Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

Questo video spiega come eseguire la microscopia elettronica a trasmissione, nota anche come TEM, sul carrello embrionale della drosophila. Il cuore è emerso come un prezioso sistema modello per lo studio della migrazione cellulare, dell'adesione cellulare e dei cambiamenti di forma cellulare. Questa tecnica consente la visualizzazione della forma del lume cardiaco, nonché dei componenti ultra strutturali come le membrane cellulari, le giunzioni cellulari e la membrana basale.

Per iniziare questa procedura, viene preparata una soluzione di fissazione appropriata per la microscopia elettronica a trasmissione di embrioni di drosofila. Successivamente, una raccolta da zero a 20 ore di embrioni rivestiti viene inserita nella soluzione di fissazione. Al termine, gli embrioni vengono rimossi dalla soluzione di fissazione e maneggiati mentre sono attaccati al nastro biadesivo.

In una capsula di Petri contenente tampone, gli embrioni deionizzati galleggiano nel tampone e vengono recuperati con una pipetta. Quindi gli embrioni vengono postfissi e subiscono un gradiente di disidratazione. Una volta infiltrati con la resina, vengono trasferiti in uno stampo da inclusione dove vengono allineati.

Il blocco risultante viene tagliato con un coltello diamantato. Le sezioni vengono prelevate su griglie di rame, colorate ed esaminate. Ciao, sono Nadine Lop del laboratorio di Sunita Kramer presso il Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio presso l'Università di Medicina e Odontoiatria del New Jersey presso la Robert Wood Johnson Medical School.

Sono Raj Patel. Sono il microscopista elettronico anche dal punto di vista della patologia PON. Oggi vi mostreremo una procedura per la preparazione e l'imaging di embrioni OPH per la microscopia elettronica a trasmissione.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la morfogenesi cardiaca di Drosophila. Quindi iniziamo. Inizia.

Prima di maneggiare gli embrioni di Drosophila, preparare la soluzione fissativa per il metodo di permeazione dell'eptano per la fissazione dell'embrione. In una cappa aspirante pipettare due millilitri di una soluzione appena preparata contenente il 12,5% di glutaraldeide in tampone Cate in una fiala di vetro a scintillazione. Aggiungere otto millilitri di eptano ADA e agitare energicamente.

Quindi attendi un minuto. Lasciando che le due fasi si separino, la fase superiore contiene l'eptano ADA, saturo di glutaraldeide, che è la soluzione fissativa. Pipettare la fase superiore in una fiala pulita e metterla da parte Per raccogliere embrioni da zero a 20 ore, utilizzare una camera di raccolta degli embrioni, che è un piccolo cestello con un inserto in rete rimovibile.

Inizia rimuovendo la piastra del succo d'uva contenente gli embrioni e rimuovi eventuali mosche morte. Quindi usando acqua e pennello. Staccare gli embrioni dalla piastra del succo d'uva, trasferire gli embrioni nella camera di raccolta degli embrioni utilizzando una bottiglia quadrata contenente acqua.

Sciacquare gli embrioni dal lievito in eccesso dalla piastra del succo d'uva. Rimuovere la membrana esterna del corion immergendo gli embrioni in una soluzione di candeggina al 50% per due o tre minuti o fino a quando gli embrioni non galleggiano in superficie. Sciacquare abbondantemente con acqua distillata e stendere gli embrioni su un tovagliolo di carta.

Usando una pinza, raccogli l'inserto della rete, che ora dovrebbe essere coperto con embrioni rivestiti. Posizionare l'inserto nel fissativo, lasciando che gli embrioni cadano dalla rete. Lasciare che gli embrioni si fissino per un'ora e mezza a quattro gradi Celsius mentre si mescolano su un bilanciere orbitale.

Una volta terminata l'incubazione, posizionare gli embrioni in una capsula di Petri rivestita con nastro biadesivo prelevando il meno possibile del fissativo. Agitare il piatto per distribuire gli embrioni in un unico strato, quindi posizionarlo nella cappa chimica per consentire all'eptano di evaporare. Una volta che gli embrioni si sono asciugati, coprirli con un tampone contenente lo 0,1% di devitalizzazione manuale.

Fase avanzata 16 embrioni al microscopio da dissezione con un ago di tungsteno smussato. Gli embrioni che sono stati izzati, galleggiano e possono essere recuperati con una pipetta da pascolo trasferiscono gli embrioni in un tubo micro fuge da 1,5 millilitri. Sciacquare gli embrioni in tampone catato molare 0,1 e poi postfissare in tetrossido di osmio all'1% per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, sciacquare gli embrioni con il tampone Cate. Ancora una volta, disidratare gli embrioni in una serie di gradi di etanolo e acetone. Inizia con il 50% di etanolo per 10 minuti, seguito dal 70% di etanolo per 10 minuti, quindi disidrata in acetone al 90% per 10 minuti e infine in fasi di acetone al 100% di 10 minuti ciascuna.

Rimuovere l'acetone. Inizia il processo di infiltrazione aggiungendo una miscela uno a uno di resina spray ein e acetone. Assicurarsi che il campione sia sotto vuoto, pressione e microonde per tre minuti.

Mantenere la pressione del vuoto per altri cinque minuti. Sostituire la miscela di resina acetone con resina al 100% e cuocere nuovamente a microonde sotto pressione. Sostituire la resina e il microonde sotto pressione.

Un'ultima volta per un totale di tre fasi di infiltrazione. Trasferisci gli embrioni dal tubo per microfughe a uno stampo per incorporamento in silicone. Allinea gli embrioni in una fila in modo tale che l'estremità posteriore dell'embrione si allinei con il bordo affusolato dello stampo.

La pancetta è a 70 gradi Celsius in forno durante la notte. Quindi rimuovere il blocco risultante per il sezionamento. Usa un microtomo per tagliare sezioni di un micrometro negli embrioni.

Una volta che il blocco è stato sezionato e l'embrione è stato raggiunto, utilizzare un anello per spostare una singola sezione su un vetrino per determinare se è stata raggiunta la profondità corretta per visualizzare il cuore prima della visualizzazione. Scaldare brevemente la sezione su una piastra calda e colorare la sezione con blu di metilene aggiungendo prima una goccia al vetrino. E poi riscaldando brevemente.

Ancora una volta, sciacquare con acqua deionizzata ed esaminare la sezione al microscopio alla profondità di sezionamento desiderata. Il lume cardiaco dovrebbe essere riconoscibile con un microscopio ottico per soddisfare i vincoli di spazio. Rifilare il blocco in modo da includere un massimo di cinque embrioni in sezione trasversale che mostrino il cuore embrionale.

Tagliare sezioni a 90 nanometri utilizzando il microtomo. Raccogli più sezioni su una griglia di rame. Colorare la griglia con acetato al 3% per 10 minuti, quindi risciacquare tre volte con acqua distillata.

Ora colorare la griglia con citrato di piombo per due minuti e mezzo in una camera contenente pellet di idrossido di sodio per creare un ambiente privo di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, sciacquare tre volte con acqua distillata. Esaminare le sezioni con un microscopio elettronico a 80 kilovolt e fotografare con una fotocamera CCD.

Al fine di determinare se la profondità di sezionamento e la stadiazione sono state eseguite correttamente, dovrebbe essere evidente che si è formato un lume cardiaco maturo tra i due blasti cardio della linea mediana dorsale per determinare se le membrane cellulari sono intatte, esaminare il lume cardiaco per la presenza di matrice extracellulare e cercare la presenza di Christie e mitocondri. Quindi ti abbiamo appena mostrato come determinare l'ultra struttura del cuore embrionale della drosophila. Quando si esegue questa procedura.

È importante ricordare di mettere in scena correttamente gli embrioni di drosofila e di misurare accuratamente i componenti della resina e mescolarli bene. Quindi grazie per aver guardato e buona fortuna con il tuo esperimento.