La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare l'espressione della proteina attivata da mitogeni a livello singola cellula. A tale scopo, è stato generato un ceppo di lievito portatore di un reporter fluorescente di espressione, il quadruplo Venus, controllato dal promotore STL1 e specifico per l'attivazione della chinasi mitogenica hog1. L'espressione della proteina fluorescente può essere quantificata mediante un saggio di microscopia su cellule vive, in cui le cellule vengono sottoposte a stress direttamente al microscopio per facilitare l'insorgenza in tempo reale della fluorescenza, oppure mediante citometria a flusso, nel qual caso le cellule vengono sottoposte a stress in una provetta microcentrifuga e la sintesi proteica viene bloccata in un determinato momento.

Con l'aggiunta di ciclo eide, solo poche cellule alla volta possono essere analizzate mediante microscopia su cellule vive, ma il destino delle singole cellule può essere osservato direttamente e correlato ad altre proprietà cellulari. La citometria a flusso, invece, consente anche la valutazione dell'espressione delle proteine attivate dal mitogeno su un elevato numero di cellule contemporaneamente. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della trasduzione del segnale, come ad esempio quali proteine sono coinvolte nella regolazione dell'espressione genica. Sebbene questo approccio possa fornire informazioni sul percorso del lievito, può essere applicato anche ad altre cascate di segnalazione, a seconda della disponibilità del reporter di espressione appropriato.

Per preparare le cellule per la microscopia su cellule vive, iniziare inoculando cinque millilitri di mezzo sintetico con lievito, quindi far crescere le cellule a 30 gradi Celsius per tutta la notte. La mattina seguente, misurare l'OD 600 della coltura notturna, quindi diluire la coltura notturna in cinque millilitri di mezzo sintetico fino a un OD 600 di 0,05. Far crescere la coltura diluita a 30 gradi Celsius per almeno altre quattro ore.

Successivamente, filtrare circa 200 microlitri di una soluzione covalente appena preparata nel pozzetto del vetrino. Dopo 30 minuti, rimuovere la soluzione covalente e aggiungere 150 microlitri di acqua nel pozzetto. A questo punto, rimuovere l'acqua e lasciare asciugare il pozzetto mentre si preparano le cellule.

Misurare nuovamente l'OD 600 della coltura cellulare, quindi diluire le cellule per ottenere 300 microlitri di coltura cellulare con un OD 600 pari a 0.02 in un microtubo da 1,5 millilitri. Sonicare le cellule in un bagno ad ultrasuoni per 45 secondi. Vortexare brevemente i microtubi, quindi sottoporre nuovamente le cellule a sonicazione e vortex.

Ora aggiungere 200 microlitri di cellule nel pozzetto della lamellina e, dopo aver lasciato sedimentare le cellule sul fondo del pozzetto per circa 30 minuti, posizionare la lamellina sul microscopio. Successivamente, selezionare le impostazioni di illuminazione per il canale fluorescente da registrare e per due immagini in campo chiaro, regolando una delle impostazioni in campo chiaro a circa tre micron al di sotto del piano focale per consentire una corretta segmentazione delle cellule. Impostare quindi gli intervalli temporali per le misurazioni in time lapse e selezionare i campi visivi per l'acquisizione delle immagini.

Ora avviare l'acquisizione per alcuni fotogrammi, quindi mettere in pausa l'acquisizione per aggiungere 100 microlitri di mezzo di cloruro di sodio 0,6 molare appena preparato e riprendere l'acquisizione delle immagini per preparare le cellule alla misurazione mediante citometria a flusso. Iniziare inoculando il lievito in cinque millilitri di mezzo sintetico e coltivare le cellule per tutta la notte a 30 gradi Celsius. La mattina successiva, misurare l'OD 600 della coltura notturna, quindi diluire il sospensione cellulare in cinque millilitri di mezzo sintetico fino a un OD 600 di 0,1.

Coltivare la coltura per almeno quattro ore a 30 gradi Celsius per raggiungere un OD 600 compreso tra 0,2 e 0,4. Quindi aggiungere 100 microlitri di cloruro di sodio 0,6 molare appena preparato in un microtubo da 1,5 millilitri per ciascun punto temporale da misurare al tempo zero. Aggiungere 200 microlitri di cellule in ciascun microtubo e incubare le colture con agitazione a 30 gradi Celsius.

Quindi, in corrispondenza di ciascun punto temporale sperimentale, aggiungere 30 microlitri di cyclo heide appena preparato in uno dei microtubi. Mentre i microtubi sono in incubazione, aggiungere 400 microlitri di PBS in un tubo fax corrispondente per ciascun microtubo. Al termine dell'incubazione, vortexare brevemente i microtubi, quindi sonificare le cellule in bagno d'acqua per un minuto, come appena dimostrato.

Quindi aggiungere 100 microlitri di coltura cellulare da ciascuna microprovetta alla provetta FACS corrispondente nel citometro a flusso. Impostare correttamente le condizioni di eccitazione e rilevamento e analizzare i campioni non esprimenti e completamente esprimenti per verificare che rientrino nell'intervallo di sensibilità del rilevatore. Infine, misurare 10.000 cellule per ciascun campione in queste immagini; le cellule di lievito portatrici del reporter di espressione della proteina quadrupla venosa sotto il controllo del promotore TL1 e aderenti al fondo di una camera da microscopia sono state stimolate mediante aggiunta diretta di mezzo da stress.

Come appena dimostrato, le cellule sono state monitorate per circa due ore a intervalli di 10 minuti, e le immagini sono state acquisite sia prima che dopo l'applicazione dello stimolo. Si noti l'espressione fluorescente del reporter nelle cellule attivate. Per estrarre le informazioni quantitative contenute in queste immagini, è necessario eseguire qui un complesso processo di analisi delle immagini.

I risultati ottenuti con la piattaforma di analisi quantitativa del lievito sono mostrati. Ogni traccia rossa rappresenta l'evoluzione temporale dell'intensità media della fluorescenza di una singola cellula. La linea blu illustra la mediana di più di 500 cellule segmentate e tracciate per tutta la durata di 20 fotogrammi di cinque filmati a intervalli di tempo acquisiti da cinque campi diversi della stessa pozzetta; l'area celeste rappresenta il 25° e il 75° percentile di tutte le intensità misurate in un determinato punto temporale. Per studiare la dinamica dell'espressione dello stesso reporter mediante citometria a flusso, il cicloesimide è stato aggiunto alle colture cellulari di lievito in diversi punti temporali a intervalli di cinque-dieci minuti.

Il farmaco blocca la sintesi di nuove proteine, ma la maturazione della proteina fluorescente già espressa non viene perturbata. Pertanto, l'espressione proteica visualizzata mediante lo spostamento dell'istogramma verso destra può essere quantificata al momento della modifica di Cycl H, aggirando i problemi associati alla maturazione della proteina fluorescente. In questo grafico, si confrontano le dinamiche del reporter di espressione misurate mediante microscopia o citometria a flusso: mentre il segnale fluorescente aumenta da 30 a 40 minuti dopo la sostituzione del mezzo di stress, come rilevato dalla microscopia, le misurazioni di citometria a flusso indicano chiaramente che le proteine vengono già prodotte tra 10 e 15 minuti dopo lo stimolo, dimostrando la lenta maturazione delle proteine fluorescenti.

Entrambe le tecniche consentono di ottenere informazioni a livello di singola cellula per questi semplici esperimenti; la variabilità tra tre repliche biologiche è ridotta rispetto alla grande variabilità osservata nelle risposte delle singole cellule mediante microscopia o citometria a flusso. Seguendo queste procedure, è possibile eseguire altri metodi come queste misurazioni di risposta per rispondere a ulteriori domande, ad esempio qual è la soglia per l'espressione genica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare l'espressione proteica a livello di singola cellula mediante microscopio o citometria a flusso.