Drosophila preparazione e imaging longitudinale della funzione cardiaca in vivo utilizzando Optical Coherence Microscopy (OCM)

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare la funzione cardiaca di Drosophila longitudinalmente in vivo utilizzando una tecnica di microscopia a coerenza ottica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo strutturale e funzionale cardiaco della Drosophila, fornendo metriche come le variazioni del diametro cardiaco, della frequenza cardiaca e del periodo di attività cardiaca durante la metamorfosi della Drosophila. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la microscopia a coerenza ottica è in grado di visualizzare i cuori di piccoli animali in modo non invasivo con un'elevata risoluzione spaziale e temporale.

Questa tecnica può aiutare a rivelare i meccanismi della malattia cardiaca umana e la relazione con lo sviluppo cardiaco a causa delle somiglianze genetiche che esistono tra Drosophila e vertebrati. Questo metodo può essere applicato anche ad altri sistemi, come la stimolazione optogenetica per lo studio o il trattamento della funzione indebolita del pacemaker in modelli animali. Quando produci le mosche per questo esperimento, lascia che le mosche riproduttive dei genitori si accoppino e depongano le uova in una fiala fresca per otto ore.

Pertanto, la covata di uova deposte si svilupperà in mosche di età simile. Per montare una larva per l'imaging OCM, preparare prima un lato pulito con un pezzo di nastro biadesivo. Spingere fuori eventuali bolle d'aria intrappolate sotto il nastro.

Quindi, utilizzare una spazzola morbida per rimuovere una larva della giusta dimensione dalla fiala. Posiziona la larva su un fazzoletto pulito. Rimuovere il cibo attaccato utilizzando una spazzola inumidita e poi lasciarlo asciugare.

Ora, al microscopio a campo largo, confermare lo stadio di sviluppo della larva. Quindi, posizionare la larva con il lato dorsale rivolto verso l'alto per il montaggio. Quindi, abbassa il vetrino adesivo sulla larva e usa una pressione moderata per fissarlo al nastro.

Posizionare la larva montata sul tavolino regolabile del sistema OCM lungo la direzione trasversale y con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Un piccolo foro nel tavolino mantiene la larva fuori dal contatto con il piano del palco. Un ampio lume del tubo cardiaco si trova dai segmenti A5 ad A8. Utilizzando le immagini in tempo reale sul computer, trova la regione posteriore del tubo cardiaco e sposta il tavolino in avanti fino a quando il segmento A7 è visibile.

Ora, imposta i parametri dell'acquisizione dell'immagine. Utilizzare 100 A-scan per B-scan e utilizzare 100 B-scan. Quindi, impostare la tensione dello scanner in modo che copra circa 0,28 millimetri nella direzione trasversale x e impostarla su 0 volt nella direzione trasversale y.

Quindi, bloccare il percorso del fascio di campionamento con un panno scuro e fare clic sul pulsante di avvio nel software per acquisire i dati sul rumore di fondo per la sottrazione dello sfondo. Per raccogliere immagini trasversali in modalità M, regolare i parametri su 128 A-scan per B-scan e utilizzare 4.096 B-scan. Quindi, regolare nuovamente la tensione in modo che copra 0,28 millimetri nella direzione x e 0 volt nella direzione y come prima.

Quindi, acquisisci le immagini in modalità M trasversale del segmento A7 del tubo cardiaco del moscerino. Durante il processo di salvataggio dei dati, bloccare il raggio di imaging con un panno scuro per ridurre al minimo l'esposizione alla luce del campione. Immagini del cuore cinque volte per ottenere una misurazione affidabile della funzione cardiaca.

Per raccogliere immagini tridimensionali, utilizzare 400 A-scan per B-scan, 800 B-scan e utilizzare una tensione di 1,7 millimetri sulla trasversale x e circa 4 millimetri sulla trasversale y. Quindi, sposta il tavolino del microscopio per osservare l'intera mosca e regola la messa a fuoco per vedere immagini nitide. Per rimuovere la larva, utilizzare una spazzola morbida e bagnata per trasferirla in una nuova fiala con cibo fresco per uno sviluppo continuo e uno studio longitudinale.

L'ampio lume del tubo cardiaco rimane ai segmenti da A5 ad A8 nello stadio pupale PD1. Al PD1, sforzarsi di visualizzare il segmento A7, come fatto con la larva dello stadio L2 e L3. Lo stadio pupale PD1 è identificato dal pupario bianco.

Questa finestra temporale è ideale per l'esecuzione di imaging ottico della pupa precoce perché l'elevata trasparenza porta a una maggiore penetrazione della luce per l'imaging OCM. Pulisci la pupa con la spazzola se c'è del cibo attaccato al corpo. Utilizzando un pennello bagnato, montare la pupa su un piccolo vetrino e tenere il lato dorsale rivolto verso l'alto.

Il vetrino dovrebbe inserirsi in un tubo volante per preservare lo sviluppo dell'animale nella propria camera. Asciugare l'acqua in eccesso dalla pupa e poi posizionarla sul palco con la pupa rivolta verso l'alto e procedere all'immagine del segmento A7 come fatto con la larva. Dopo l'imaging, trasferire il vetrino con la pupa nella provetta per una coltura continua.

Dopo lo stadio PD1, a partire dal PD2, inizia a svilupparsi una camera conica tra i segmenti A1 e A4. Poiché le pupe diventano progressivamente più opache, la profondità di penetrazione del sistema di imaging si riduce. A PD2, il guscio della pupa diventa giallastro e il corpo è meno trasparente di PD1.

A PD3, il colore della pupa è ancora un po' più scuro di quello dello stadio PD2. Allo stadio PD4, si possono osservare strisce nere all'interno del guscio. Alcuni PD4 si svilupperanno in adulti e altri entreranno nello stadio PD5.

Nella fase PD5, le strisce nere sono ancora più evidenti. Raccogli una pupa PD2 usando una pinzetta e montala su un vetrino. Sul sistema OCM, trova l'estremità anteriore del tubo cardiaco e poi spostati di circa 50 micron verso la parte posteriore per trovare il segmento A1 del tubo cardiaco.

Si noti che nello stadio PD2, la camera conica del cuore è molto piccola e potrebbe non battere ancora. Procedere con l'imaging come descritto in precedenza. Ripetere la stessa procedura per l'imaging della Drosophila agli stadi PD3, PD4 e PD5.

Per iniziare, trasferisci la mosca adulta in una fiala vuota che ha un volume di circa 45 millilitri. Quindi, immergere un applicatore di cotone nella soluzione anestetica e inserire la bacchetta nella fiala con la punta di cotone appena sotto il tappo di cotone. Attendi tre minuti.

La mosca adulta sarà anestetizzata per due minuti e mezzo o tre minuti e mezzo, a seconda delle sue dimensioni. Ora prepara un vetrino con un pezzo di nastro biadesivo. Quindi, utilizzando una spazzola morbida, spostare la mosca anestetizzata sul vetrino con il lato dorsale rivolto verso l'alto.

Sotto un microscopio ad ampio campo, separare le ali usando una pinzetta e attaccarle al nastro, esponendo così la regione del cuore per l'imaging. Ora, usa la tecnica di imaging precedentemente descritta per visualizzare il segmento A1 del cuore e sacrificare la mosca alla fine dell'esperimento. L'imaging cardiaco longitudinale è stato condotto utilizzando mosche da sforzo con una copia del driver 24B-GAL4.

Negli stadi larvali, il tubo cardiaco inizia nella regione addominale posteriore A8 con un lume più ampio e termina nel segmento dorsale anteriore A1 con un diametro più stretto. Verso la fine della PD2, una camera conica iniziò a svilupparsi nel segmento da A1 a A4. La frequenza cardiaca del moscerino è stata quantificata dalle immagini OCM trasversali in modalità M.

Curiosamente, durante le fasi pupali, il cuore smetteva di battere di tanto in tanto. Nel complesso, il battito cardiaco è rallentato in modo significativo dallo stadio larvale allo stadio pupale e poi è aumentato sostanzialmente dalla pupa all'adulto. Da questo sviluppo, questa tecnica ha fornito ai ricercatori nel campo della cardiologia dello sviluppo un nuovo strumento per esplorare gli effetti di vari geni sullo sviluppo del cuore nei modelli di Drosophila.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante seguire attentamente lo sviluppo di una Drosophila al fine di creare immagini in ogni fase dello sviluppo.