La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare l'espressione della proteina attivata dai mitogeni a livello di singola cellula. Per raggiungere questo obiettivo, è stato generato un ceppo di lievito recante il reporter di espressione fluorescente quadruplo di Venere controllato dal promotore STL one e specifico per l'attivazione della chinasi hog one map. L'espressione proteica fluorescente può essere quantificata sia mediante un saggio di microscopia su cellule vive in cui le cellule vengono sollecitate direttamente al microscopio per facilitare l'apparizione in tempo reale della fluorescenza sia mediante citometria a flusso, nel qual caso le cellule vengono stressate in un microtubo e la sintesi proteica viene bloccata in un dato momento.

Con l'aggiunta di cicloheide, solo poche cellule alla volta possono essere analizzate con la microscopia su cellule vive, ma il destino delle singole cellule può essere osservato direttamente e correlato con altre proprietà cellulari. La citometria a flusso, d'altra parte, consente anche la valutazione dell'espressione della proteina attivata dal mitogeno su un gran numero di cellule contemporaneamente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione, come ad esempio quali proteine sono coinvolte nella regolazione dell'espressione genica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla via del lievito, può anche essere applicato ad altre cascate di segnalazione a seconda della disponibilità dell'espressione corretta. Cronista.

Per preparare le cellule per la microscopia su cellule vive, iniziare inoculando cinque millilitri di terreno sintetico con lievito e poi far crescere le cellule a 30 gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva, misurare l'OD 600 della coltura notturna e quindi diluire la coltura notturna in cinque millilitri di terreno sintetico fino a un OD 600 di 0,05. Coltiva la coltura diluita a 30 gradi Celsius per almeno altre quattro ore.

Successivamente, filtrare circa 200 microlitri di soluzione di conna valente appena preparata nel vetrino del pozzetto. Dopo 30 minuti, togliere la soluzione di condensa e aggiungere 150 microlitri di acqua nel pozzo. Ora togliete l'acqua e lasciate asciugare il pozzetto mentre le celle sono preparate.

Misurare nuovamente l'OD 600 della coltura cellulare, quindi diluire le cellule per ottenere 300 microlitri di coltura cellulare con un OD 600 di 0,02 e una microprovetta da 1,5 millilitri. Sonicare le cellule a bagnomaria per 45 secondi. Agitare brevemente i microtubi e poi sonicare e far vorticare nuovamente le cellule.

Ora aggiungi 200 microlitri di cellule al vetrino del pozzetto, quindi dopo aver lasciato che la cellula si depositi sul fondo del pozzetto per circa 30 minuti, posiziona il vetrino sul microscopio. Quindi, selezionare le impostazioni di illuminazione per il canale fluorescente da registrare e per due immagini in campo chiaro, regolando una delle impostazioni del campo luminoso a circa tre micron sotto il piano focale per consentire una corretta segmentazione cellulare. Quindi impostare gli intervalli di tempo per le misurazioni time lapse e selezionare i campi visivi per l'imaging.

Ora inizia l'acquisizione per alcuni fotogrammi e poi metti in pausa l'acquisizione per aggiungere 100 microlitri di terreno di cloruro di sodio molare 0,6 appena preparato e riprendi l'imaging per preparare le cellule per la misurazione mediante citometria a flusso. Inizia inoculando il lievito in cinque millilitri di terreno sintetico e fai crescere le cellule durante la notte a 30 gradi Celsius. La mattina successiva, misurare l'OD 600 della coltura notturna e quindi diluire la sospensione cellulare in cinque millilitri di terreno sintetico fino a un OD 600 di 0,1.

Coltiva la coltura per almeno quattro ore a 30 gradi Celsius per raggiungere un OD 600 da 0,2 a 0,4. Quindi aggiungere 100 microlitri di cloruro di sodio molare da 0,6 molare appena preparato a una microprovetta da 1,5 millilitri per ogni punto temporale da misurare al tempo zero. Aggiungere 200 microlitri di cellule a ciascuna microprovetta e incubare le colture agitando a 30 gradi Celsius.

Quindi, in ciascuno dei punti temporali sperimentali, aggiungere 30 microlitri di cicloolio appena preparato a una delle microprovette. Durante l'incubazione delle microprovette, aggiungere 400 microlitri di PBS a una provetta fax corrispondente per ciascuna microprovetta. Dopo l'incubazione, agitare brevemente i microtubi e poi sonicare le cellule e aggiungere un bagno d'acqua per un minuto come appena dimostrato.

Quindi aggiungere 100 microlitri di coltura cellulare da ciascuna microprovetta al tubo fax corrispondente al flusso del citometro. Caricare le impostazioni di eccitazione e rilevamento corrette e testare i campioni non espressivi e completamente espressivi per verificare che rientrino nell'intervallo di sensibilità del rivelatore. Infine, misurando 10.000 cellule per ogni campione in queste immagini, le cellule di lievito recanti la proteina venosa quadrupla reporter di espressione sotto il controllo del promotore TL one e attaccate al fondo di un vetrino sono state stimolate mediante edizione diretta del mezzo di stress.

Come appena dimostrato, le cellule sono state monitorate per circa due ore a intervalli di 10 minuti e le immagini sono state acquisite sia prima che dopo l'edizione dello stimolo. Si noti l'espressione fluorescente del rapporto durante le cellule attivate. Per estrarre le informazioni quantitative contenute in queste immagini, è necessario eseguire un complesso processo di analisi delle immagini.

Vengono mostrati i risultati ottenuti con la piattaforma di analisi quantitativa del lievito. Ogni traccia rossa rappresenta l'evoluzione temporale dell'intensità media di fluorescenza di una singola cellula. La linea blu illustra la mediana di oltre 500 cellule che sono state segmentate e tracciate attraverso 20 fotogrammi di cinque filmati time lapse acquisiti da cinque diversi campi visivi dallo stesso pozzetto: l'area azzurra rappresenta il 25° e il 75° percentile di tutte le intensità misurate in un dato punto temporale per studiare la dinamica dell'espressione dello stesso reporter mediante citometria a flusso. La cicloesimide è stata aggiunta al lievito colture cellulari in diversi punti temporali a intervalli da cinque a 10 minuti.

Il farmaco blocca la sintesi di nuove proteine, ma la maturazione della proteina fluorescente già espressa non viene perturbata. Pertanto, l'espressione proteica visualizzata dallo spostamento dell'istogramma verso destra può essere quantificata al momento dell'edizione del Ciclo H aggirando i problemi associati alla maturazione delle proteine fluorescenti. In questo grafico, la dinamica del reporter di espressione misurata al microscopio o alla citometria a flusso viene confrontata mentre il segnale fluorescente sale da 30 a 40 minuti dopo l'edizione del mezzo di stress misurato al microscopio, le misurazioni della citometria a flusso indicano chiaramente che le proteine sono già prodotte tra 10 e 15 minuti dopo lo stimolo, dimostrando la lenta maturazione delle proteine fluorescenti.

Entrambe le tecniche consentono l'accesso alle informazioni sulle singole cellule per questi semplici esperimenti, la variabilità tra tre repliche biologiche è piccola rispetto alla grande variabilità osservata nelle risposte delle singole cellule mediante microscopia o citometria a flusso. Seguendo queste procedure, è possibile eseguire altri metodi come le misurazioni della risposta per rispondere a ulteriori domande, ad esempio qual è la soglia per l'espressione genica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'espressione proteica a livello di singola cellula con il microscopio della citometria a flusso.