Huntington iniziativa s </li></ul>

<ol><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li>
<li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li>
<li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.</li>
<li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synapse+number+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li>
<li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li>
<li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+retinotopic+connections%3A+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li>
<li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li>
<li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li>
<li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length%2C+branching+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Moll.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il test sinapsi di cui sopra si basa nel contesto dei nostri obiettivi sperimentali, in cui ci si concentra in gran parte su proiezioni eccitatori di RGCs, sia in purificati cultura o nella sezione del cervello. Abbiamo fornito una tabella che elenca gli anticorpi di riferimento che funzionano bene per l&#39;etichettatura sinapsi eccitatorie (Tabella 1). Questo test sinapsi può essere adattata a quantificare il numero delle sinapsi neuronali di ogni popolazione o di qualsiasi altro sottotipo...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Antigene </td><td> Specie </td><td> Monoclonali / policlonali </td><td> Venditore </td><td> Numero di catalogo </td><td> Diluizione </td><td> Lavori in Cultura </td><td> Opere nelle sezioni </td></tr><tr><td rowspan="10"> Presinaptico </td><td> Sinapsina </td><td> Coniglio </td><td> Policlonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Sinapsina </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagotto </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Assay Designs </td><td> VAM-PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagotto </td><td> Cavia </td><td> Policlonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synaptotagmin 1 </td><td> Coniglio </td><td> Policlonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> Synaptobrevin 2 (C1.69.1) </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Sinaptofisina (C1.7.2) </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Cavia </td><td> Policlonali </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td> Cavia </td><td> Policlonali </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6"> Postsinaptico </td><td> PSD-95 (6G6-1C9 clone) </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Affinità Bio Reagenti </td><td> MA1-045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD-95 </td><td> Coniglio </td><td> Policlonali </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> Omero </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Omero </td><td> Ratto </td><td> Policlonali </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Coniglio </td><td> Policlonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Mouse </td><td> Monoclonali </td><td> Sistemi di Synaptic </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Esempi di liste di buoni marcatori pre e post-sinaptici che abbiamo utilizzato con successo nel nostro test sinapsi. Essere consapevoli che questo non è un elenco esaustivo di tutti i marcatori disponibili. Y = Si, N = No, ND = non determinato. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Gatto. No. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> poli-d-lisina </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Roche Diagnostics GmbH </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Siero di capra normale </td><td> Gibco </td><td> 16210 </td></tr><tr><td> Vectashield con DAPI </td><td> Laboratori Vector </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> Ottobre </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Tris-base (50 mm) </td><td> Pescatore </td><td> BP152-5 </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> L-lisina </td><td> Sigma </td><td> L-1137 </td></tr><tr><td> 16% PFA soluzione </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15711 </td></tr><tr><td> Granulare PFA </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 19210 </td></tr><tr><td> 24-ben cultura piastra </td><td> Falco </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> Capra anti-topo anticorpi coniugati Alexa </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> Fornitura </td><td> Azienda </td><td> Gatto. No. </td></tr><tr><td> 12mm, n. 0 vetro coprioggetto </td><td> Karl Hecht Gmbh </td><td> 1105209 </td></tr><tr><td> No. 1,5 vetro coprioggetto (per le sezioni) </td><td> VWR Scientific </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> Vetrini </td><td> VWR Scientific </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

sinapsi quantificare: un immunocitochimica basato su analisi per quantificare numero synapse

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

Uno degli obiettivi più importanti nel campo delle neuroscienze è quello di capire i segnali molecolari che istruire prime fasi della formazione di sinapsi. Come tale, è diventato imperativo per sviluppare approcci obiettivo di quantificare i cambiamenti nella connettività sinaptica. A partire dalla fissazione del campione, il presente protocollo come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori. Il numero di questi colocalizations è quantificati tramite un plug-in puncta Analyzer (scritto da Bary Wark, disponibile su richiesta, c.eroglu cellbio.duke.edu @) sotto la piattaforma software di analisi ImageJ. Il dosaggio sinapsi descritte in questo protocollo può essere applicato a qualsiasi preparazione del tessuto neurale o della cultura per cui si è selettivo marcatori pre-e post-sinaptici. Questo test sinapsi è uno strumento prezioso che può essere ampiamente utilizzato nello studio dello sviluppo sinaptico.

Questo protocollo dettagli come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori.

Sinapsi quantificare: un Immunocitochimica basato su analisi per quantificare Numero Synapse

Uno degli obiettivi più importanti nelle neuroscienze è comprendere i segnali molecolari che guidano le fasi iniziali della formazione delle sinapsi. In tal senso, è diventato...

Uno degli obiettivi più importanti nelle neuroscienze è comprendere i segnali molecolari che guidano le fasi iniziali della formazione delle sinapsi. Per questo motivo, è diventato fondamentale sviluppare approcci oggettivi per quantificare i cambiamenti nella connettività sinaptica. Per quantificare il numero di sinapsi in diversi tipi di preparazioni sperimentali, i neuroni in coltura o sezioni crioconservate di tessuto cerebrale vengono colorati con marcatori selettivi pre- e post-sinaptici al fine di evidenziare i punti di contatto sinaptico tra i neuroni.Le cellule o il tessuto vengono quindi osservati al microscopio a fluorescenza e sono richieste immagini a 8 bit per ciascuno dei canali corrispondenti ai due marcatori di immunohistochimica. Le immagini vengono analizzate utilizzando ImageJ 1.29 con il plugin Puncta Analyzer. Per determinare il grado di codistribuzione tra i marcatori presinaptici e postsinaptici, i punti di codistribuzione possono essere utilizzati per stabilire il numero di sinapsi presenti nel preparato.Il principale vantaggio della tecnica qui descritta rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia elettronica, è che il saggio delle sinapsi consente u

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L'abbondanza dei recettori dei neurotrasmettitori a livello delle sinapsi cluster influenza fortemente la forza sinaptica. Questo metodo quantifica recettori dei neurotrasmettitori marcato in fluorescenza in tre dimensioni con un singolo sinapsi...

Quantificazione automatica di fluorescenza in Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Questo video mostra l'imaging di cellule vive della topologia immunologica delle sinapsi, studiando le interazioni tra i linfociti T e le cellule epiteliali che trasportano antigeni fluorescenti. La microscopia a fluorescenza rivela lo spostamento del citoplasma rosso e gli anelli gialli della membrana nelle cellule endoteliali, indicando la formazione di sinapsi immunologiche.

Valutazione della topologia immunologica delle sinapsi attraverso l'imaging di cellule vive

Questo video dimostra la colorazione in immunofluorescenza di una fetta di cervello di topo per quantificare la distribuzione di una specifica proteina presinaptica. Il processo prevede il blocco di siti aspecifici, l'applicazione di anticorpi primari per la proteina bersaglio e un marcatore di riferimento, seguiti dalla marcatura degli anticorpi secondari e dalla controcolorazione nucleare. Il marcatore di riferimento garantisce una quantificazione accurata fornendo una linea di base coerente...

Quantificazione della distribuzione di una proteina presinaptica nel cervello di topo mediante immunofluorescenza

Qui, descriviamo un completo flusso di lavoro per l'analisi qualitativa e quantitativa del sistema immunitarie sinapsi tra cellule T umane primarie e cellule presentanti l'antigene. Il metodo si basa su imaging citometria a flusso, che permette l'acquisizione e la valutazione di diverse immagini di migliaia di cellule all'interno di un periodo di tempo relativamente breve.

Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

Un protocollo per accuratamente identificare e analizzare le sinapsi nelle fette hippocampal mediante immunofluorescenza è descritto in questo articolo.

Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

Descriviamo un test ottico per vescicole sinaptiche (SV) riciclaggio in colture di neuroni. Combinando questo protocollo con doppia transfezione di esprimere un marcatore presinaptica e la proteina di interesse ci permette di individuare siti presinaptici, loro delle vescicole sinaptiche capacità di riciclaggio e di determinare il ruolo della proteina di interesse.

Un test ottico per riciclo delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni che Overexpressing proteine presinaptiche

Qui, descriviamo un approccio quantitativo per determinare la distribuzione di una proteina sinaptica rispetto una proteina marker mediante immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzata.

Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

Questo protocollo immagini sia la formazione di sinapsi immunologica che il successivo traffico secretoria polarizzato verso la sinapsi immunologica. I coniugati cellulari si formarono tra una cellula Raji dal polso superantigeno (che fungeva da cellula che presenta l'antigene) e un clone di Jurkat (che fungeva da aiutante echeggiatore del linfocito T).

Immaginare la sinapsi immunologica umana

DetectSyn è un saggio fluorescente rapido e imparziale che misura i cambiamenti nel numero relativo di sinapsi (impegno pre e postsinaptico) tra trattamenti o stati patologici. Questa tecnica utilizza una tecnica di legatura di prossimità che può essere utilizzata sia nei neuroni in coltura che nei tessuti fissi.

DetectSyn: un metodo fluorescente rapido e imparziale per rilevare i cambiamenti nella densità delle sinapsi

Qui presentiamo due protocolli per quantificare l'inghiottimento microgliale delle sinapsi vGLUT1-positive e dei sinaptosomi grezzi marcati con pHRodo Red utilizzando la citometria a flusso.

Quantificazione dell'inghiottimento microgliale di materiale sinaptico mediante citometria a flusso

Scopri come quantificare le sinapsi nelle colture neuronali e nei tessuti cerebrali mediante immunocitochimica e microscopia a fluorescenza. Questo metodo permette di analizzare la connettività sinaptica con elevata precisione.

Sinapsi quantificare: un Immunocitochimica basato su analisi per quantificare Numero Synapse

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