Name: Drosophila preparazione e imaging longitudinale della funzione cardiaca in vivo utilizzando Optical Coherence Microscopy (OCM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Scopri l'imaging longitudinale della funzione cardiaca in vivo in Drosophila utilizzando la microscopia a coerenza ottica. Questo metodo non invasivo fornisce parametri quantitativi sullo sviluppo cardiaco.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Lehigh University Start-Up Fund, dal NIH (R00EB010071 a C.Z., R15EB019704 a C.Z. e A.L., R03AR063271 ad A.L. e R01AG014713 e R01MH060009 a R.E.T.), dalla NSF (1455613 a C.Z. e A.L.), dal Cure Alzheimer's Fund (a R.E.T.) e dal Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. e Y.M. sono stati supportati dal National Key Basic Research Program della Cina (Programma 973) nell'ambito della sovvenzione n. 2014CB340404.

1. Preparazione di OCM sistema per l&#39;imaging ottico di Drosophila 16 <ol><li> Selezionare uno spettrometro e una fotocamera scansione linea ad alta velocità che offre un frame rate di almeno 80 frame / sec in modo che il sistema di OCM sarà in grado di risolvere il battito cardiaco di Drosophila. </li><li> Utilizzare una sorgente di luce a banda larga per garantire la risoluzione assiale di 2 micron a identificare la struttura cuore di Drosophila. </li><li> Utilizzare un obiettivo 10X per ottenere un&#39;alta risoluzione trasversale. </li><li> Utilizzare uno specchio 45 ° dell&#39;asta per riflettere il fascio luminoso braccio di riferimento e per generare un fascio di luce braccio del campione anulare per estendere la profondità di fuoco nei campioni. </li><li> Sviluppare un programma informatico personalizzato per controllare il sistema OCM e di eseguire misurazioni. </li></ol> 2. Cultura Drosophila <ol><li> Standard Fly Food Preparation <ol><li> Mettere ~ 5 ml istante formula Drosophila in una fiala di polistirolotubo con l&#39;assistenza di un scivolo carta. </li><li> Versare ~ 8 ml di acqua nella formula per saturare correttamente il cibo. </li><li> Aggiungere integratori diversi per il cibo fly standard per diversi esperimenti. Quando si prepara per All -retinal (ATR) cibo trans per la stimolazione optogenetic esperimento 35, utilizzare una pipetta per estrarre 100 mM ATR e dissolversi in ~ 8 ml di acqua per ottenere la concentrazione ATR di 1 mm negli alimenti. Dopo la miscelazione la soluzione in modo uniforme, versare la soluzione nella formula e mescolate a sufficienza. </li><li> Per preparare un alto contenuto di grassi-dieta per studiare all&#39;obesità disfunzioni cardiache in Drosophila, 10,15 mix ~ 10 ml formula con 15 ml di acqua in una tazza e calore per 30 secondi in un forno a microonde. Mettere un po &#39;di olio extra vergine di cocco in un altro tazza e riscaldare per 90 secondi nel forno a microonde. </li><li> Estrarre 7,5 ml di olio di cocco e mescolare con la formula preparata sufficientemente per rendere il rapporto peso / volume di olio di cocco per alimentare ~ 30/100 e then estratto ~ 2 ml cibo mescolato e messo sul fondo di un tubo. </li><li> Attendere per 1 minuto fino a quando il mezzo è completamente saturo. Compattare il cibo con cura con una superficie piana per ottimizzare le condizioni di vita della Drosophila. Aggiungere 6 - 8 grani di lievito alla formula preparata, e inserire il tubo con un gruppo di cotone. </li></ol></li><li> Mosca della frutta Croci e cultura <ol><li> Prendere un tubo con il cibo volare standard preparato, e rimuovere il cotone collegato. Trasferire accuratamente le mosche adulte (maschio e femmina) al tubo, e collegare il tubo con cotone immediatamente. Controllare il cotone per assicurarsi che non vi sia spazio tra il cotone e la parete del tubo per impedire linea di fuoriuscire dal tubo. </li><li> Tenere le mosche di frutta in incubatore a 25 ° C per incroci. La maggior parte dei geni sono attivi e le proteine cellulari sono sintetizzati a 25 ° C 36-39. </li><li> Prendete il tubo dalla incubatrice dopo 8 trasferimento mano undult vola fuori del tubo per ottenere le uova all&#39;età simile per controllo sperimentale. </li><li> Continuare coltivando le uova nel incubatore a 25 ° C, che è la temperatura standard per lo sviluppo Drosophila con il periodo di sviluppo di 8,5 giorni 40,41. NOTA: La temperatura influisce il periodo di sviluppo (uovo ad adulto) e il livello di espressione di vari geni. </li></ol></li></ol> 3. Esecuzione Imaging ottico con OCM <ol><li> Mount Fly Larva per l&#39;imaging ottico NOTA: L&#39;uovo di portelli di Drosophila in 22 - 24 ore a 25 ° C al primo larva instar (L1). La seconda larva instar emerge dopo l&#39;altro 24 ore. La più grande forma larvale è la terza larva instar, che mute dopo circa 24 ore. Caratteristiche strutturali in larve possono essere usati per distinguere i loro diversi stadi di sviluppo. La dimensione delle boccale tra primo stadio e il secondo instar è diversa. La boccaganci del primo larva instar sono molto piccole e sembrano due coppie di piccole macchie nere, mentre i ganci bocca del secondo larva instar sono più grandi e la struttura è chiara. Gli spiracoli sono di solito utilizzati per identificare il secondo e il terzo instar stadio. La seconda larva instar ha bastonato spiracoli anteriori, mentre, per il terzo stadio, i spiracoli anteriori sono ramificati. Un anello arancio scuro inizierà ad apparire sulla punta delle spiracoli posteriori della terza larva instar. <ol><li> Applicare un pezzo di nastro biadesivo per un vetrino da microscopio pulito. Espellere le bolle d&#39;aria sotto il nastro per evitare le riflessioni causate da bolle d&#39;aria durante l&#39;imaging. </li><li> Prendete uno dei tubi con le mosche in coltura fuori dal termostato nella fase larvale. </li><li> Identificare la larva nei media, rimuoverlo dal supporto con una spazzola morbida e posto su un panno pulito. Rimuovere qualsiasi cibo attaccato alla larva con una spazzola morbida umida e asciugare sul tessuto. </li><li> Spostare il cleaned volare a un tessuto sotto la lente obiettivo di un ampio campo di microscopio. </li><li> Regolare il fuoco del microscopio per trovare una visione chiara della mosca. Identificare il giusto stadio di sviluppo della larva per le sue caratteristiche strutturali con il microscopio. </li><li> Posizionare il volo usando la spazzola morbida. Assicurarsi che il corpo è dritto con il lato dorsale rivolta verso l&#39;alto per preparare per il montaggio sul vetrino dal lato dorsale. Eseguire questo passaggio sotto il microscopio. </li><li> Assicurarsi che la larva è completamente asciutto prima di montare sul nastro. Altrimenti, la larva non aderisce al nastro. </li><li> Attaccare il lato dorsale della mosca posizionata per il doppio nastro laterale sul vetrino con una pressione moderata. Si noti che la troppa pressione può uccidere la mosca e troppo poca forza porterà a volare il movimento durante l&#39;imaging. </li></ol></li><li> Imaging ottico di Drosophila a stadi larvali (L2 e L3) con OCM NOTA: Una vasta lume del tubo cuore può essere found situato nei segmenti tra A5 ad A8 nelle fasi larvali (Figura 1). Le immagini OCM M-mode trasversali (2D + tempo) sono stati acquisiti al segmento A7 del tubo cuore per ogni larva per facilitare la sistolica e diastolica analisi. <ol><li> Posizionare la larva montato sulla fase del campione regolabile del sistema OCM lungo la direzione y trasverso con il lato dorsale verso l&#39;alto sotto la lente obiettivo. Un piccolo foro nella fase del campione è necessaria per posizionare la larva per evitare il contatto con il piano fase. </li><li> Regolare la fase del campione per spostare il tubo cuore del frutto mosca al piano focale del fascio di imaging. Per trovare facilmente il segmento A7, trovare la regione posteriore del tubo di cuore con la croce in tempo reale le immagini sezionali OCM nel software di acquisizione delle immagini. Quindi spostare il palco in avanti fino a quando il segmento A7 è visibile. </li><li> Impostare i parametri del software di acquisizione immagini a 100 A-scan per B-scan (telaio), 100 B-scan, e il scannetensione r per coprire ~ 0,28 mm nella direzione x trasverso, e 0 V nella direzione y-trasversale. Fare clic sul pulsante &quot;start&quot; nel software per l&#39;acquisizione dei dati sul rumore di fondo per la sottrazione del fondo, bloccando il percorso del fascio campione con un panno scuro. NOTA: 3 100 telai possono essere utilizzati per la sottrazione del fondo. </li><li> Impostare parametri del software di acquisizione dati a 128 A-scan per B-scan, 4096 B-scan, e la tensione scanner per coprire ~ 0,28 millimetri nella direzione x trasverso, e 0 V nella direzione y-trasversale. Fare clic sul pulsante &quot;start&quot; nel software per l&#39;acquisizione delle immagini M-mode trasversali in tutto il segmento A7 del tubo cuore volare su una regione che copre 0,28 x 0,57 millimetri 2 per circa 30 sec. </li><li> Bloccare il fascio di imaging con un panno scuro durante il processo di salvataggio dei dati al fine di evitare l&#39;esposizione prolungata del cuore volare verso la luce di imaging. </li><li> Ripetere la misurazione per 5 volte per ottenere la misurazione affidabile del cuore divertimentoction. </li><li> Impostare i parametri del software di acquisizione immagini a 400 A-scan per B-scan, 800 B-scan, e la tensione scanner per coprire ~ 1,7 millimetri nella direzione x trasverso, e ~ 4 mm in direzione y trasversale. Spostare lo stadio in entrambe le direzioni per garantire l&#39;intero mosca della frutta può essere ripreso. Fare clic sul pulsante &quot;start&quot; nel software di acquisire una serie di dati per ottenere immagini della mosca della frutta in 3 dimensioni. Nota: la struttura mosca 3D può essere resa utilizzando il software Amira 3D </li><li> Utilizzare una spazzola morbida bagnata per inumidire la mosca misurato e rimuovere delicatamente dal vetrino. Spostare in un tubo separato per lo sviluppo continuo. Etichettare la provetta per studio longitudinale attraverso le fasi successive di sviluppo. </li></ol></li><li> Immagine Drosophila nelle fasi di pupa Nota: Tutti i moscerini della frutta sono stati portati fuori per l&#39;imaging dal PD1 a PD5. Come mostrato nello schema larva in Figura 1b, un&#39;ampia lumen rimane in A5 ad A8 segmenti di thTubo cuore e fino PD1. Da PD2, una camera conica inizia a svilupparsi tra A1 ai segmenti A4. Per acquisire immagini coerenti e facilitare l&#39;analisi del cuore, immagini di modo M trasversali sono stati ottenuti dal segmento A7 a PD1 e dal segmento A1 dopo PD2, come indicato nella Figura 1b. <ol><li> Immagine Drosophila a PD1 NOTA: Drosophila avrà un puparium bianco per una finestra temporale breve (0-1 ore) durante PD1. Questa finestra temporale è l&#39;ideale per l&#39;esecuzione di imaging ottico di pupa presto perché l&#39;elevata trasparenza porta ad una maggiore penetrazione della luce per imaging OCM. <ol><li> Come i moscerini della frutta si trovano sulla parete del tubo quando diventano pupa, rimuovere la pupa da singoli tubi per l&#39;imaging a PD1 con una spazzola morbida bagnata, e pulire la pupa con la spazzola se c&#39;è cibo bloccato al corpo. </li><li> Montare la mosca della frutta su un piccolo vetrino direttamente con il pennello bagnato e mantenere il lato dorsale verso l&#39;alto (Figura 1a </strong&gt;). Assicurarsi che il vetrino è abbastanza piccolo da entrare nel tubo, una volta di imaging in questa fase è completa. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua in eccesso dal lato del corpo mosca. </li><li> Mettere il vetrino sul palco campione del dispositivo OCM, mantenendo la mosca della frutta in cima. Trova chiara immagine in tempo reale del segmento A7 del cuore mosca utilizzando la stessa strategia descritta nella misurazione larva. </li><li> Impostare gli stessi parametri del software di acquisizione dei dati, come nella sezione 3.2, e l&#39;immagine dei battiti cardiaci al segmento A7 di acquisire M-mode trasversale e immagini 3D. </li><li> Dopo l&#39;imaging, usare una pinzetta per posizionare il vetrino con pupa di nuovo nel tubo per la cultura in continuo. </li></ol></li><li> Immagine Drosophila a PD2 alle fasi PD5 NOTA: Poiché il campione diventa sempre più opaco durante le fasi pupa, la profondità di penetrazione del sistema di imaging sarà ridotto. <ol><li> Utilizzare una pinzetta per rimuovere con attenzione il vetro slide montato con la mosca al PD2 dal tubo per l&#39;imaging. Al PD2, il guscio campione diventa giallastra e il corpo diventa meno trasparente rispetto al PD1 (Figura 1). </li><li> Mettere il vetrino sul palco campione del sistema di OCM. </li><li> Regolare la fase del campione per spostare la mosca nel piano focale dell&#39;imaging fascio del sistema OCM. Trova l&#39;estremità anteriore del tubo cuore immagine OCM della sezione trasversale in tempo reale con. Spostare ~ 50 micron nella direzione posteriori per trovare il segmento A1 del tubo cuore. NOTA: A questo punto dello sviluppo del cuore (PD2), la camera conica sarà molto piccolo e non può essere battuto. </li><li> Raccogliere trasversali set di dati M-mode dal segmento A1 nonché i dati 3D utilizzando lo stesso metodo di precedenti fasi di sviluppo. </li><li> Mettere la slitta di nuovo al tubo con attenzione per la cultura in continuo. NOTA: A PD3, il colore del campione nel guscio è più scura di quella alla PD2 fase. A PD4 fase, strisce nere can essere osservato all&#39;interno del guscio dei campioni. Alcune mosche si svilupperà in adulti da questa fase del giorno successivo, mentre altri si evolveranno in PD5. A PD5 fase, strisce nere sono ancora più ovviamente visto nei moscerini della frutta. Queste mosche diventeranno adulti nel giorno seguente. </li></ol></li></ol></li><li> Immagine Drosophila allo stadio adulto NOTA: Nella fase adulta, mosche femminili e maschili si distinguono per le dimensioni del corpo e il colore del basso addome. gli adulti di sesso femminile hanno dimensioni più grandi, mentre i maschi sono più piccoli e di colore scuro nel basso addome. <ol><li> Prendete il tubo fuori dal termostato quando il moscerino della frutta si sviluppa in un adulto, e trasferire l&#39;adulto volare ad una ~ 45 ml fiala vuota. </li><li> Immergere l&#39;estremità assorbente (~ 1 cm di lunghezza, ~ 3 mm di diametro) di una bacchetta in anestesia, mettere la bacchetta nella fiala, e inserire il tubo con un gruppo di cotone per mantenere fine anestetico appena sotto il cotone collegato e Anesthetize la mosca per 3 min. La durata dell&#39;anestesia dipende dalla dimensione della mosca, e può variare da 2.5 a 3.5 min (per esempio: maschile per 2,5 min e femmina per 3 o 3,5 min). </li><li> Preparare un vetrino con un pezzo di nastro biadesivo. </li><li> Spostare la mosca anestetizzato sul vetrino con il lato dorsale verso l&#39;alto utilizzando la spazzola morbida. </li><li> Separare le ali con una pinzetta e bastone le ali sul nastro al microscopio per risolvere al volo ed esporre la regione del cuore per l&#39;imaging. </li><li> Immagine fly dal segmento A1 del cuore fly (Figura 1). Alla fine dell&#39;esperimento, la mosca può essere sacrificato. </li></ol></li></ol> 4. Imaging Analisi 16 <ol><li> Sviluppare programmi MATLAB per convertire i file binari 2D e 3D raccolti con il software di acquisizione delle immagini in file di immagine. </li><li> Utilizzare ImageJ per identificare la regione tubo cuore nelle immagini M-mode trasversali e un algoritmo di bacchetta magica per creatEA maschera della regione del cuore per ogni immagine M-mode trasversale. Segmento la regione mascherato e utilizzare un algoritmo di picco di accertamento per identificare le posizioni sistolica e diastolica. Calcolare il tempo cambia dipendenti diametro cuore dalle immagini M-mode trasversali. </li><li> In base al tempo acquisito diametri cardiaci dipendenti, calcolare i parametri cardiaci, quali HR, periodo di attività cardiaca (PAC), fine diametro diastole (EDD), fine diametro sistole (ESD), fine zona diastole (EDA), e terminare zona sistole ( ESA). Calcolare la frazione di accorciamento (FS) con <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/55002/55002eq1.jpg" /></li><li> Utilizzare ImageJ per analizzare le immagini 3D OCM di visualizzare lo sviluppo strutturale del cuore mosca. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse in relazione al presente studio.

La tachicardia di Drosophila, con un HR massima intorno a 400 bpm nelle fasi larvali e adulte, richiede alta velocità di imaging per risolvere i diastole e sistole del cuore (non meno di 80 fotogrammi / sec sulla base di esperienze). Grazie allo spessore piccole dimensioni camera cardiaca e micron scala parete cardiaca (5 - 10 micron), una risoluzione spaziale elevata (migliore di 2 micron) è richiesto per risolvere le strutture tubo cuore. In questo studio, ad alta risoluzione e sistema OCM velocità altissima ...

Studio longitudinale del cuore nei piccoli animali contribuisce alla comprensione di una varietà di malattie cardiovascolari correlate umane, come ad esempio difetti cardiaci congeniti legati gene 1,2. Nei decenni passati, vari modelli animali, come ad esempio 3,4 mouse, Xenopus 5,6, 7,8 zebrafish, aviario 9, e Drosophila 10-16, sono stati utilizzati per condurre il cuore umano-sviluppo relativi ricerca. Il modello di topo è stato ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo cardiaco normale e anormale e fenotipi difetto cardiaco a causa della sua somiglianza con lo 3,4 cuore umano. L&#39;embrione Xenopus è particolarmente utile nello studio di sviluppo del cuore per la sua maneggevolezza e trasparenza parziale 5,6. La trasparenza dell&#39;embrione e larva precoce del modello zebrafish permette una facile l&#39;osservazione ottica di 7,8 sviluppo cardiaco. Il modello di aviaria è un tema comune di studi di cuore di sviluppo because il cuore può essere facilmente accessibile dopo aver rimosso i gusci d&#39;uovo e la somiglianza morfologica dei cuori aviaria per l&#39;uomo 9. Il modello Drosophila ha alcune caratteristiche uniche che lo rendono ideale per l&#39;esecuzione di studi longitudinali del cuore. In primo luogo, il tubo cuore di Drosophila è ~ 200 micron sotto la superficie dorsale, che fornisce la convenienza per l&#39;accesso ottico e l&#39;osservazione del cuore. Inoltre, molti meccanismi molecolari e percorsi genetici sono conservati tra Drosophila e vertebrati. I ortologhi di oltre il 75% dei geni delle malattie umane sono stati trovati in Drosophila, che hanno reso ampiamente usato negli studi di transgenici 11,13. Inoltre, si ha un breve ciclo di vita e bassi costi di manutenzione, ed è stato comunemente utilizzato come modello esemplare per la ricerca biologia dello sviluppo 14-16. Studi precedenti hanno descritto i protocolli per il controllo delle funzioni cardiache Drosophila come l&#39;haArtbeat. Tuttavia, le procedure di dissezione sono stati richiesti 17,18. L&#39;imaging ottico fornisce un modo efficace per visualizzare sviluppo cardiaco negli animali a causa della sua natura non invasiva. Diverse modalità di imaging ottico sono stati applicati nello svolgimento di studio cardiaco animale, come microscopia a due fotoni 19, microscopia confocale 20,21, foglio di microscopia ottica 22, e tomografia a coerenza ottica (OCT) 16,23-26. Comparativamente, OCT è in grado di fornire grande profondità di imaging in piccoli cuori animali senza utilizzare mezzi di contrasto, mantenendo un&#39;alta risoluzione e una velocità di imaging altissima, che sono importanti per gli animali vivi di imaging. Inoltre, il basso costo di sviluppare un sistema PTOM gode popolare questa tecnica per imaging ottico di campioni. Ottobre è stato utilizzato con successo per lo studio longitudinale della Drosophila. Utilizzando Office, l&#39;imaging cardiaco morfologica e funzionale, è stata eseguita per studiare le strutture del cuore, il funcruoli zionali di geni e dei meccanismi di difetti cardiovascolari nei modelli mutanti durante lo sviluppo cardiaco. Ad esempio, il declino della funzione cardiaca età-dipendente è stata confermata con l&#39;enzima legati (ACER) gene down-regolato dell&#39;enzima di conversione in Drosophila con 27 ott. Fenotipizzazione di cardiomiopatia correlata gene è stata dimostrata in Drosophila utilizzando ottobre 28-33. La ricerca che utilizza ottobre ha anche rivelato il ruolo funzionale del gene SOX5 umana nel cuore di Drosophila 34. Rispetto Office, OCM utilizza un obiettivo con un&#39;apertura numerica più elevata prestazione migliore risoluzione trasversale. In passato, la disfunzione cardiaca causata da un silenziamento ortologo gene circadiano umano dCry / dClock è stato studiato utilizzando un sistema OCM personalizzata 15,16, così come l&#39;effetto di alto contenuto di grassi-dieta su cardiomiopatie in Drosophila comprendere indotta obesità umana malattie cardiache. 15 Qui, thprotocollo sperimentale e viene riassunta per lo studio longitudinale dei cambiamenti morfologici e funzionali cardiaci in Drosophila in seconda instar (L2), terzo stadio (L3), giorno pupa 1 (PD1), giorno pupa 2 (PD2), pupa giorno 3 (PD3) , pupa giorno 4 (PD4), pupa giorno 5 (PD5) e adulti (Figura 1) utilizzando OCM per facilitare lo studio delle patologie cardiache congenite umane legate. parametri funzionali cardiaci, come risorse umane e CAP sono stati quantitativamente analizzati a diversi stadi di sviluppo per rivelare le caratteristiche di sviluppo cardiaci.

<table><tbody><tr><td>Sistema di imaging OCM personalizzato</td><td>Sviluppato nel nostro laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>il mio Temp Mini Incubatrice digitale</td><td>Benchmark</td><td>H2200-HC</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura</td><td>AmScope</td><td>200PCS</td><td></td></tr><tr><td>Batuffolo di cotone</td><td>RITE AID</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formula Drosophila istantanea</td><td>Formula CAROLINA</td><td>4-24</td><td></td></tr><tr><td>Lievito</td><td>ActiveDry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>SONY</td><td>WILD M420</td><td></td></tr><tr><td>Pennello</td><td>Loew-Cornell</td><td>245B</td><td>utilizzato per spostare i campioni</td></tr><tr><td>Software Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Pinzetta Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wiha</td><td>AA SA</td><td>per fissare il frutto ali di mosca</td></tr><tr><td>FlyNap</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>4.224.898</td><td></td></tr><tr><td>Nastro biadesivo permanente Scotch, pipetta scozzese 3 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>MU18837</td><td></td></tr><tr><td>Olio di cocco extra biologico</td><td>Spring Valley</td><td>13183</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio</td><td>CapitolBrand</td><td>M3504-E</td><td></td></tr><tr><td> Drosophila Fiale</td><td>SEOH</td><td>8401SS</td><td></td></tr><tr><td>All-trans-retinal</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>R2500</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila preparazione e imaging longitudinale della funzione cardiaca in vivo utilizzando optical coherence microscopy (ocm)

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Lo studio longitudinale del battito cardiaco nei piccoli animali contribuisce alla comprensione dei cambiamenti strutturali e funzionali durante lo sviluppo del cuore. La microscopia a coerenza ottica (OCM) ha dimostrato di essere in grado di visualizzare cuori di piccoli animali con un'elevata risoluzione spaziale e un'altissima velocità di imaging. L'elevato contrasto dell'immagine e le proprietà non invasive rendono l'OCM ideale per l'esecuzione di studi longitudinali senza richiedere dissezioni o colorazioni tissutali. La Drosophila è stata ampiamente utilizzata come organismo modello negli studi sullo sviluppo cardiaco grazie al suo alto numero di geni ortologhi di malattie umane, alla sua somiglianza di meccanismi molecolari e percorsi genetici con i vertebrati, al suo breve ciclo di vita e al suo basso costo di coltura. Qui, vengono descritti i protocolli sperimentali per la preparazione di Drosophila e l'imaging ottico del battito cardiaco con un sistema OCM personalizzato per tutto il ciclo di vita del campione. Seguendo i passaggi forniti in questo rapporto, è possibile acquisire immagini trasversali M-mode e OCM 3D per condurre studi longitudinali della morfologia e della funzione cardiaca della Drosophila. Le immagini OCM en face e assiali e gli istogrammi della frequenza cardiaca (HR) e del periodo di attività cardiaca (CAP) hanno anche dimostrato di analizzare i cambiamenti strutturali del cuore e di quantificare la dinamica del cuore durante la metamorfosi di Drosophila, combinati con i video costruiti con immagini M-mode per tracciare l'attività cardiaca in modo intuitivo. A causa della somiglianza genetica tra Drosophila e vertebrati, lo studio longitudinale della morfologia e della dinamica del cuore nei moscerini della frutta potrebbe aiutare a rivelare le origini delle malattie cardiache umane. Il protocollo qui fornito fornirebbe un metodo efficace per eseguire un'ampia gamma di studi per comprendere i meccanismi delle malattie cardiache nell'uomo.

L&#39;imaging cardiaco longitudinale è stato condotto utilizzando i moscerini della frutta con il 24B-GAL4 / + ceppo a temperatura ambiente con OCM. Le misurazioni sono state effettuate a L2, L3, e ad 8 intervalli hr da PD1 a PD4, e il giorno adulto 1 (AD1) per seguire il processo metamorfosi (Tabella 1). Larva, pupa presto, tardi pupa e adulto mosche sono stati montati sui vetrini come mostrato nella figura 1A. Le caratteristiche del segmento del cuore per le mosche larvali e adulte so...

Qui, vengono descritti i protocolli sperimentali per preparare la Drosophila in diversi stadi di sviluppo e per eseguire l'imaging ottico longitudinale dei battiti cardiaci della Drosophila utilizzando un sistema di microscopia a coerenza ottica (OCM) personalizzato. I cambiamenti morfologici e dinamici cardiaci possono essere caratterizzati quantitativamente analizzando i parametri strutturali e funzionali del cuore da immagini OCM.

Drosophila preparazione e imaging longitudinale della funzione cardiaca in vivo utilizzando Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare la funzione cardiaca di Drosophila longitudinalmente in vivo utilizzando una tecnica di microscopia a coerenza ottica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo strutturale e funzionale cardiaco della Drosophila, fornendo metriche come le variazioni del diametro cardiaco, della frequenza cardiaca e del periodo di attività cardiaca durante la metamorfosi della Drosophila. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la microscopia a coerenza ottica è in grado di visualizzare i cuori di piccoli animali in modo non invasivo con un'elevata risoluzione spaziale e temporale.Questa tecnica può aiutare a rivelare i meccanismi della malattia cardiaca umana e la relazione con lo sviluppo cardiaco a causa delle somiglianze genetiche che esistono tra Drosophila e vertebrati. Questo metodo può essere applicato anche ad altri sistemi, come la stimolazione optogenetica per lo studio o il trattamento della funzione indebolita del pacemaker in modelli animali. Quando produci le mosche per questo esperimento, lascia che le mosche riproduttive dei genitori si accoppino e depongano le uova in una fiala fresca per otto ore.Pertanto, la covata di uova deposte si svilupperà in mosche di età simile. Per montare una larva per l'imaging OCM, preparare prima un lato pulito con un pezzo di nastro biadesivo. Spingere fuori eventuali bolle d'aria intrappolate sotto il nastro.Quindi, utilizzare una spazzola morbida per rimuovere una larva della giusta dimensione dalla fiala. Posiziona la larva su un fazzoletto pulito. Rimuovere il cibo attaccato utilizzando una spazzola inumidita e poi lasciarlo asciugare.Ora, al microscopio a campo largo, confermare lo stadio di sviluppo della larva. Quindi, posizionare la larva con il lato dorsale rivolto verso l'alto per il montaggio. Quindi, abbassa il vetrino adesivo sulla larva e usa una pressione moderata per fissarlo al nastro.Posizionare la larva montata sul tavolino regolabile del sistema OCM lungo la direzione trasversale y con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Un piccolo foro nel tavolino mantiene la larva fuori dal contatto con il piano del palco. Un ampio lume del tubo cardiaco si trova dai segmenti A5 ad A8. Utilizzando le immagini in tempo reale sul computer, trova la regione posteriore del tubo cardiaco e sposta il tavolino in avanti fino a quando il segmento A7 è visibile.Ora, imposta i parametri dell'acquisizione dell'immagine. Utilizzare 100 A-scan per B-scan e utilizzare 100 B-scan. Quindi, impostare la tensione dello scanner in modo che copra circa 0,28 millimetri nella direzione trasversale x e impostarla su 0 volt nella direzione trasversale y.Quindi, bloccare il percorso del fascio di campionamento con un panno scuro e fare clic sul pulsante di avvio nel software per acquisire i dati sul rumore di fondo per la sottrazione dello sfondo. Per raccogliere immagini trasversali in modalità M, regolare i parametri su 128 A-scan per B-scan e utilizzare 4.096 B-scan. Quindi, regolare nuovamente la tensione in modo che copra 0,28 millimetri nella direzione x e 0 volt nella direzione y come prima.Quindi, acquisisci le immagini in modalità M trasversale del segmento A7 del tubo cardiaco del moscerino. Durante il processo di salvataggio dei dati, bloccare il raggio di imaging con un panno scuro per ridurre al minimo l'esposizione alla luce del campione. Immagini del cuore cinque volte per ottenere una misurazione affidabile della funzione cardiaca.Per raccogliere immagini tridimensionali, utilizzare 400 A-scan per B-scan, 800 B-scan e utilizzare una tensione di 1,7 millimetri sulla trasversale x e circa 4 millimetri sulla trasversale y. Quindi, sposta il tavolino del microscopio per osservare l'intera mosca e regola la messa a fuoco per vedere immagini nitide. Per rimuovere la larva, utilizzare una spazzola morbida e bagnata per trasferirla in una nuova fiala con cibo fresco per uno sviluppo continuo e uno studio longitudinale.L'ampio lume del tubo cardiaco rimane ai segmenti da A5 ad A8 nello stadio pupale PD1. Al PD1, sforzarsi di visualizzare il segmento A7, come fatto con la larva dello stadio L2 e L3. Lo stadio pupale PD1 è identificato dal pupario bianco.Questa finestra temporale è ideale per l'esecuzione di imaging ottico della pupa precoce perché l'elevata trasparenza porta a una maggiore penetrazione della luce per l'imaging OCM. Pulisci la pupa con la spazzola se c'è del cibo attaccato al corpo. Utilizzando un pennello bagnato, montare la pupa su un piccolo vetrino e tenere il lato dorsale rivolto verso l'alto.Il vetrino dovrebbe inserirsi in un tubo volante per preservare lo sviluppo dell'animale nella propria camera. Asciugare l'acqua in eccesso dalla pupa e poi posizionarla sul palco con la pupa rivolta verso l'alto e procedere all'immagine del segmento A7 come fatto con la larva. Dopo l'imaging, trasferire il vetrino con la pupa nella provetta per una coltura continua.Dopo lo stadio PD1, a partire dal PD2, inizia a svilupparsi una camera conica tra i segmenti A1 e A4. Poiché le pupe diventano progressivamente più opache, la profondità di penetrazione del sistema di imaging si riduce. A PD2, il guscio della pupa diventa giallastro e il corpo è meno trasparente di PD1.A PD3, il colore della pupa è ancora un po' più scuro di quello dello stadio PD2. Allo stadio PD4, si possono osservare strisce nere all'interno del guscio. Alcuni PD4 si svilupperanno in adulti e altri entreranno nello stadio PD5.Nella fase PD5, le strisce nere sono ancora più evidenti. Raccogli una pupa PD2 usando una pinzetta e montala su un vetrino. Sul sistema OCM, trova l'estremità anteriore del tubo cardiaco e poi spostati di circa 50 micron verso la parte posteriore per trovare il segmento A1 del tubo cardiaco.Si noti che nello stadio PD2, la camera conica del cuore è molto piccola e potrebbe non battere ancora. Procedere con l'imaging come descritto in precedenza. Ripetere la stessa procedura per l'imaging della Drosophila agli stadi PD3, PD4 e PD5.Per iniziare, trasferisci la mosca adulta in una fiala vuota che ha un volume di circa 45 millilitri. Quindi, immergere un applicatore di cotone nella soluzione anestetica e inserire la bacchetta nella fiala con la punta di cotone appena sotto il tappo di cotone. Attendi tre minuti.La mosca adulta sarà anestetizzata per due minuti e mezzo o tre minuti e mezzo, a seconda delle sue dimensioni. Ora prepara un vetrino con un pezzo di nastro biadesivo. Quindi, utilizzando una spazzola morbida, spostare la mosca anestetizzata sul vetrino con il lato dorsale rivolto verso l'alto.Sotto un microscopio ad ampio campo, separare le ali usando una pinzetta e attaccarle al nastro, esponendo così la regione del cuore per l'imaging. Ora, usa la tecnica di imaging precedentemente descritta per visualizzare il segmento A1 del cuore e sacrificare la mosca alla fine dell'esperimento. L'imaging cardiaco longitudinale è stato condotto utilizzando mosche da sforzo con una copia del driver 24B-GAL4.Negli stadi larvali, il tubo cardiaco inizia nella regione addominale posteriore A8 con un lume più ampio e termina nel segmento dorsale anteriore A1 con un diametro più stretto. Verso la fine della PD2, una camera conica iniziò a svilupparsi nel segmento da A1 a A4. La frequenza cardiaca del moscerino è stata quantificata dalle immagini OCM trasversali in modalità M.Curiosamente, durante le fasi pupali, il cuore smetteva di battere di tanto in tanto. Nel complesso, il battito cardiaco è rallentato in modo significativo dallo stadio larvale allo stadio pupale e poi è aumentato sostanzialmente dalla pupa all'adulto. Da questo sviluppo, questa tecnica ha fornito ai ricercatori nel campo della cardiologia dello sviluppo un nuovo strumento per esplorare gli effetti di vari geni sullo sviluppo del cuore nei modelli di Drosophila.Durante il tentativo di questa procedura, è importante seguire attentamente lo sviluppo di una Drosophila al fine di creare immagini in ogni fase dello sviluppo.

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Presentato qui è un protocollo per microiniettare e contemporaneamente immaginire più embrioni di Drosophila durante lo sviluppo embrionale utilizzando un imager a base di piastre e ad alto contenuto.

Preparazione e microiniezione dell'embrione Drosophila per microscopia a cellule vive eseguita utilizzando un analizzatore automatizzato ad alto contenuto

Il presente protocollo descrive la generazione di Drosophila melanogaster che esprime le opsine eNpHR2.0 o ReaChR nel cuore per l'imaging OCT e la stimolazione cardiaca optogenetica. Sono riportate istruzioni dettagliate per l'imaging OCT di Drosophila e la modulazione del battito cardiaco, compresa la simulazione di arresto cardiaco ripristinabile, bradicardia e tachicardia in animali vivi in diversi stadi di sviluppo.

Sviluppo di modelli di Drosophila melanogaster per l'imaging e il controllo optogenetico della funzione cardiaca

La contrattilità dell'actomiosina svolge un ruolo importante nella morfogenesi cellulare e tissutale. Tuttavia, è difficile manipolare la contrattilità dell'actomiosina in vivo in modo acuto. Questo protocollo descrive un sistema optogenetico che inibisce rapidamente la contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 negli embrioni di Drosophila , rivelando l'immediata perdita di tensione epiteliale dopo l'inattivazione dell'actomiosina in vivo.

Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila

Il protocollo di imaging a fluorescenza e sezionamento cardiaco di Drosophila semplifica lo studio della struttura e delle patologie cardiache. Questo approccio prevede il sezionamento, la colorazione e l'imaging semplici, bypassando le competenze tecniche necessarie per la dissezione tradizionale. Migliora l'accessibilità, rendendo la Drosophila un modello più ampiamente utilizzabile per la ricerca cardiaca all'interno della più ampia comunità scientifica.

Metodo nuovo ed efficiente per la colorazione a fluorescenza cardiaca di Drosophila con criosezione

Scopri l'imaging longitudinale della funzione cardiaca in vivo in Drosophila utilizzando la microscopia a coerenza ottica. Questo metodo non invasivo fornisce parametri quantitativi sullo sviluppo cardiaco.

Drosophila preparazione e imaging longitudinale della funzione cardiaca in vivo utilizzando Optical Coherence Microscopy (OCM)

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