La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole
4 ottobre 2013
Due metodi complementari basati sulla citometria di flusso e microscopia sono presentati che consentono la quantificazione, a livello di singola cellula, delle dinamiche di espressione genica indotte dall'attivazione di una via MAPK in lievito.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare l'espressione della proteina attivata dai mitogeni a livello di singola cellula. Per raggiungere questo obiettivo, è stato generato un ceppo di lievito recante il reporter di espressione fluorescente quadruplo di Venere controllato dal promotore STL one e specifico per l'attivazione della chinasi hog one map. L'espressione proteica fluorescente può essere quantificata sia mediante un saggio di microscopia su cellule vive in cui le cellule vengono sollecitate direttamente al microscopio per facilitare l'apparizione in tempo reale della fluorescenza sia mediante citometria a flusso, nel qual caso le cellule vengono stressate in un microtubo e la sintesi proteica viene bloccata in un dato momento.
Con l'aggiunta di cicloheide, solo poche cellule alla volta possono essere analizzate con la microscopia su cellule vive, ma il destino delle singole cellule può essere osservato direttamente e correlato con altre proprietà cellulari. La citometria a flusso, d'altra parte, consente anche la valutazione dell'espressione della proteina attivata dal mitogeno su un gran numero di cellule contemporaneamente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione, come ad esempio quali proteine sono coinvolte nella regolazione dell'espressione genica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla via del lievito, può anche essere applicato ad altre cascate di segnalazione a seconda della disponibilità dell'espressione corretta. Cronista.
Per preparare le cellule per la microscopia su cellule vive, iniziare inoculando cinque millilitri di terreno sintetico con lievito e poi far crescere le cellule a 30 gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva, misurare l'OD 600 della coltura notturna e quindi diluire la coltura notturna in cinque millilitri di terreno sintetico fino a un OD 600 di 0,05. Coltiva la coltura diluita a 30 gradi Celsius per almeno altre quattro ore.
Successivamente, filtrare circa 200 microlitri di soluzione di conna valente appena preparata nel vetrino del pozzetto. Dopo 30 minuti, togliere la soluzione di condensa e aggiungere 150 microlitri di acqua nel pozzo. Ora togliete l'acqua e lasciate asciugare il pozzetto mentre le celle sono preparate.
Misurare nuovamente l'OD 600 della coltura cellulare, quindi diluire le cellule per ottenere 300 microlitri di coltura cellulare con un OD 600 di 0,02 e una microprovetta da 1,5 millilitri. Sonicare le cellule a bagnomaria per 45 secondi. Agitare brevemente i microtubi e poi sonicare e far vorticare nuovamente le cellule.
Ora aggiungi 200 microlitri di cellule al vetrino del pozzetto, quindi dopo aver lasciato che la cellula si depositi sul fondo del pozzetto per circa 30 minuti, posiziona il vetrino sul microscopio. Quindi, selezionare le impostazioni di illuminazione per il canale fluorescente da registrare e per due immagini in campo chiaro, regolando una delle impostazioni del campo luminoso a circa tre micron sotto il piano focale per consentire una corretta segmentazione cellulare. Quindi impostare gli intervalli di tempo per le misurazioni time lapse e selezionare i campi visivi per l'imaging.
Ora inizia l'acquisizione per alcuni fotogrammi e poi metti in pausa l'acquisizione per aggiungere 100 microlitri di terreno di cloruro di sodio molare 0,6 appena preparato e riprendi l'imaging per preparare le cellule per la misurazione mediante citometria a flusso. Inizia inoculando il lievito in cinque millilitri di terreno sintetico e fai crescere le cellule durante la notte a 30 gradi Celsius. La mattina successiva, misurare l'OD 600 della coltura notturna e quindi diluire la sospensione cellulare in cinque millilitri di terreno sintetico fino a un OD 600 di 0,1.
Coltiva la coltura per almeno quattro ore a 30 gradi Celsius per raggiungere un OD 600 da 0,2 a 0,4. Quindi aggiungere 100 microlitri di cloruro di sodio molare da 0,6 molare appena preparato a una microprovetta da 1,5 millilitri per ogni punto temporale da misurare al tempo zero. Aggiungere 200 microlitri di cellule a ciascuna microprovetta e incubare le colture agitando a 30 gradi Celsius.
Quindi, in ciascuno dei punti temporali sperimentali, aggiungere 30 microlitri di cicloolio appena preparato a una delle microprovette. Durante l'incubazione delle microprovette, aggiungere 400 microlitri di PBS a una provetta fax corrispondente per ciascuna microprovetta. Dopo l'incubazione, agitare brevemente i microtubi e poi sonicare le cellule e aggiungere un bagno d'acqua per un minuto come appena dimostrato.
Quindi aggiungere 100 microlitri di coltura cellulare da ciascuna microprovetta al tubo fax corrispondente al flusso del citometro. Caricare le impostazioni di eccitazione e rilevamento corrette e testare i campioni non espressivi e completamente espressivi per verificare che rientrino nell'intervallo di sensibilità del rivelatore. Infine, misurando 10.000 cellule per ogni campione in queste immagini, le cellule di lievito recanti la proteina venosa quadrupla reporter di espressione sotto il controllo del promotore TL one e attaccate al fondo di un vetrino sono state stimolate mediante edizione diretta del mezzo di stress.
Come appena dimostrato, le cellule sono state monitorate per circa due ore a intervalli di 10 minuti e le immagini sono state acquisite sia prima che dopo l'edizione dello stimolo. Si noti l'espressione fluorescente del rapporto durante le cellule attivate. Per estrarre le informazioni quantitative contenute in queste immagini, è necessario eseguire un complesso processo di analisi delle immagini.
Vengono mostrati i risultati ottenuti con la piattaforma di analisi quantitativa del lievito. Ogni traccia rossa rappresenta l'evoluzione temporale dell'intensità media di fluorescenza di una singola cellula. La linea blu illustra la mediana di oltre 500 cellule che sono state segmentate e tracciate attraverso 20 fotogrammi di cinque filmati time lapse acquisiti da cinque diversi campi visivi dallo stesso pozzetto: l'area azzurra rappresenta il 25° e il 75° percentile di tutte le intensità misurate in un dato punto temporale per studiare la dinamica dell'espressione dello stesso reporter mediante citometria a flusso. La cicloesimide è stata aggiunta al lievito colture cellulari in diversi punti temporali a intervalli da cinque a 10 minuti.
Il farmaco blocca la sintesi di nuove proteine, ma la maturazione della proteina fluorescente già espressa non viene perturbata. Pertanto, l'espressione proteica visualizzata dallo spostamento dell'istogramma verso destra può essere quantificata al momento dell'edizione del Ciclo H aggirando i problemi associati alla maturazione delle proteine fluorescenti. In questo grafico, la dinamica del reporter di espressione misurata al microscopio o alla citometria a flusso viene confrontata mentre il segnale fluorescente sale da 30 a 40 minuti dopo l'edizione del mezzo di stress misurato al microscopio, le misurazioni della citometria a flusso indicano chiaramente che le proteine sono già prodotte tra 10 e 15 minuti dopo lo stimolo, dimostrando la lenta maturazione delle proteine fluorescenti.
Entrambe le tecniche consentono l'accesso alle informazioni sulle singole cellule per questi semplici esperimenti, la variabilità tra tre repliche biologiche è piccola rispetto alla grande variabilità osservata nelle risposte delle singole cellule mediante microscopia o citometria a flusso. Seguendo queste procedure, è possibile eseguire altri metodi come le misurazioni della risposta per rispondere a ulteriori domande, ad esempio qual è la soglia per l'espressione genica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'espressione proteica a livello di singola cellula con il microscopio della citometria a flusso.
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Panoramica
Questo studio presenta due metodi complementari per quantificare la dinamica dell'espressione genica a livello di singola cellula nei lieviti, concentrandosi specificamente sull'attivazione del percorso MAPK. Le tecniche utilizzate includono la microscopia di cellule vive e la citometria a flusso, ognuna delle quali offre vantaggi unici per l'osservazione dell'espressione proteica.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Trasduzione del segnale
- Espressione genica
Sfondo
- Le chinasi attivate da mitogeni (MAPK) svolgono un ruolo cruciale nella segnalazione cellulare.
- Comprendere la regolazione dell'espressione genica è essenziale per avere informazioni su vari processi biologici.
- Il lievito serve come organismo modello per studiare i percorsi MAPK.
- I reporter fluorescenti possono essere utilizzati per visualizzare i cambiamenti di espressione genica in tempo reale.
Obiettivo dello studio
- Quantificare l'espressione MAPK a livello di singola cellula nei lieviti.
- Confrontare l'efficacia della microscopia di cellule vive e della citometria a flusso nella misurazione dell'espressione genica.
- Investigare le proteine regolatorie coinvolte nella modulazione dell'espressione genica.
Metodi utilizzati
- Generazione di un ceppo di lievito con un reporter di espressione fluorescente.
- Microscopia di cellule vive per osservare la fluorescenza in tempo reale in cellule stressate.
- Citometria a flusso per analizzare grandi popolazioni di cellule.
- Uso di cicloesimide per bloccare la sintesi proteica in punti temporali specifici.
Risultati principali
- Entrambi i metodi hanno quantificato con successo la dinamica dell'espressione genica.
- La microscopia di cellule vive ha fornito approfondimenti dettagliati sul comportamento delle singole cellule.
- La citometria a flusso ha permesso l'analisi di grandi popolazioni cellulari.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei percorsi di segnalazione nei lieviti e potenzialmente in altri organismi.
Conclusioni
- Lo studio dimostra l'utilità di combinare microscopia e citometria a flusso per l'analisi dell'espressione genica.
- Le intuizioni acquisite possono informare la futura ricerca sui percorsi di segnalazione MAPK.
- Questi metodi possono essere adattati ad altre cascate di segnalazione con reporter appropriati.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantifying gene expression dynamics at single-cell resolution enables mechanistic de-risking of signaling pathway targets by revealing heterogeneity masked in bulk assays. This approach supports target validation and assay development in early discovery by providing quantitative, time-resolved readouts of pathway activation. The combination of microscopy and flow cytometry offers complementary scalability and phenotypic depth for predictive confidence in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking MAPK activation to single-cell reporter dynamics.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct correlation of stimulus timing with protein expression kinetics.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by distinguishing transient vs. sustained pathway activation across cell populations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Flow cytometry provides standardized, high-throughput quantification of expression dynamics across 10,000+ cells.
- Reproducibility: Cycloheximide-based pulse-chase design enables isolation of synthesis-dependent signals, reducing confounding from reporter maturation.
- Multiplex Potential: Microscopy supports spatial and temporal co-detection of multiple reporters for pathway crosstalk analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Yeast MAPK pathway conservation allows mechanistic insights transferable to mammalian stress-response signaling.
- Translational Continuity: Single-cell resolution aids in identifying subpopulation responses relevant to fractional drug effects.
- Preclinical Modeling: Enables de-risking of targets by quantifying expression noise and response thresholds in isogenic systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis screening to lead optimization, where dynamic pathway modulation informs structure-activity relationships.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how genetic or pharmacological perturbations alter MAPK-driven expression timing and amplitude.
- Screening: Enables assay standardization through flow cytometry’s ability to generate population-level dynamics with single-cell sensitivity.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables (fluorescence intensity over time) that support statistical comparison of conditions and replicates.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a disease-relevant system for studying conserved signaling nodes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating kinase modulator effects across signaling cascades with appropriate reporters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving cell-to-cell variability in pathway activation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable readouts compatible with automation-friendly workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing activation thresholds and response heterogeneity early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on quantitative, dynamic target engagement metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, fluorescent reporter design, and microfluidic or microscopy-based stress delivery.
- Dependent on access to live-cell imaging systems and flow cytometers with compatible excitation/detection settings for Venus-derived reporters.
- Necessitates standardized protocols for stress induction (e.g., osmolarity shift) and translational arrest (e.g., cycloheximide) to ensure temporal precision.
- Adaptation to mammalian systems requires validation of promoter-reporter orthogonality and stress-response conservation.
- Practical limitations include reporter maturation kinetics affecting real-time accuracy in microscopy, mitigated by flow cytometry pulse-chase designs.
