Name: La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Impara a quantificare l'espressione MAPK a livello di singola cellula nel lievito utilizzando microscopia a cellule vive e citometria a flusso. Questi metodi permettono di analizzare la dinamica dell'espressione genica in tempo reale.

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Gli autori ringraziano Matthias Peter e il suo gruppo presso l&#39;Istituto di Biochimica presso l&#39;ETH di Zurigo, dove sono stati sviluppati questi metodi. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation svizzero.

1. Misure Microscopia <ol><li> Inoculare 5 ml di terreno sintetico con il lievito. </li><li> Crescere le cellule a 30 ° C per una notte. </li><li> Misurare il diametro esterno 600 della cultura durante la notte la mattina successiva. </li><li> Diluire cultura durante la notte in mezzo sintetico 5 ml di OD 600 0.05. </li><li> Far crescere la cultura diluito a 30 ° C per almeno 4 ore. </li><li> Preparare 3 volte concentrato (0,6 M) soluzione di NaCl in terreno sintetico. </li><li> Preparare una soluzione 1 mg / ml di Concanavalina A (ConA) in PBS. </li><li> Filtrato ~ 200 ml di soluzione di ConA nella diapositiva bene. </li><li> Lasciate riposare per 30 min. </li><li> Rimuovere la soluzione ConA. </li><li> Aggiungere 150 microlitri H 2 O al pozzo. </li><li> Rimuovere H 2 O. </li><li> Misurare OD 600 di coltura cellulare. </li><li> Preparare 300 ml di coltura cellulare a OD 600 = 0,02 in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Sonicare le cellule in un bagno di acqua per 45 sec. </li><li> Vortex brevemente la microtube. </li><li> Sonicare le cellule in un bagno di acqua per 45 sec. </li><li> Vortex brevemente la provetta. </li><li> Aggiungere 200 ml di coltura cellulare al pozzo. </li><li> Attendere 30 minuti per consentire le cellule si depositano sul fondo del pozzo. </li><li> Posizionare il vetrino bene sul microscopio. </li><li> Selezionare le impostazioni di illuminazione per il canale fluorescente da registrare. </li><li> Selezionare le impostazioni di illuminazione per due immagini in campo chiaro (uno leggermente fuori fuoco: 3 micron sotto il piano focale per permettere una corretta segmentazione delle cellule). </li><li> Selezionare gli intervalli di tempo per la misurazione time-lapse </li><li> Selezionare i campi di vista di immagine. </li><li> Avviare l&#39;acquisizione di alcuni fotogrammi. </li><li> Pausa l&#39;acquisizione di aggiungere 100 ml di 0,6 M NaCl medie. </li><li> Riprendere immagini. </li></ol> 2. Misure Citometria a flusso <ol><li> Inoculare 5 ml di terreno sintetico con il lievito. </li><li> Coltivare a 30 ° C durante la notte. </li><li> Misural&#39;OD 600 della cultura durante la notte la mattina successiva. </li><li> Diluire cultura durante la notte in mezzo sintetico 5 ml di OD 600 0.1. </li><li> Coltivare a 30 ° C per almeno 4 ore per raggiungere un OD 600 di 0,2-0,4. </li><li> Preparare la soluzione cycloheximide 1 mg / ml in H 2 O. </li><li> Preparare 3 volte concentrato (0,6 M) soluzione di NaCl in terreno sintetico. </li><li> Preparare una provetta da 1,5 ml con 100 ml di 0,6 M NaCl medio per ciascun punto di tempo da misurare. </li><li> Al tempo 0, aggiungere 200 ml di coltura cellulare per ogni provetta. </li><li> Incubare con agitazione a 30 ° C. </li><li> Al tempo T, aggiungere 30 microlitri cycloheximide a una provetta. </li><li> Ripetere passo 2.11 per tutti i punti di tempo desiderati. </li><li> Incubare tutte microtubi per almeno 45 minuti e fino a 3 ore a 30 ° C con agitazione. </li><li> Preparare tubi FACS con 400 microlitri di PBS. </li><li> Sonicare le cellule in bagnomaria per 1 min. </li><li> Vortex brevemente i microtubi. </li><li> Figlioicate le cellule in bagnomaria per 1 min. </li><li> Vortex brevemente i microtubi. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di coltura cellulare da ciascuna provetta al corrispondente tubo FACS. </li><li> Selezionare il laser di eccitazione 488 nm e 530/30 filtro passa-banda nm per il rilevamento. </li><li> Test di non esprimere e di esprimere appieno esempio per verificare se rientrano nel campo di sensibilità del rivelatore. </li><li> Misurare 10.000 cellule per ogni campione acquisito. </li></ol>

<ol><li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li>
<li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Wu, J. -Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li>
<li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li>
<li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li>
<li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
<li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18(2008).</li>
<li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li>
<li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li>
<li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Microscopia Il trattamento del pozzetto con ConA è un passo essenziale per assicurare una corretta rappresentazione delle cellule. Poiché ConA ha una bassa solubilità in PBS (5 mg / ml), il processo di filtrazione permette la rimozione di grandi aggregati che sono presenti nella soluzione filtrata e interferiscono con l&#39;imaging. Cellule attribuiscono relativamente fortemente alla superficie trattata e l&#39;aggiunta della soluzione indurre non dovrebbero disturbare la localizzazione delle c...

Segnalazione via cascate di trasduzione spesso culmina nella espressione di proteine. La caratterizzazione di questo profilo di espressione è un elemento chiave per comprendere la funzione di percorsi biologici. L&#39;identificazione dello spettro di up-regolata proteine ​​e le dinamiche della loro attivazione può essere ottenuto attraverso diverse tecniche come micro-array, Northern blot o western blot 1-3. Tuttavia, queste tecniche media la risposta di un&#39;intera popolazione di cellule. Per comprendere la regolazione fine della espressione delle proteine, è desiderabile raccogliere misurazioni a livello di singola cellula. Idealmente, queste misure dovrebbero anche fornire dati quantitativi suscettibili di sviluppare modelli matematici della via sottostante. Microscopia e citometria a flusso sono due tecniche, che sono ideali per fornire tali misurazioni quantitative singola cellula. La codifica endogena di proteine ​​con una proteina fluorescente può be utilizzato per quantificare il loro livello di espressione 4. Tuttavia, dato che l&#39;aggiunta di una grande porzione fluorescente al terminale della proteina può renderlo non funzionale, è spesso più desiderabile generare specifici reporter di espressione basati su un promotore guida l&#39;espressione di un costrutto fluorescente. Questa proteina giornalista è esogeno al sistema cellulare e quindi non influenza gli eventi di segnalazione che stanno avvenendo nella cella. Sia microscopia e citometria a flusso sono stati ampiamente utilizzati in campo segnalamento lievito. Come esempi; collaboratori Colman-Lerner e correlati, in singole cellule, l&#39;espressione di accoppiamento reporter specifici e costitutivamente espresse mediante microscopia a quantificare il rumore nel lievito accoppiamento trasduzione del segnale cascata 5, Acar e colleghi flusso citometria utilizzati per studiare la rete di regolamentazione controllo dell&#39;espressione dei geni GAL 6. In uno studio precedente 7, abbiamo utilizzato una combinatisu queste due tecniche per studiare l&#39;espressione uscita dal glicerolo alta osmolarità (HOG) percorso in erba lievito. Questo mitogen proteina chinasi attivata (MAPK) è innescato da stress iper-osmotico. Esso determina l&#39;attivazione dei Hog1 MAPK, che trasloca nel nucleo della cellula per indurre un programma trascrizionale conseguente espressione di circa 300 geni. Per studiare questo processo, abbiamo costruito un reporter espressione basato sul promotore STL1 (un gene indotto specificamente in risposta all&#39;attività Hog1 8) che guida l&#39;espressione di una proteina fluorescente Venus quadrupla (p STL1-qv). Citofluorimetria misurazioni scoperto la presenza di due popolazioni di cellule a livello di stress intermedio (0.1 M NaCl) con solo una frazione della popolazione che esprime il reporter fluorescente. Abbiamo usato la microscopia di approfondire questo comportamento e abbiamo scoperto che questo rumore di espressione della proteina è stata governata da fattori intrinseci 9. Noi could osservano inoltre che le cellule con un analogo livello di attività Hog1 possono visualizzare profondamente diversi esiti di espressione. La combinazione di queste due tecniche ha permesso di dimostrare come la lenta ristrutturazione dei geni di risposta allo stress ha influenzato l&#39;esito espressione a livello di singola cellula 7. In questo lavoro, usiamo l&#39;espressione della p STL1-qV giornalista indotta dallo shock iper-osmotico come un esempio della quantificazione dell&#39;espressione proteica mediante microscopia e citometria a flusso. Lo stesso ceppo sottoposto a 0,2 M NaCl sforzo è stato studiato con entrambe le tecniche. Questo ci permetterà di evidenziare alcune differenze fondamentali in queste due tecniche altamente complementari.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen</td><td></td><td></td> Base PerMedium CYN6202 <td></td></tr><tr><td>CSM miscela di aminoacidi</td><td>PerMedium</td><td>DCS0011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0450-01</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Fluka Aldrich Sigma</td><td>C7698</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>ySP9</td><td></td><td></td><td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus</td></tr><tr><td>pSP34</td><td></td><td></td><td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruplo V enus</td></tr><tr><td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>Software di controllo del microscopio</td><td>Micro-manager</td><td>Ver 1.4.11</td><td></td></tr><tr><td>Camera di incubazione</td><td>LIS</td><td>The Box</td><td></td></tr><tr><td>Luce a fluorescenza fonte</td><td>Lumencor</td><td>SpectraX</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Citometro</td><td>a flusso BD</td><td>FACS calibur</td><td></td></tr><tr><td>Bagno sonicatore</td><td>Telesonic</td><td>TUC-150</td><td></td></tr> <tr><td>Thermo Lab-tek</td> a<td>8 pozzetti </td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti</td><td>bioscienze matrici</td><td>MGB096-1-2-LG</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubo rigido</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr></tbody></table>

la quantificazione temporale di espressione mapk indotta in cellule di lievito singole

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

La quantificazione dell&#39;espressione genica a livello di singola cellula svela nuovi meccanismi di regolamentazione oscurate nelle misurazioni effettuate a livello di popolazione. Due metodi basati sulla microscopia e citometria a flusso sono presentati per illustrare come tali dati possono essere acquisiti. L&#39;espressione di un reporter fluorescente indotto all&#39;attivazione della elevata osmolarità glicerolo MAPK in lievito è usato come esempio. I vantaggi specifici di ciascun metodo sono evidenziati. Flusso misura citometria un gran numero di cellule (10.000) e fornisce una misura diretta delle dinamiche di espressione proteica indipendente delle lenti cinetica di maturazione della proteina fluorescente. Imaging di cellule viventi mediante microscopia è invece limitato alla misura della forma maturato del reporter in meno cellule. Tuttavia, le serie di dati generati da questa tecnica possono essere estremamente ricco grazie alle combinazioni di reporter multipli e alle informazioni spaziale e temporaleottenuto da cellule singole. La combinazione di questi due metodi di misurazione in grado di fornire nuove intuizioni sulla regolazione dell&#39;espressione proteica mediante vie di segnalazione.

Microscopia Le cellule di lievito recanti l&#39;espressione giornalista STL1 p-q V (ySP9 7) sono stati attaccati al fondo del pozzo scorrevole e posti sotto il microscopio. Le cellule sono state stimolate con l&#39;aggiunta di mezzo sollecitazioni direttamente nel pozzo nel corso della sessione di imaging. Questo ci permette di acquisire alcune immagini delle cellule prima dell&#39;induzione percorso e seguiamo il loro destino dopo la stimolazione. Nella fattispecie, le cell...

Due metodi complementari basati sulla citometria di flusso e microscopia sono presentati che consentono la quantificazione, a livello di singola cellula, delle dinamiche di espressione genica indotte dall&#39;attivazione di una via MAPK in lievito.

La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare l'espressione della proteina attivata da mitogeni a livello singola cellula. A tale scopo, è stato generato un ceppo di lievito portatore di un reporter fluorescente di espressione, il quadruplo Venus, controllato dal promotore STL1 e specifico per l'attivazione della chinasi mitogenica hog1. L'espressione della proteina fluorescente può essere quantificata mediante un saggio di microscopia su cellule vive, in cui le cellule vengono sottoposte a stress direttamente al microscopio per facilitare l'insorgenza in tempo reale della fluorescenza, oppure mediante citometria a flusso, nel qual caso le cellule vengono sottoposte a stress in una provetta microcentrifuga e la sintesi proteica viene bloccata in un determinato momento.Con l'aggiunta di ciclo eide, solo poche cellule alla volta possono essere analizzate mediante microscopia su cellule vive, ma il destino delle singole cellule può essere osservato direttamente e correlato ad altre proprietà cellulari. La citometria a flusso, invece, consente anche la valutazione dell'espressione delle proteine attivate dal mitogeno su un elevato numero di cellule contemporaneamente. Qu

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