Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

Questo video spiega come eseguire la microscopia elettronica a trasmissione, nota anche come TEM, sul cartilagine embrionale di drosophila. Il cuore si è affermato come un sistema modello prezioso per lo studio della migrazione cellulare, dell'adesione tra cellule e dei cambiamenti nella forma cellulare. Questa tecnica consente la visualizzazione della forma del lume cardiaco, nonché di componenti ultrastrutturali come le membrane cellulari, le giunzioni intercellulari e la membrana basale.

Per iniziare questa procedura, si prepara una soluzione di fissazione adatta alla microscopia elettronica a trasmissione di embrioni di drosophila. Successivamente, una raccolta di embrioni rivestiti di età compresa tra zero e 20 ore viene posta nella soluzione di fissazione. Al termine, gli embrioni vengono rimossi dalla soluzione di fissazione e manipolati mentre sono ancora attaccati a un nastro adesivo doppio.

In una piastra di Petri contenente tampone, gli embrioni deionizzati galleggiano nel tampone e vengono recuperati con una pipetta. Successivamente, gli embrioni vengono postfissati e sottoposti a un gradiente di disidratazione. Una volta infiltrati con resina, vengono trasferiti in uno stampo per inclusione in cui vengono allineati.

Il blocco risultante viene tagliato con un coltello al diamante. Le sezioni sono raccolte su griglie di rame, colorate e osservate. Ciao, sono Nadine Lop del laboratorio di Sunita Kramer del Dipartimento di Anatomia Patologica e Medicina di Laboratorio presso l'Università di Medicina e Odontoiatria del New Jersey della Robert Wood Johnson Medical School.

Sono Raj Patel. Sono il microscopista elettronico anche presso la patologia PON. Oggi vi mostreremo un procedimento per la preparazione e l'analisi di embrioni di oph mediante microscopia elettronica a trasmissione.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la morfogenesi cardiaca di Drosophila. Dunque, iniziamo. Iniziamo.

Prima di manipolare gli embrioni di drosophila, preparare frescamente la soluzione fissativa per il metodo di fissazione degli embrioni mediante permeazione con eptano. In una cappa da laboratorio, pipettare due millilitri di una soluzione appena preparata contenente glutaraldeide al 12,5% in buffer Cate in un vial di vetro per scintillazione. Aggiungere otto millilitri di eptano ADA e agitare vigorosamente.

Quindi attendere un minuto. Lasciare che le due fasi si separino: la fase superiore contiene l'ADA eptano, saturato con glutaraldeide, che è la soluzione fissativa. Pipettare la fase superiore in un vial pulito e metterla da parte. Per raccogliere embrioni da zero a 20 ore, utilizzare una camera di raccolta per embrioni, costituita da un piccolo cestello con un inserto rimovibile in maglia.

Iniziare rimuovendo la piastra di succo d'uva contenente gli embrioni ed eliminare eventuali moscerini morti. Quindi, utilizzando acqua e un pennello, staccare delicatamente gli embrioni dalla piastra di succo d'uva e trasferirli nella camera di raccolta degli embrioni usando una bottiglia quadrata contenente acqua.

Risciacquare gli embrioni da qualsiasi lievito in eccesso presente nella piastra con succo d'uva. Rimuovere la membrana corionica esterna immergendo gli embrioni in una soluzione di candeggina al 50% per due o tre minuti, oppure fino a quando gli embrioni galleggiano in superficie. Risciacquare accuratamente con acqua distillata e trasferire gli embrioni su un tovagliolo di carta.

Utilizzando una pinzetta, prendere l'inserzione a rete, che in questo momento dovrebbe essere ricoperta di embrioni rivestiti. Posizionare l'inserzione nel fissativo, permettendo agli embrioni di staccarsi dalla rete. Lasciare fissare gli embrioni per un'ora e mezza a quattro gradi Celsius, mescolando su un agitatore orbitale.

Una volta terminata l'incubazione, posizionare gli embrioni in una piastra di Petri rivestita con nastro adesivo doppio faccia, prelevando la minor quantità possibile di fissativo. Agitare la piastra per distribuire gli embrioni in un singolo strato, quindi posizionarla nella cappa chimica per permettere l'evaporazione dell'eptano. Una volta che gli embrioni si sono asciugati, coprirli con un buffer contenente 0,1% di tween hand de vize.

Embrioni allo stadio finale 16 sotto un microscopio stereoscopico con un ago di tungsteno smussato. Gli embrioni che sono stati fissati galleggiano e possono essere recuperati con una pipetta Pasteur; trasferire gli embrioni in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Lavare gli embrioni in tampone cacodilato 0,1 molare, quindi postfissarli in tetroxido di osmio al 1% per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, risciacquare gli embrioni con tampone Cate. Ancora una volta, disidratare gli embrioni mediante una serie progressiva di etanolo e acetone. Iniziare con etanolo al 50% per 10 minuti, seguito da etanolo al 70% per 10 minuti, quindi disidratare in acetone al 90% per 10 minuti e infine in acetone al 100% con passaggi di 10 minuti ciascuno.

Rimuovere l'acetone. Iniziare il processo di infiltrazione aggiungendo una miscela uno a uno di resina ein spray e acetone. Assicurarsi che il campione sia sotto pressione di vuoto e irradiare al microonde per tre minuti.

Mantenere la pressione sotto vuoto per ulteriori cinque minuti. Sostituire la miscela di resina e acetone con resina al 100% e irradiare nuovamente al microonde sotto pressione di vuoto. Sostituire la resina e irradiare al microonde sotto pressione.

Un'ultima volta, per un totale di tre passaggi di infiltrazione. Trasferire gli embrioni dal tubo microcentrifuga a uno stampo di inclusione in silicone. Allineare gli embrioni in una fila in modo che l'estremità posteriore dell'embrione sia allineata con il bordo affusolato dello stampo.

Far cuocere il bacon in forno a 70 gradi Celsius per tutta la notte. Successivamente, rimuovere il blocco risultante per la sezionatura. Utilizzare un microtomo per tagliare sezioni di un micrometro negli embrioni.

Dopo aver sezionato il blocco ed essersi avvicinati all'embrione, utilizzare un anello per trasferire un singolo taglio su un vetrino al fine di verificare se si è raggiunta la profondità corretta per la visualizzazione del cuore prima dell'osservazione. Riscaldare brevemente il taglio su una piastra riscaldata e colorare il campione con blu di metilene aggiungendo prima una goccia sul vetrino, quindi riscaldando brevemente.

Sciacquare nuovamente con acqua deionizzata ed esaminare la sezione al microscopio alla profondità desiderata. La cavità cardiaca deve essere riconoscibile al microscopio ottico per soddisfare i vincoli spaziali. Ridimensionare nuovamente il blocco in modo da includere al massimo cinque embrioni in sezione trasversale che mostrino il cuore embrionale.

Tagliare sezioni da 90 nanometri utilizzando il microtomo. Raccogliere più sezioni su una griglia di rame. Colorare la griglia con acetato al 3%al per 10 minuti, quindi risciacquare tre volte con acqua distillata.

Ora colorare la griglia con citrato di piombo per due minuti e mezzo in una camera contenente pellet di idrossido di sodio per creare un ambiente privo di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, lavare tre volte con acqua distillata. Esaminare le sezioni con un microscopio elettronico a 80 kilovolts e fotografare con una telecamera CCD.

Per determinare se la sezionatura e lo stadio sono stati eseguiti correttamente, si deve osservare chiaramente la formazione di una cavità cardiaca matura tra i due cordoni cardioblastici della linea mediana dorsale; per verificare l'integrità delle membrane cellulari, esaminare la cavità cardiaca alla ricerca della matrice extracellulare e cercare la presenza di desmosomi e mitocondri. Abbiamo quindi appena illustrato come determinare l'ultrastruttura del cuore embrionale di drosophila. Quando si esegue questa procedura.

È importante ricordare di stadiare correttamente gli embrioni di drosophila e misurare con precisione i componenti della resina, mescolandoli accuratamente. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.